生物化學(xué)課件2蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)存在于所有的生物細胞中，是構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì)。蛋白質(zhì)是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，它參與了幾乎所有的生命活動過程。第二章蛋白質(zhì)(Protein)第一節(jié)概述一、蛋白質(zhì)的定義蛋白質(zhì)：是一切生物體中普遍存在的，由天然氨基酸通過肽鍵連接而成的生物大分子；其種類繁多，各具有一定的相對分子質(zhì)量，復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)和特定的生物功能；是表達生物遺傳性狀的一類主要物質(zhì)。

二、蛋白質(zhì)在生命中的重要性

早在1878年，思格斯就在《反杜林論》中指出：“生命是蛋白體的存在方式，這種存在方式本質(zhì)上就在于這些蛋白體的化學(xué)組成部分的不斷的自我更新。”可以看出，第一，蛋白體是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)；第二，生命是物質(zhì)運動的特殊形式，是蛋白體的存在方式；第三，這種存在方式的本質(zhì)就是蛋白體與其外部自然界不斷的新陳代謝?，F(xiàn)代生物化學(xué)的實踐完全證實并發(fā)展了恩格斯的論斷

1.蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)必不可少的重要成分

蛋白質(zhì)占干重人體中（中年人）人體45%水55%細菌50%~80%蛋白質(zhì)19%真菌14%~52%脂肪19%酵母菌14%~50%糖類＜1%白地菌50%無機鹽7%2.蛋白質(zhì)是一種生物功能的主要體現(xiàn)者

（1）酶的催化作用（2）調(diào)節(jié)作用(多肽類激素)（3）運輸功能（4）運動功能（5）免疫保護作用(干擾素)（6）接受、傳遞信息的受體（7）毒蛋白3.外源蛋白質(zhì)有營養(yǎng)功能，可作為生產(chǎn)加工的對象.三、蛋白質(zhì)的組成1.元素組成

蛋白質(zhì)是一類含氮有機化合物，除含有碳、氫、氧外，還有氮和少量的硫。某些蛋白質(zhì)還含有其他一些元素，主要是磷、鐵、碘、碘、鋅和銅等。這些元素在蛋白質(zhì)中的組成百分比約為：碳50％氫7％氧23％氮16%硫0—3％其他微量

氮占生物組織中所有含氮物質(zhì)的絕大部分。因此，可以將生物組織的含氮量近似地看作蛋白質(zhì)的含氮量。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)的含氮量接近于16%，所以，可以根據(jù)生物樣品中的含氮量來計算蛋白質(zhì)的大概含量

★蛋白質(zhì)含量的測定：

凱氏定氮法

(測定氮的經(jīng)典方法)優(yōu)點：對原料無選擇性，儀器簡單，方法也簡單；缺點：易將無機氮(如核酸中的氮)都歸入蛋白質(zhì)中,不精確。一般，樣品含氮量平均在16%，取其倒數(shù)100/16=6.25，即為蛋白質(zhì)換算系數(shù)，其含義是樣品中每存在1g元素氮，就說明含有6.25g蛋白質(zhì)）；故：※蛋白質(zhì)含量=氮的量×6.25

除了上法外，還有

紫外比色法

雙縮脲法

Folin—酚

考馬斯亮蘭G—250比色法（條件：蛋白質(zhì)必須是可溶的）

2.化學(xué)組成（兩種類型）單純蛋白質(zhì)：水解為α-氨基酸結(jié)合蛋白質(zhì)=單純蛋白質(zhì)+輔基

第二節(jié)氨基酸化學(xué)一、氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類(2).除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的α-碳原子都為不對稱碳原子,所以：A.氨基酸都具有旋光性。B.每一種氨基酸都具有D-型和L-型兩種立體異構(gòu)體。目前已知的天然蛋白質(zhì)中氨基酸都為L-型。1.氨基酸的結(jié)構(gòu)氨基酸是蛋白質(zhì)水解的最終產(chǎn)物，是組成蛋白質(zhì)的基本單位。從蛋白質(zhì)水解物中分離出來的氨基酸有二十種，除脯氨酸和羥脯氨酸外，這些天然氨基酸在結(jié)構(gòu)上的共同特點為：(1).與羧基相鄰的α-碳原子上都有一個氨基，因而稱為α-氨基酸COOHH2NCHα-碳原子基團RR基團α-氨基酸基本結(jié)構(gòu)通式

