第四章 滅菌與空氣凈化

第四章發(fā)酵工廠滅菌與空氣凈化第一節(jié)嚴(yán)格消毒滅菌第二節(jié)空氣除菌第一節(jié)嚴(yán)格消毒滅菌4.1.1嚴(yán)格消毒滅菌控制有害微生物主要有以下幾種措施

4.1.2發(fā)酵工業(yè)中滅菌和消毒常用范圍為保證純種培養(yǎng)，在生產(chǎn)菌種接種培養(yǎng)之前，要對(duì)培養(yǎng)基、空氣系統(tǒng)、消泡劑、流加物料、設(shè)備、管道進(jìn)行滅菌；還在對(duì)生產(chǎn)環(huán)境進(jìn)行消毒，防止雜菌和噬菌體的大量繁殖。除菌的方法培養(yǎng)基的加熱滅菌（包括常壓或蒸汽高壓加熱法）空氣的過濾除菌紫外線或電離輻射化學(xué)藥物滅菌（一）高溫殺菌作用的種類

高溫致死原理：由于它使微生物的蛋白質(zhì)和核酸等重要生物高分子發(fā)生變性、破壞，例如它可使核酸發(fā)生脫氨、脫嘌呤或降解，以及破壞細(xì)胞膜上的類脂質(zhì)成分等。1．干熱滅菌法將金屬制品或清潔玻璃器皿放入電熱烘箱內(nèi)，在150～170℃下維持1～2小時(shí)后，即可達(dá)到徹底滅菌的目的。在這種條件下，可使細(xì)胞膜破壞、蛋白質(zhì)變性、原生質(zhì)干燥，以及各種細(xì)胞成分發(fā)生氧化。灼燒，是一種最徹底的干熱滅菌方法，但它只能用于接種環(huán)、接種針等少數(shù)對(duì)象的滅菌。

2．濕熱滅菌法濕熱滅菌法比干熱滅菌法更有效。這一方面是由于濕熱易于傳遞熱量，另一方面是由于濕熱更易破壞保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的氫鍵等結(jié)構(gòu)，從而加速其變性。多數(shù)細(xì)菌和真菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在60℃左右處理5～10min后即可殺死；酵母菌和真菌的孢子稍耐熱些，要用80℃以上的溫度處理才能殺死；而細(xì)菌的芽孢最耐熱，一般要在120℃下處理15min才能殺死。（1）常壓法

巴氏消毒法（pasteurization）用于牛奶、啤酒、果酒和醬油等不能進(jìn)行高溫滅菌的液體的一種消毒方法，其主要目的是殺死其中無芽孢的病原菌（如牛奶中的結(jié)核桿菌或沙門氏菌），而又不影響它們的風(fēng)味。巴氏消毒法是一種低溫消毒法低溫維持法：在63℃下保持30分鐘可進(jìn)行牛奶消毒；高溫瞬時(shí)法：用于牛奶消毒時(shí)只要在72℃下保持15秒鐘即可。間歇滅菌法，又稱丁達(dá)爾滅菌法或分段滅菌法。適用于不耐熱培養(yǎng)基的滅菌。方法是：將待滅菌的培養(yǎng)基在80～100℃下蒸煮15～60分鐘，以殺死其中所有微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，然后置室溫或37℃下保溫過夜，誘導(dǎo)殘留的芽孢發(fā)芽，第二天再以同法蒸煮和保溫過夜，如此連續(xù)重復(fù)3天，即可在較低溫度下達(dá)到徹底滅菌的效果。（2）加壓法常規(guī)加壓滅菌法盛有適量水的加壓蒸汽滅菌鍋加熱煮沸，徹底驅(qū)盡后將鍋密閉，再繼續(xù)加熱至121℃（壓力為1kg／cm2或15磅／英寸2），時(shí)間維持15～20分鐘，也可采用在較低的溫度（115℃，即0.7kg／cm2或10磅／英寸2）下維持35min的方法。此法適合于一切微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)療保健機(jī)構(gòu)或發(fā)酵工廠中對(duì)培養(yǎng)基及多種器材、物料的滅菌。

連續(xù)加壓滅菌法在發(fā)酵行業(yè)里也稱“連消法”。此法只在大規(guī)模的發(fā)酵工廠中作培養(yǎng)基滅菌用。主要操作：將培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外連續(xù)不斷地進(jìn)行加熱、維持和冷卻，然后才進(jìn)入發(fā)酵罐。培養(yǎng)基一般在135～140℃下處理5～15秒鐘。

