大腸桿菌表達系統(tǒng)

外源基因在大腸桿菌中的表達外源基因在大腸桿菌中的表達大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征

大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架基因克隆表達系統(tǒng)成熟完善繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物外源基因在大腸桿菌中的表達大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征

大腸桿菌表達外源基因的劣勢缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素外源基因在大腸桿菌中的表達外源基因在大腸桿菌中高效表達的原理啟動子終止子核糖體結(jié)合位點密碼子質(zhì)?？截悢?shù)轉(zhuǎn)錄翻譯Ptac=3Ptrp=11Plac啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理

具有多順反子結(jié)構(gòu)，基因排列次序為：啟動子（lacP）-操縱基因（lacO）-結(jié)構(gòu)基因（lacZ-lacY-lacA）

正調(diào)節(jié)因子CAP

負調(diào)節(jié)因子lacI啟動子Lac表達系統(tǒng)以大腸桿菌lac操縱子調(diào)控機理為基礎(chǔ)設(shè)計、構(gòu)建的表達系統(tǒng)

lacI

Plac

lacO

lacZlacYlacA高效轉(zhuǎn)錄cAMPCAPlacI

Plac

lacO

lacZlacYlacARNA聚合酶基底水平轉(zhuǎn)錄Lac表達系統(tǒng)

正調(diào)節(jié)因子CAPcAMP激活CAP，CAP–cAMP復(fù)合物與lac操縱子上專一位點結(jié)合后，能促進RNA聚合酶與–35、–10序列的結(jié)合，進而促進Plac

介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程中使用的lac啟動子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即PlacUV5

cAMP葡萄糖代謝cAMP濃度降低cAMPCAPCAPLac表達系統(tǒng)lacUV5突變體PlacUV5突變體能夠在沒有CAP存在的情形下非常有效的起始轉(zhuǎn)錄，受它控制的基因在轉(zhuǎn)錄水平上只受lacI的調(diào)控，因此用它構(gòu)建的表達載體在使用時比野生型Plac更易操作。Lac表達系統(tǒng)

負調(diào)節(jié)因子lacI在無誘導(dǎo)物情形下，lacI

基因產(chǎn)物形成四聚體阻遏蛋白，與啟動子下游的操縱基因緊密結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄的起始。lacI

Plac

lacO

lacZlacYlacARNA聚合酶基底水平轉(zhuǎn)錄lacI

Plac

lacO

lacZlacYlacA高效轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶IPTGmRNATac表達系統(tǒng)tac啟動子是由trp的–35序列和lacUV5的–10序列拼接而成的雜合啟動子。

調(diào)控模式與lacUV5相似，但mRNA轉(zhuǎn)錄水平更高于

trp和lacUV5

啟動子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有較高基因表達水平的情況下，選用tac啟動子比用lacUV5啟動子更優(yōu)越。lac、tac啟動子對宿主菌的要求

在普通大腸桿菌中，LacI阻遏蛋白僅能滿足細胞染色體上lac操縱子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的需要。

當(dāng)多拷貝的lacO隨著帶有l(wèi)acUV5、tac啟動子的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌后，LacI阻遏蛋白與lacO的比例顯著下降，無法保證每一個lacO都能獲得足夠的LacI阻遏蛋白參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。表現(xiàn)為在無誘導(dǎo)物存在的情形下，lacUV5、tac啟動子有較高的本底轉(zhuǎn)錄。lac、tac啟動子對宿主菌的要求為了使以Lac、Tac表達系統(tǒng)具有嚴緊調(diào)控外源基因轉(zhuǎn)錄的能力，一種能產(chǎn)生過量的LacI阻遏蛋白的lacI基因的突變體lacIq

被應(yīng)用于表達系統(tǒng)。大腸桿菌JM109等菌株的基因型均為lacIq，常被選用為Lac、Tac表達系統(tǒng)的宿主菌。

但是這些菌株也只能對低拷貝的表達載體實現(xiàn)嚴緊調(diào)控，在使用高拷貝復(fù)制子構(gòu)建表達載體時，仍能觀察到較高水平的本底轉(zhuǎn)錄。