2.常見氨基酸的分類中性AA（1）按R基團的酸堿性分酸性AA堿性AA（2）按R基團的疏水性R基團AA電性質(zhì)分不帶電荷極性R基團的AA帶電荷R基團的AA脂肪族A（3）按R基團的化學(xué)結(jié)構(gòu)分芳香族AA雜環(huán)族AA

3.構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸

4.人體所需的八種必需氨基酸

賴氨酸(Lys)纈氨酸(Val)蛋氨酸(Met)色氨酸(Try)亮氨酸(Leu)異亮氨酸(Ile)酪氨酸(Thr)苯丙氨酸(Phe)嬰兒時期所需:精氨酸(Arg)、組氨酸(His)早產(chǎn)兒所需：色氨酸(Try)、半胱氨酸(Cys)５.幾種重要的不常見氨基酸

在少數(shù)蛋白質(zhì)中分離出一些不常見的氨基酸，通常稱為不常見蛋白質(zhì)氨基酸。這些氨基酸都是由相應(yīng)的基本氨基酸衍生而來的。其中重要的有4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、N-甲基賴氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。這些不常見蛋白質(zhì)氨基酸的結(jié)構(gòu)如下

二.氨基酸的重要理化性質(zhì)1.一般物理性質(zhì)常見氨基酸均為無色結(jié)晶,其形狀因構(gòu)型而異溶解性：各種氨基酸在水中的溶解度差別很大，并能溶解于稀酸或稀堿中，但不能溶解于有機溶劑。通常酒精能把氨基酸從其溶液中沉淀析出。

(2)熔點：氨基酸的熔點極高，一般在200℃以上。(3)味感：其味隨不同氨基酸有所不同，有的無味、有的為甜、有的味苦，谷氨酸的單鈉鹽有鮮味，是味精的主要成分。旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋轉(zhuǎn)，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+）表示。(5)光吸收：構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠紫外區(qū)(<220nm)均有光吸收。在近紫外區(qū)(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。

酪氨酸的max＝275nm，275=1.4x103;苯丙氨酸的max＝257nm，257=2.0x102;色氨酸的max＝280nm，280=5.6x103;

2.氨基酸的離解性質(zhì)氨基酸在結(jié)晶形態(tài)或在水溶液中，并不是以游離的羧基或氨基形式存在，而是離解成兩性離子。在兩性離子中，氨基是以質(zhì)子化(-NH3+)形式存在，羧基是以離解狀態(tài)(-COO-)存在。在不同的pH條件下，兩性離子的狀態(tài)也隨之發(fā)生變化PH1710凈電荷+10-1正離子兩性離子負離子

等電點PI

3.氨基酸的等電點

當(dāng)溶液濃度為某一pH值時，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-數(shù)目正好相等，凈電荷為0。這一pH值即為氨基酸的等電點，簡稱pI。在等電點時，氨基酸既不向正極也不向負極移動，即氨基酸處于兩性離子狀態(tài)。側(cè)鏈不含離解基團的中性氨基酸，其等電點是它的pK’1和pK’2的算術(shù)平均值：pI=(pK’1+pK’2)/2同樣，對于側(cè)鏈含有可解離基團的氨基酸，其pI值也決定于兩性離子兩邊的pK’值的算術(shù)平均值。酸性氨基酸：pI=(pK’1+pK’R-COO-)/2鹼性氨基酸：pI=(pK’2+pK’R-NH2)/2

4.氨基酸的化學(xué)性質(zhì)(1)與茚三酮的反應(yīng)（顏色反應(yīng)）

氨基酸與水合茚三酮共熱，發(fā)生氧化脫氨反應(yīng)，生成NH3與酮酸。水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮。加熱過程中酮酸裂解，放出CO2，自身變?yōu)樯僖粋€碳的醛。水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮。NH3與水合茚三酮及還原型茚三酮脫水縮合，生成藍紫色化合物?！铩铩锓磻?yīng)要點A.該反應(yīng)由NH2與COOH共同參與B.茚三酮是強氧化劑C.該反應(yīng)非常靈敏，可在570nm測定吸光值D.測定范圍：0.5~50μg/ml