4.1.3高溫對(duì)培養(yǎng)基成分的有害影響及其防止

消除高溫有害影響的措施（1）對(duì)易破壞的含糖培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌時(shí)，應(yīng)先將糖液與其他成分分別滅菌后再合并；（2）對(duì)含Ca2+或Fe3+的培養(yǎng)基與磷酸鹽先作分別滅菌，然后再混合，就不易形成磷酸鹽沉淀；（3）對(duì)含有在高溫下易破壞成分的培養(yǎng)基（如含糖組合培養(yǎng)基）可進(jìn)行低壓滅菌（在112℃即0.57kg／cm2或8磅／英寸2下滅菌15分鐘）或間歇滅菌；（4）在大規(guī)模發(fā)酵工業(yè)中，可采用連續(xù)加壓滅菌法進(jìn)行培養(yǎng)基的滅菌4.1.4滅菌設(shè)備1、高壓蒸汽滅菌

生產(chǎn)中使用高壓蒸汽滅菌鍋的型號(hào)很多。手提式滅菌鍋，容量小，多用于母種培養(yǎng)基滅菌。立式或臥式滅菌鍋較大，多用于原種或少量栽培種培養(yǎng)基的滅菌，一般能裝幾十瓶或幾百瓶。滅菌柜要和蒸汽鍋爐配套，用于大量的原種和栽培種培養(yǎng)基的滅菌，一次能裝幾百至幾千瓶(袋)。但投資太大，適合大型菌種場(chǎng)使用。2．常壓蒸汽滅菌鍋

常壓蒸汽滅菌鍋是用鐵鍋、磚、水泥砌成的，造價(jià)低，適于一般生產(chǎn)單位和專業(yè)戶使用。大小可根據(jù)需要而定，但最大的鍋每次裝料也最好不超過500公斤。

3．烘箱

烘箱主要是用于玻璃器皿的干燥和滅菌，也可用于其它物品烘干。

4.1.5

培養(yǎng)基的滅菌

（一）理論滅菌時(shí)間

某些分子的分解和分子內(nèi)部的重新排列的反應(yīng)屬于單分子反應(yīng)。雜菌雖然是一個(gè)復(fù)雜的高分子體系，但其受熱被殺死，主要原因是高溫能使蛋白質(zhì)變性，這種反應(yīng)屬與單分子反應(yīng)，因此雜菌在一定溫度下受熱死亡也遵循單分子反應(yīng)方程。

τ=(2.303/k)log(No/Ns)τ---滅菌時(shí)間（秒）k---反應(yīng)速度常數(shù)，與菌的種類和加熱溫度有關(guān)（s－１）No---滅菌開始時(shí)，污染的培養(yǎng)基中雜菌個(gè)數(shù)（個(gè)／ml）Ns---經(jīng)過滅菌時(shí)間T后，殘存活菌個(gè)數(shù)（個(gè)／ml）

細(xì)菌名稱K值/min-1枯草芽胞桿菌3.8-2.6硬脂嗜熱芽胞桿菌FS15180.77硬脂嗜熱芽胞桿菌FS6172.9產(chǎn)氣梭狀芽胞桿菌PA36791.8（二）滅菌溫度與菌死亡反應(yīng)速度常數(shù)的關(guān)系

滅菌溫度與菌死亡反應(yīng)速度常數(shù)的關(guān)系：

k=Ae-E/RT

K——菌死亡的速度常數(shù)（1／秒），當(dāng)反應(yīng)物的濃度為單位濃度時(shí)，則反應(yīng)速度常數(shù)在數(shù)值上等于反應(yīng)速度A——阿累尼烏斯常數(shù)（1／秒）R——?dú)怏w常數(shù)（1.987*4.817焦／開／摩爾）T——絕對(duì)溫度（開）將上式代入，得：（四）影響培養(yǎng)基滅菌的因素

1、pH值的影響pH值對(duì)微生物的耐熱性影響很大，pH為6.0-8.0時(shí)微生物最不易死亡，pH<6.0時(shí)氫離子易滲入微生物的細(xì)胞內(nèi)。2、培養(yǎng)基成分

