布魯菌病的危害與防控

布魯菌病的危害與防控

病毒：由于柳綠菌（cell）的屬細(xì)菌，世界上流行的人畜共病的感染。近年來,隨著科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展,對畜間布魯菌病的研究越來越細(xì)致。國內(nèi)外諸多學(xué)者對布魯菌病的細(xì)菌學(xué)、病原學(xué)、血清學(xué)診斷等方面做了大量的工作,尤其是布魯菌病的檢測診斷研究已從傳統(tǒng)方法發(fā)展到分子和基因技術(shù)水平。本文概述了近年來畜間布魯菌病檢測診斷方法的研究進展。1布魯生物一種致病性的動物布魯菌屬于兼性胞內(nèi)寄生的革蘭陰性球桿菌或短桿菌,不形成芽孢和莢膜,偶爾有類似莢膜樣結(jié)構(gòu),不運動,但帶有與鞭毛合成相關(guān)的基因,是在嚴(yán)格厭氧條件下不生長的需氧菌。目前,已經(jīng)確認(rèn)布魯菌有10個種,其中對陸生動物具有致病性的有6個種20個生物型,即羊種布魯菌(又稱馬耳他布魯菌,B.meltensis)、牛種布魯菌(又稱流產(chǎn)布魯菌,B.abortus)、豬種布魯菌(B.suis)、綿羊附睪種布魯菌(B.ovis)、犬種布魯菌(B.canis)和沙林鼠種布魯菌(B.neotomae);對海洋動物具有致病性的有2個種,即鰭腳目種布魯菌(B.pinnipedialis)和鯨魚種布魯菌(B.ceti);此外,近年又有2個新的布魯菌種被發(fā)現(xiàn)和鑒定,分別是田鼠種布魯菌(B.microti)和小云雀種布魯菌(B.inopinata)。布魯菌菌株的命名主要依據(jù)其優(yōu)先感染的宿主動物。2布魯菌病的感染對象及危害家畜感染布魯菌后,妊娠母畜最常出現(xiàn)的癥狀是流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或弱胎、早產(chǎn),通常在懷孕后2~3個月內(nèi)出現(xiàn)胎兒死亡或子宮炎癥。哺乳期母畜感染后,產(chǎn)奶量會顯著下降。公畜感染后出現(xiàn)睪丸炎、附睪炎、生育能力下降等癥狀。某些職業(yè)的從業(yè)者,如飼養(yǎng)員、獸醫(yī)、屠宰工、肉制品包裝工人、皮毛收購人及獸醫(yī)實驗室工作人員等都是感染布魯菌病的高危人群。國外的一些報道認(rèn)為,人類布魯菌病主要是由人食用布魯菌污染的奶和奶制品引起;然而國內(nèi)的人布魯菌病則主要是通過接觸感染動物或是污染動物產(chǎn)品而引起,尤其是接觸患病動物的分泌物、排泄物、流產(chǎn)物等。此外,人與人之間的布魯菌病傳播是極其罕見的,雖有報道認(rèn)為,哺乳期內(nèi)的母親可以感染嬰兒,也可以通過性傳播,但這些說法還存在爭議。3檢測診斷方法3.1細(xì)菌學(xué)3.1.1細(xì)菌培養(yǎng)方法新鮮病料可用胰蛋白胨瓊脂平板或血液瓊脂斜面、肝湯瓊脂斜面等培養(yǎng)基培養(yǎng)。若為陳舊病料或污染病料,可用選擇性培養(yǎng)基(如加有放線菌酮、桿菌肽、多黏菌素和色素的瓊脂平板)培養(yǎng)。將細(xì)菌置含5%~10%CO2的環(huán)境中于37℃培養(yǎng)7~10d,然后進行菌落特征檢查。如果病料被污染或含菌量極少時,可將病料用生理鹽水稀釋5~10倍,健康豚鼠腹腔內(nèi)注射0.1~0.3mL/只,或接種于豚鼠股內(nèi)側(cè)皮下,接種后4~8周撲殺豚鼠,取肝臟、脾臟分離培養(yǎng)布魯菌。對該菌進行革蘭染色、菌落形態(tài)、生長特性、尿酶活性、氧化酶活性及抗布魯菌光滑型或粗糙型因子血清的凝集測試等。