基因工程 體外重組 (帶動畫)

第六章DNA重組的操作基因工程外源DNA載體DNA重組分子擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射原核細(xì)胞真核細(xì)胞受體細(xì)胞？1.基因文庫2.PCR3.基因差異表達(dá)1.克隆載體2.表達(dá)載體第一節(jié)DNA的體外重組限制酶—分子剪刀限制酶—分子剪刀連接酶—分子膠水重組DNA分子粘性末端連接效率最高！

黏性末端黏性末端1、粘性末端的連接

第一節(jié)DNA的體外重組1.粘性末端連接創(chuàng)造互補(bǔ)粘性末端的方法有哪些？同種酶同尾酶第一節(jié)DNA的體外重組（1）兩端具有相同粘末端的DNA分子之間的連接

第一節(jié)DNA的體外重組

堿性磷酸酶：去掉其5’末端的磷酸基，以防質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化。注意：目的基因正反向插入；載體與多個目的基因片段重組。1231234434第一節(jié)DNA的體外重組

（2）兩端具有不同粘性末端的DNA分子之間的連接

兩種不同的限制性內(nèi)切酶

兩端會產(chǎn)生非互補(bǔ)的突出端

定向重組體第一節(jié)DNA的體外重組HindIIIEcoRIHindIIIEcoRI對載體酶切HindIIIEcoRI對基因酶切質(zhì)粒載體的定向重組堿性磷酸酶？避免了目的基因正反向插入2.平頭末端連接第一節(jié)DNA的體外重組平末端平末端SmaI限制酶第一節(jié)DNA的體外重組

T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。

5’端與3’端并列靠近的時間太短，不容易被連接酶連接。

（1）直接連接第一節(jié)DNA的體外重組

（2）人工加尾形成“粘性末端”

a）同聚加尾法

DNA末端轉(zhuǎn)移酶

DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3’-OH端加上脫氧核苷酸,

利用DNA末端轉(zhuǎn)移酶分別給載體和插入片斷加上互補(bǔ)的核苷酸。

第一節(jié)DNA的體外重組非酶切位點(diǎn)

a）同聚加尾法

缺點(diǎn)：不能把插入片段再切下來。第一節(jié)DNA的體外重組還有哪些方法能夠創(chuàng)造粘性末端？第一節(jié)DNA的體外重組b）銜接物(linker)連接

Linker:用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)序列的平端雙鏈。

GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：第一節(jié)DNA的體外重組銜接物(linker)連接第一節(jié)DNA的體外重組銜接物(linker)連接優(yōu)點(diǎn)：

1）可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。

2）能給載體連接上Polylinker缺點(diǎn)：如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點(diǎn)，不能切下完整的插入片段第一節(jié)DNA的體外重組c)DNA接頭

(adapter)連接法

adapter:一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）。

adapter的作用:用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’

BamHIadapter第一節(jié)DNA的體外重組缺點(diǎn)：接頭與接頭會彼此以粘性末端接在一起，影響與D