培養(yǎng)基的成分中，油脂、糖類、蛋白質(zhì)都是傳熱的不良介質(zhì)，會(huì)增加微生物的耐熱性，使滅菌困難。濃度較高的培養(yǎng)基相對(duì)需要較高溫度和較長(zhǎng)時(shí)間滅菌。高濃度的鹽類，色素則削弱其耐熱性，故較易滅菌。3、培養(yǎng)基中的顆粒物質(zhì)培養(yǎng)基中的顆粒物質(zhì)大，滅菌困難，反之，滅菌容易。一般說來，含有顆粒對(duì)培養(yǎng)基滅菌影響不大，但在培養(yǎng)基混有較大顆粒，特別是存在凝結(jié)成團(tuán)的膠體時(shí)，會(huì)影響滅菌效果，必須過濾除去。4.滅菌物體含菌量的影響。天然原料尤其是麩皮等植物性原料配成的培養(yǎng)基，一般含菌量較高，而用純粹化學(xué)試劑配制成的組合培養(yǎng)基，含菌量低。5.滅菌鍋內(nèi)空氣排除程度的影響檢驗(yàn)滅菌鍋內(nèi)空氣排除度，可采用多種方法。最好的辦法是滅菌鍋上同時(shí)裝有壓力表和溫度計(jì)，其次是將待測(cè)氣體通過橡膠管引入深層冷水中，如只聽到“撲撲”聲而未見有氣泡冒出，也可證明鍋內(nèi)已是純蒸汽了。

6.滅菌對(duì)象的體積。要防止用常規(guī)的壓力和時(shí)間在加壓滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行大容量培養(yǎng)基的滅菌。7.加熱與散熱速度。這兩段時(shí)間也對(duì)滅菌效果和培養(yǎng)基成分發(fā)生影響。為了使科學(xué)研究的結(jié)果有良好的重演性，在滅菌操作中對(duì)這些技術(shù)細(xì)節(jié)都應(yīng)加以注意。

（五）滅菌的實(shí)際操作

1.空罐滅菌

空罐滅菌也稱空消。無論是種子罐、發(fā)酵罐、還是尿素（或液氨）罐、消泡罐，當(dāng)培養(yǎng)基（或物料）尚未進(jìn)罐前對(duì)罐進(jìn)行預(yù)先滅菌，為空罐滅菌。為了殺死所有微生物特別是耐熱的的芽孢，空罐滅菌要求溫度較高，滅菌時(shí)間較長(zhǎng)，只有這樣才能殺死設(shè)備中各死角殘存的雜菌或芽孢。2.實(shí)罐滅菌

將培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中用蒸汽加熱，達(dá)到預(yù)定滅菌溫度后，維持一定時(shí)間，再冷卻到發(fā)酵溫度，然后接種發(fā)酵，這叫做實(shí)罐滅菌，又稱分批滅菌。操作要點(diǎn)：

三路進(jìn)汽：直接蒸汽從通風(fēng)、取樣和出料口進(jìn)入罐內(nèi)直接加熱，直到所規(guī)定的溫度，并維持一定的時(shí)間。這就是所謂的“三路進(jìn)氣”。

3.連續(xù)滅菌

將配制好的培養(yǎng)基向發(fā)酵罐輸送的同時(shí)加熱、保溫和冷卻。連續(xù)滅菌時(shí)，培養(yǎng)基能在短時(shí)間內(nèi)加熱到保溫溫度，并能很快冷卻，有利于減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的破壞。液體培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌一般在由配料罐、泵、連消塔、維持罐和噴淋冷卻器的連消設(shè)備中進(jìn)行。滅菌時(shí)間的計(jì)算例：有一發(fā)酵罐，內(nèi)裝培養(yǎng)基40m2，在131℃的溫度下進(jìn)行連續(xù)滅菌。設(shè)每毫升培養(yǎng)基含有耐熱菌的芽孢2×107個(gè)，在131℃時(shí)的滅菌速率常數(shù)為0.25s-1。試求滅菌失敗的機(jī)率為0.001所需的時(shí)間。解：3.培養(yǎng)基連消工藝流程圖

噴嘴式連消塔噴射加熱器維持罐噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程薄板換熱器連續(xù)滅菌流程薄板換熱器連續(xù)加壓滅菌法優(yōu)點(diǎn)

①因采用高溫瞬時(shí)滅菌，故既可殺滅微生物，又可最大限度減少營(yíng)養(yǎng)成分的破壞，從而提高了原料的利用率，比“實(shí)罐滅菌”（120℃，30分鐘）提高產(chǎn)量5～10％；②由于總的滅菌時(shí)間較分批滅菌注明顯減少，所以縮短了發(fā)酵罐的占用周期，從而提高了它的利用率；③由于蒸汽負(fù)荷均勻，故提高了鍋爐的利用率；④適宜于自動(dòng)化操作；⑤降低了操作人員的勞動(dòng)強(qiáng)度。