雖然細(xì)菌培養(yǎng)的方法具有高特異性,但還存在一些缺點,如細(xì)菌生長緩慢、培養(yǎng)周期長、敏感性低、檢測結(jié)果有較大誤差等。因此,細(xì)菌培養(yǎng)在畜間布魯菌病的檢測中逐漸被淘汰,已不被用于獸醫(yī)臨床的快速檢測。3.1.2柯茲羅夫斯基染色法布魯菌是一種革蘭陰性細(xì)菌,可以抵抗弱酸性處理,并在復(fù)染之后顯示為紅色。通常采集家畜流產(chǎn)胎衣、絨毛膜水腫液、肝臟、脾臟、淋巴結(jié)、胎兒等組織制成抹片,用柯茲羅夫斯基染色法染色,鏡下觀察布魯菌為紅色球桿狀小桿菌,而其他菌呈綠色或藍色。由于該方法可以在第一時間分析流產(chǎn)材料,因此在生產(chǎn)實踐中依然經(jīng)常使用。但由于某些致流產(chǎn)性病原(如流產(chǎn)衣原體、貝氏立克次氏體等)也能被染成紅色,因而該方法缺乏特異性。3.2血液清學(xué)方法3.2.1簡易檢測方法此試驗因檢測速度較快成為20世紀(jì)初畜間布魯菌病檢疫和人群中流行病學(xué)快速初篩的一種簡易檢測方法。所用抗原為高濃度菌液,置于高濃度鹽水中,以結(jié)晶紫和孔雀綠染料染色菌體而成,較試管凝集試驗(SAT)敏感,且特異性較高,但也可出現(xiàn)非特異性凝集。3.2.2基于rbpt方法的敏感血又稱板式孟加拉紅試驗,該方法在國際貿(mào)易中是牛、羊、豬種布魯菌病的指定試驗。由標(biāo)準(zhǔn)血清標(biāo)化pH值為3.6~3.9的高濃度菌液,以琥紅染料(四氯四碘熒光素鈉鹽)染色菌體,主要特點是該抗原與被檢血清作用時能抑制血清中的IgM類抗體的凝集活性,檢查出的抗體是IgG類,因此提高了該方法的特異性。RBPT方法具有較高的特異性和敏感性,結(jié)果可靠,簡便易行,成本低廉,主要用于畜間布魯菌病的初篩,尤其適用于畜間布魯菌病大面積監(jiān)測檢疫及流行病學(xué)調(diào)查,但不能鑒別人工免疫和自然感染。由于RBPT的特異性相對于SAT和補體結(jié)合試驗(CFT)低,且易受環(huán)境溫度和凝集時間的影響,不易準(zhǔn)確判定結(jié)果,故對RB-PT的陽性者還必須經(jīng)SAT或CFT檢測為陽性時才能最終判定為陽性。3.2.3在免疫客觀檢測方面的應(yīng)用該方法是我國畜間布魯菌病診斷的法定正式試驗,因其檢測IgM的敏感性較高,可作為布魯菌病的早期診斷,同時也可用于畜間布魯菌菌苗免疫后血清抗體的檢測。其操作簡便,結(jié)果判定容易,具有較高診斷價值,但單獨使用時特異性較差,不能區(qū)分人工免疫和自然感染。由于部分感染動物的抗體效價達不到診斷水平,也易造成誤診和漏診。此外,SAT方法的敏感性和特異性相對較差,且相對費時,不適合現(xiàn)場采用,在發(fā)達國家已基本停止使用。3.2.4cft結(jié)合多種試劑該方法是牛、羊及綿羊種布魯菌病國際貿(mào)易指定試驗,是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)認(rèn)證的布魯菌病的確診性試驗。該方法的原理是補體能與任何抗原抗體復(fù)合物結(jié)合,但不能同單獨的抗原或抗體結(jié)合。CFT檢測的是能夠激活補體反應(yīng)的免疫球蛋白,對牛來說為IgM和IgG。該方法被認(rèn)為是目前血清學(xué)試驗中最為準(zhǔn)確的技術(shù)之一,并得到了廣泛應(yīng)用,但CFT需大量不同試劑及各種各樣的對照品,試驗步驟繁多、條件復(fù)雜苛刻,結(jié)論也具有主觀性,且不能鑒別人工免疫和自然感染,不宜向基層推廣及進行現(xiàn)場檢測。