E.脯氨酸與茚三酮直接生成黃色物質(zhì)（不釋放NH3）應(yīng)用：A.氨基酸定量分析（先用層析法分離）B.氨基酸自動分析儀：用陽離子交換樹脂，將樣品中的氨基酸分離，自動定性定量，記錄結(jié)果。(2)與甲醛反應(yīng)

反應(yīng)特點A.為α-NH2的反應(yīng)B.在常溫，中性條件，甲醛與α-NH2很快反應(yīng)，生成羥甲基衍生物，釋放氫離子。應(yīng)用：氨基酸定量分析—甲醛滴定法（間接滴定）A.直接滴定，終點pH過高（12），沒有適當(dāng)指示劑。B.與甲醛反應(yīng)，滴定終點在9左右，可用酚酞作指示劑。C.釋放一個氫離子，相當(dāng)于一個氨基（摩爾比1：1）D.簡單快速，一般用于測定蛋白質(zhì)的水解速度。(3)與2,4-二硝基氟苯（DNFB）反應(yīng)

反應(yīng)特點A.為α-NH2的反應(yīng)B.氨基酸α-NH2的一個H原子可被烴基取代(鹵代烴)C.在弱堿性條件下，與DNFB發(fā)生芳環(huán)取代，生成二硝基苯氨基酸應(yīng)用：鑒定多肽或蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸A.雖然多肽側(cè)鏈上的ε-NH2、酚羥基也能與DNFB反應(yīng)，但其生成物，容易與α-DNP氨基酸區(qū)分和分離

★首先由Sanger應(yīng)用，確定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)A.B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游離氨基酸C.分離DNP-氨基酸D.由Edman于1950年首先提出為α-NH2的反應(yīng)用于N末端分析，又稱Edman降解法肽分子與DNFB反應(yīng)，得DNP-肽層析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的種類、數(shù)目(4)與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應(yīng)

Edman（苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法實際上也是一種N-端分析法。此法的特點是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進行標記和解離。

肽鏈（N端氨基酸）與PITC偶聯(lián)，生成PTC-肽環(huán)化斷裂：最靠近PTC基的肽鍵斷裂，生成PTC-氨基酸和少一殘基的肽鏈，同時PTC-氨基酸環(huán)化生成PTH-氨基酸分離PTH-氨基酸層析法鑒定Edman降解法的改進方法---DNS-Edman降解法用DNS(二甲基萘磺酰氯)測定N端氨基酸原理DNFB法相同但水解后的DNS-氨基酸不需分離，可直接用電泳或?qū)游龇ㄨb定由于DNS有強烈熒光，靈敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高幾到十幾倍可用于微量氨基酸的定量

用Edman降解法提供逐次減少一個殘基的肽鏈靈敏度提高，能連續(xù)測定。多肽順序自動分析儀樣品最低用量可在5pmol（5）與熒光胺的反應(yīng)

α-NH2的反應(yīng)氨基酸定量（6）與5,5’-雙硫基-雙(2-硝基苯甲酸)反應(yīng)-SH的反應(yīng)測定細胞游離-SH的含量（7）其他反應(yīng)成鹽、成酯、成肽、脫羧反應(yīng)

第三節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽(polypeptide)鏈以特殊方式結(jié)合而成的生物大分子。蛋白質(zhì)與多肽并無嚴格的界線，通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大,從大約6000到1000000道爾頓甚至更大

一.基本問題---肽一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽。由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽，由多個氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成多肽的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。

1.多肽

在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序通常在多肽鏈的一端含有一個游離的

-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個游離的

-羧基，稱為羧基端或C-端。氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點的排列順序。如上述五肽可表示為：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln

2.肽鍵

肽鍵的特點是氮原子上的孤對電子與羰基具有明顯的共軛作用。組成肽鍵的原子處于同一平面。肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。在大多數(shù)情況下，以反式結(jié)構(gòu)存在。