4.1.6過濾除菌法及其它方法是將液體或氣體用微孔薄膜過濾，使大于孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留，從而達(dá)到除菌目的。在體外培養(yǎng)時(shí)，過濾除菌大多用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養(yǎng)液。（一）過濾除菌法目前，大多實(shí)驗(yàn)室采用微孔濾膜濾器除菌。關(guān)鍵步驟是安裝濾膜及無菌過濾過程。濾膜過濾裝置、燒結(jié)玻璃濾板過濾器、石棉板過濾器（Seitz濾器）、素?zé)蛇^濾器以及硅藻土過濾器等。過濾除菌的缺點(diǎn)是無法去除其中的病毒和噬菌體。（二）其他方法在配制培養(yǎng)基時(shí)，為避免發(fā)生沉淀，一般應(yīng)按配方逐一加入各種成分。另外，加入0.01％EDTA或0.01％NTA（氮川三乙酸）等螯合劑到培養(yǎng)基中，可防止金屬離子發(fā)生沉淀。最后，還可以用氣體滅菌劑如氧化乙烯等對(duì)個(gè)別成分進(jìn)行滅菌處理。4.1.7化學(xué)殺菌劑或抑菌劑

（一）表面消毒劑常用消毒劑的種類很多，它們的殺菌強(qiáng)度各不相同。但幾乎都有一個(gè)共同規(guī)律，即當(dāng)其在極低濃度時(shí)，常常會(huì)對(duì)微生物的生命活動(dòng)起刺激作用，隨著濃度逐漸增高，就相繼出現(xiàn)制菌和殺菌作用，因而形成一個(gè)連續(xù)的作用譜。表面消毒劑是指對(duì)一切活細(xì)胞都有毒性，不能用作活細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)治療用的化學(xué)藥劑。

為比較各種表面消毒劑的相對(duì)殺菌強(qiáng)度，常采用在臨床上最早使用的消毒劑——石炭酸作為比較的標(biāo)準(zhǔn)，并提出了石炭酸系數(shù)這一指標(biāo)。所謂石炭酸系數(shù)，指在一定時(shí)間內(nèi)被試藥劑能殺死全部供試菌的最高稀釋度與達(dá)到同效的石炭酸的最高稀釋度的比率。一般規(guī)定處理時(shí)間為10分鐘，而供試菌定為Salmonellatyphi（傷寒沙門氏菌）。

消毒試驗(yàn)

⑴以人工染菌實(shí)物為消毒對(duì)象，模擬現(xiàn)場(chǎng)表面污染大腸桿菌液。⑵消毒前采樣：放置無菌規(guī)格板，取無菌棉拭于含5ml稀釋液試管中沾濕，在規(guī)格板空心處旋轉(zhuǎn)自左至右涂抹整個(gè)區(qū)域。⑶消毒后采樣：在前采樣地點(diǎn)旁用0.05％過氧乙酸溶液消毒物體表面，30min后將無菌棉拭于含5ml采樣液試管中沾濕，作為消毒后樣液。⑷將消毒前后樣液充分振蕩搖勻后稀釋⑸培養(yǎng)待凝固后37℃培養(yǎng)24～48h，作菌落計(jì)數(shù)。第二節(jié)空氣的凈化

一、空氣中微生物的分布空氣中微生物的含量和種類，隨地區(qū)，季節(jié)和空氣中灰塵粒子多少，以及人們的活動(dòng)情況而異。北方氣候干燥，寒冷，空氣中的含菌量較多，離地面越高，含菌量越少；一般每升高10米，空氣中的含菌量就降低一個(gè)數(shù)量級(jí)；城市的空氣中含菌量較多，農(nóng)村的空氣中含菌量較少，一般城市空氣中雜菌數(shù)為3000-8000個(gè)／米3?？諝庵械奈⑸锓N類以細(xì)菌和細(xì)菌芽胞較多，也有酵母，霉菌和病毒。這些微生物大小不一，一般附著在空氣中的灰塵上或霧滴上，空氣中微生物的含量一般為103-104個(gè)／米3?；覊m粒子的平均大小約0.6μm左右，所以空氣除菌主要是去除空氣中的微粒(0.6-1μm）二、空氣除菌