此外,由于豬的補體會干擾豚鼠補體,導(dǎo)致試驗的敏感性降低38%~40%,因而CFT不適合豬種布魯菌病的檢測。3.2.5通過結(jié)果檢測乳脂環(huán)MRT主要用于篩查泌乳動物布魯菌病,是以染色的布魯菌全菌作為診斷抗原,用其檢測混合奶樣,當(dāng)存在布魯菌抗體時,紅色的抗原抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移到乳脂層,形成有色乳脂環(huán)。該試驗具有操作簡便、快速、易行的特點,適于現(xiàn)場應(yīng)用,結(jié)果可靠,準(zhǔn)確性高,還可以克服采血造成的不利。該方法不僅適用于個體乳樣的檢測,也適用于混合乳樣的檢測。但在進行大畜群布魯菌病監(jiān)測時可靠性較差,并且對羊種布魯菌敏感性較低。對免疫不到4個月動物的乳樣、初乳、接近干奶期的乳汁、奶牛發(fā)情盛期及因患乳房炎而產(chǎn)生的乳樣進行檢測時,都有可能發(fā)生假阻性反應(yīng)。OIE規(guī)定MRT僅用于奶牛乳樣檢測。3.2.6半胱氨酸對igg抗體活性的影響半胱氨酸含有硫氫基(HS-)成分,能使大分子IgM抗體雙硫鍵遭到破壞而失去凝集活性,但不能使小分子IgG抗體分解,故應(yīng)用半胱氨酸處理后的血清反應(yīng)主要為IgG抗體活性,與CFT所得抗體活性一致。該試驗簡便、易于操作、定性準(zhǔn)確,可在現(xiàn)場進行,故可代替CFT診斷奶牛布魯菌病,且可鑒別畜間布魯菌病的人工免疫和自然感染。3.2.7布魯菌抗體檢測ELISA是一種新型的快速檢測技術(shù),常用的方法有:1)間接法。多用于檢測抗體,本質(zhì)是抗球蛋白試驗,但不能分辨出接種牛種布魯菌S19或羊種Rev1疫苗與自然感染產(chǎn)生的抗體。因此,更多情況是將間接ELISA作為普查檢測方法而不是免疫家畜的檢測方法。此外,可通過間接ELISA檢測乳液診斷奶牛布魯菌病,乳液和血清的敏感性相近且乳液的特異性比血清高,在檢測奶牛布魯菌病時可以用乳液代替血清,排除采血帶來的不便,可大大提高檢測效率。2)雙抗體夾心法。多用于檢測大分子抗原。王顯軍等建立了檢測畜間布魯菌抗體的常規(guī)雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗,檢測了多種正常動物血清、感染布魯菌的多種動物血清抗體,其陽性率及抗體平均效價均優(yōu)于常規(guī)血清學(xué)試驗,說明該試驗具有良好的特異性及敏感性。3)競爭法。多用于檢測小分子抗原,可鑒別布魯菌病的自然感染和人工免疫,其主要原理是疫苗免疫產(chǎn)生的低親和力抗體是由免疫消除引起的,而在持續(xù)抗原自然感染過程中,抗體的親和力是不斷升高的,這樣競爭性抗體就能有選擇性地抑制結(jié)合疫苗所產(chǎn)生的抗體,而不是野毒株所產(chǎn)生的抗體。4)斑點-ELISA(Dot-ELISA)。曹三杰等應(yīng)用Dot-PPA-ELISA檢測豬布魯菌病抗體,并以SAT作為對照,結(jié)果表明,Dot-PPA-ELISA的靈敏性比SAT高,二者陽性符合率高,且前者操作簡便,試劑用量少,無需特殊試驗條件,結(jié)果易于判斷,反應(yīng)膜片可長期保存,其敏感性比SAT要高10~100倍。許多學(xué)者相繼應(yīng)用特異、敏感的ELISA對畜間布魯菌抗體進行檢測,并與SAT、RBPT、PAT、CFT這4種方法比較,結(jié)果表明,ELISA檢測結(jié)果的陽性、陰性符合率均較高(90%以上),說明ELISA具有高的敏感性和特異性,建議將此方法作為一種標(biāo)準(zhǔn)檢測法加以推廣。