3.天然存在的重要多肽

在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-腦啡肽Leu-腦啡肽

二.蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)1.蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)(Primarystructure)包括：

(1)組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目.(2)多肽鏈的氨基酸順序，(3)多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置?！锲渲凶钪匾氖嵌嚯逆湹陌被犴樞颍堑鞍踪|(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。2.蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的測定

蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)以來，現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)被測定。(1)測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的要求

A.樣品必需純（>97%以上）；B.知道蛋白質(zhì)的分子量；C.知道蛋白質(zhì)由幾個亞基組成；D.測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計算每種氨基酸的個數(shù)。E.測定水解液中的氨量，計算酰胺的含量。(2)測定步驟

①多肽鏈的拆分：由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進行拆分。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).

②測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目：通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。

③二硫鍵的斷裂：幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍诳捎?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化?？梢酝ㄟ^加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價力；應(yīng)用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。

★巰基的保護④測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比；⑤分析多肽鏈的N-末端和C-末端

★末端氨基酸的測定：多肽鏈端基氨基酸分為兩類，N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端氨基酸測定的主要方法有：

二硝基氟苯（DNFB）法丹磺酰氯法:在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優(yōu)點是丹磺酰-氨基酸有很強的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度可以達到1

10-9mol。肼解法：此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法。多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。

氨肽酶法：氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個的向里水解。根基不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時間和氨基酸殘基釋放量作動力學(xué)曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。羧肽酶法：羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個的水解。根基不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y；A和B來自胰臟；C來自柑桔葉；Y來自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵。⑥多肽鏈斷裂成多個肽段，可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。多肽的選擇性降解的方法有：酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶化學(xué)法：溴化氰水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。⑦測定每個肽段的氨基酸順序。⑧確定肽段在多肽鏈中的次序：利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。⑨確定原多肽鏈重二硫鍵的位置：一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個肽段，用過甲酸處理后，將每個肽段進行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置。三.蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)1.蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的二級(Secondary)結(jié)構(gòu)是指肽鏈的主鏈在空間的排列,或規(guī)則的幾何走向、旋轉(zhuǎn)及折疊。它只涉及肽鏈主鏈的構(gòu)象及鏈內(nèi)或鏈間形成的氫鍵。主要有-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角。(1).-螺旋

在

-螺旋中肽平面的鍵長和鍵角一定,肽鍵的原子排列呈反式構(gòu)型,相鄰的肽平面構(gòu)成兩面角.①多肽鏈中的各個肽平面圍繞同一軸旋轉(zhuǎn)，形成螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為0.54nm,含3.6個氨基酸殘基；兩個氨基酸之間的距離0.15nm.②肽鏈內(nèi)形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與軸平行，第一個氨基酸殘基的酰胺基團的-CO基與第四個氨基酸殘基酰胺基團的-NH基形成氫鍵。③蛋白質(zhì)分子為右手

-螺旋。左手和右手螺旋

（2）

-折疊

-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵交聯(lián)而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒樁折疊構(gòu)象。①在

-折疊中，-碳原子總是處于折疊的角上，氨基酸的R基團處于折疊的棱角上并與棱角垂直，兩個氨基酸之間的軸心距為0.35nm.②

-折疊結(jié)構(gòu)的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間形成的；也可以在同一肽鏈的不同部分之間形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的交聯(lián)，氫鍵與鏈的長軸接近垂直。③

-折疊有兩種類型。一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊。另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反。（3）

-轉(zhuǎn)角在

-轉(zhuǎn)角部分，由四個氨基酸殘基組成.四個形成轉(zhuǎn)角的殘基中，第三個一般均為甘氨酸殘基．彎曲處的第一個氨基酸殘基的-C=O和第四個殘基的–N-H之間形成氫鍵，形成一個不很穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這類結(jié)構(gòu)主要存在于球狀蛋白分子中。（４）自由回轉(zhuǎn)沒有一定規(guī)律的松散肽鏈結(jié)構(gòu)，但仍是緊密有序的