工業(yè)發(fā)酵對(duì)空氣處理的要求隨發(fā)酵產(chǎn)品和菌種不同而異。半固體制曲和酵母生產(chǎn)中無菌要求不十分嚴(yán)格，一般無需復(fù)雜的空氣凈化處理；密閉的深層通氣發(fā)酵需嚴(yán)格的純凈培養(yǎng)，進(jìn)入發(fā)酵罐前空氣必須進(jìn)行冷卻、脫水、脫油和過濾除菌等處理。（二）發(fā)酵對(duì)空氣無菌程度的要求好氣性發(fā)酵過程中需要大量的無菌空氣，空氣要作到絕對(duì)無菌在目前是不可能的，也是不經(jīng)濟(jì)的。發(fā)酵對(duì)無菌空氣的要求是：無菌，無灰塵，無雜質(zhì)，無水，無油，正壓等幾項(xiàng)指標(biāo)；發(fā)酵對(duì)無菌空氣的無菌程度要求是：只要在發(fā)酵過程中不因無菌空氣染菌，而造成損失即可。在工程設(shè)計(jì)中一般要求1000次使用周期中只允許有一個(gè)菌通過，即經(jīng)過濾后空氣的無菌程度為N=10-3

二、空氣除菌的方法

（一）輻射殺菌（二）熱殺菌

（三）靜電除菌（四）過濾除菌3．輻射滅菌法

最常用的是用紫外光線進(jìn)行無菌室滅菌。2537?波長(zhǎng)的紫外線具有極強(qiáng)烈的殺菌效力，它的主要作用是使微生物的DNA分子產(chǎn)生的胸腺嘧啶的二聚體，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。無菌室常用的紫外燈功率為30W，安裝在操作臺(tái)上方一米左右高處，每次照射15-30min既可。紫外線有很強(qiáng)的殺菌力，但穿透力很弱，一張薄紙即可完全擋住紫外線，因此待滅菌物品必須置于紫外光直接照射下，而且在一定范圍內(nèi)作用強(qiáng)度與距離平方成反比。此外，紫外線對(duì)人體組織有一定刺激作用，眼睛、皮膚受照射后會(huì)產(chǎn)生某些癥狀，所以工作人員在無菌室操作時(shí)應(yīng)關(guān)閉紫外燈熱滅菌原理：基于加熱后微生物體內(nèi)的蛋白（酶）熱變性而得以實(shí)現(xiàn)。熱空氣進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)之前，一般均需用壓縮機(jī)壓縮，提高壓力?？諝鈮嚎s后溫度能達(dá)到200℃以上，保持一定時(shí)間后，便可實(shí)行干熱殺菌。利用空氣壓縮時(shí)所產(chǎn)生的熱量進(jìn)行滅菌的原理對(duì)制備大量無菌空氣有特別意義。實(shí)際應(yīng)用中需考慮培養(yǎng)裝置與空氣壓縮機(jī)的相對(duì)位置，連接壓縮機(jī)與培養(yǎng)裝置的管道的滅菌以及管道長(zhǎng)度等。靜電除菌靜電除塵器可除去空氣中的水霧、油霧、塵埃，同時(shí)也除去微生物。原理：利用靜電引力來吸附帶電粒子而達(dá)到除塵滅菌目的。對(duì)于一些直徑小的微粒，所帶電荷小，不能被吸附而沉降。電

除

塵

電

源

介質(zhì)過濾除菌

介質(zhì)過濾除菌是使空氣通過經(jīng)高溫滅菌的介質(zhì)過濾層，將空氣中的微生物等顆粒阻截在介質(zhì)層中，而達(dá)到除菌的目的。從可靠性，經(jīng)濟(jì)適用與便于控制等方面考慮，目前仍以介質(zhì)過濾法較好，也是大多數(shù)發(fā)酵廠廣泛采用的方法。發(fā)酵生產(chǎn)中制備無菌空氣的大致過程

一、對(duì)空氣除菌流程的要求要制備較高無菌程度，具有一定壓力的無菌空氣，它的流程設(shè)備有空氣壓縮機(jī)。流程的制訂根據(jù)所在的地理、氣候環(huán)境和設(shè)備條件而考慮。

在環(huán)境污染比較嚴(yán)重的地方，要考慮改變吸風(fēng)的條件，以降低過濾器的負(fù)荷，提高空氣的無菌程度；在溫暖潮濕的南方，要加強(qiáng)除水設(shè)施，以確保和發(fā)揮過濾器的最大除菌效率；在壓縮機(jī)耗油嚴(yán)重的設(shè)備流程中則要加強(qiáng)消除油霧的污染等等。

二、空氣除菌流程分析要保持過濾器有比較高的過濾效率，應(yīng)維持一定的氣流速度和不受油、水的干擾。氣流速度可由操作來控制；要保持不受油、水干擾則要有一系列冷卻、分離、加熱的設(shè)備來保證空氣的相對(duì)濕度在50%～60%的條件下過濾。高空取氣管

高空取氣管是遠(yuǎn)離地面幾十米的管子。一般而言，地面附近空氣中所含的微生物和灰塵等均比高空空氣中含的多，每升高10