3.2.8基于dica的細(xì)菌學(xué)檢測GICA是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物,被應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)中的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。用該技術(shù)檢測組織切片中的菌體抗原,敏感性高于ELISA和PCR,最小檢出量可達200cfu/mL。J.W.Kim等以犬種布魯菌的抽提物作為檢測抗原建立了檢測犬血清布魯菌病抗體的GICA,結(jié)果表明,GICA與常規(guī)凝集試驗和細(xì)菌學(xué)檢測具有相同的敏感性和特異性。朱明東等建立了診斷牛布魯菌病的GICA,結(jié)果表明,該方法敏感性和特異性均在90%以上。該方法具有試劑敏感、特異,血清用量少,操作簡便、快速等特點,適合于布魯菌病的診斷、流行病學(xué)調(diào)查及現(xiàn)場檢測。3.3布魯菌檢測方法PCR技術(shù)是一項體外酶促擴增DNA技術(shù),具有特異性和敏感性高,操作簡便、快速、高效等特點,已被廣泛用于畜禽傳染病、遺傳病診斷及生物工程等方面。目前,已有多種基于PCR的畜間布魯菌病檢測方法,其中最有效的是通過檢測布魯菌屬的特異性序列,該技術(shù)最初發(fā)明時需要進行細(xì)菌分離,可用于直接檢測臨床樣品。通過對布魯菌常規(guī)檢測法與PCR法進行比較發(fā)現(xiàn),PCR法的種、型鑒定結(jié)果與樣品培養(yǎng)物生化試驗鑒定結(jié)果一致。PCR法大大縮短了鑒定布魯菌的診斷時間,能高效、準(zhǔn)確鑒定出布魯菌,并能對其種、型進行區(qū)分。王素華等以布魯菌外膜蛋白Omp31的基因序列為研究對象,選取特異性好的基因片段,建立了檢測牛布魯菌PCR檢測法,結(jié)果最低能檢測0.9pg/μL的布魯菌DNA。盡管PCR方法診斷布魯菌病快速、敏感,但目前還沒有一個明確的實驗室檢測診斷標(biāo)準(zhǔn)。3.4其他方法3.4.1血清學(xué)檢測該方法主要檢測由布魯菌引起的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。臨床上可用由粗糙型布魯菌提取的布魯菌水解素(0.2mL)注射到羊尾根皺襞或豬耳根部皮內(nèi),于24,48小時各觀察1次,若注射部位發(fā)紅、腫脹即判為陽性反應(yīng)。該方法對慢性病例的檢出率較高,并且注射水解素后無抗體產(chǎn)生,不影響以后的血清學(xué)檢測。此方法不能區(qū)分疫苗免疫與自然感染,但在區(qū)分真正的布魯菌動物與血清學(xué)假陽性動物上有較高的效率。較高的特異性與較低的敏感性決定該方法更適用于整群檢測,而不適用于個體檢測。皮膚檢測被OIE規(guī)定為可選用的方法。3.4.2布魯菌抗原檢測F.Ilhan等應(yīng)用免疫組化法檢測了羊種布魯菌抗原在流產(chǎn)胎兒組織中的存在與分布情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在110份流產(chǎn)胎兒樣本中,布魯菌抗原主要位于肺巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及肝枯否氏細(xì)胞的細(xì)胞膜上。說明免疫組化法可用于羊種布魯菌引起的綿羊流產(chǎn)甲醛固定樣本的檢測,并且該方法特異性強、敏感性高,還可以在組織和細(xì)胞中進行抗原定位,對病理學(xué)研究具有重要意