需在表達載體中插入lacIq

基因以保證有較多的LacI阻遏蛋白產(chǎn)生。lac、tac表達系統(tǒng)存在的問題

IPTG用于誘導(dǎo)lac、tac啟動子的轉(zhuǎn)錄，但由于IPTG本身具有一定的

毒性。從安全角度，對表達和制備用于醫(yī)療目的的重組蛋白并不適合。

一些國家規(guī)定在生產(chǎn)人用重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)工藝中不能使用IPTG

解決方法lac和tac啟動子的轉(zhuǎn)錄受溫度嚴緊調(diào)控乳糖替代IPTG誘導(dǎo)lac和tac啟動子的轉(zhuǎn)錄lac、tac表達系統(tǒng)存在的問題lac和tac啟動子的轉(zhuǎn)錄受溫度嚴緊調(diào)控

把阻遏蛋白LacI的溫度敏感突變體lacI(ts)、lacIq(ts)插入表達載體或整合到染色體后，均能使lac和tac啟動子的轉(zhuǎn)錄受到溫度嚴緊調(diào)控在較低溫度（30℃）時抑制，在較高溫度（42℃）時開放。用乳糖替代IPTG誘導(dǎo)lac和tac啟動子的轉(zhuǎn)錄乳糖在b-半乳糖苷酶作用下生成異乳糖，異乳糖具有誘導(dǎo)劑的作用這一過程涉及乳糖的轉(zhuǎn)運和轉(zhuǎn)化，其效率受到多種因素的影響和制約因此乳糖誘導(dǎo)的有效劑量大大高于IPTG。乳糖本身作為一種碳源可以被大腸桿菌代謝利用，較多的乳糖存在也會導(dǎo)致菌體生理及生長特性變化。乳糖替代lPTG作為誘導(dǎo)劑的研究要與發(fā)酵工藝結(jié)合起來，才能顯示其良好的前景。轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理色氨酸啟動子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底狀態(tài)。在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的細菌培養(yǎng)體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因工程中往往添加IAA誘導(dǎo)Ptrp介導(dǎo)的目的基因表達啟動子Trp表達系統(tǒng)以大腸桿菌trp操縱子調(diào)控機理為基礎(chǔ)設(shè)計、構(gòu)建的表達系統(tǒng)

Trp表達系統(tǒng)

Ptrp

OtrpRNA聚合酶基底水平轉(zhuǎn)錄高效轉(zhuǎn)錄mRNA

Ptrp

Otrp去除色氨酸高效轉(zhuǎn)錄mRNA

Ptrp

Otrp加入IAARNA聚合酶RNA聚合酶PL

和PR

表達系統(tǒng)

以l噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動子PL、PR

為核心構(gòu)建的表達系統(tǒng)

在野生型l噬菌體中，PL、PR

啟動子轉(zhuǎn)錄與否決定了l噬菌體進入裂解循環(huán)還是溶源循環(huán)。啟動子PL

和PR

表達系統(tǒng)

轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機理由l噬菌體PE啟動子控制的cI基因的產(chǎn)物是PL、PR啟動子轉(zhuǎn)錄的阻遏物。cI基因的產(chǎn)物在大腸桿菌宿主中的濃度取決于一系列宿主與噬菌體因子之間的錯綜復(fù)雜的平衡關(guān)系。由于通過細胞因子來控制cI

基因產(chǎn)物的產(chǎn)生和消失是相當(dāng)困難的。

因此PL、PR表達系統(tǒng)都選用溫度敏感突變體cI857(ts)的基因產(chǎn)物來調(diào)控PL、PR啟動子的轉(zhuǎn)錄。

在較低溫度（30℃）時以活性形式存在在較高溫度（42℃）時失活脫落PL和PR

表達系統(tǒng)宿主菌中沒有cI基因產(chǎn)物，PL、PR啟動子的高強度直接轉(zhuǎn)錄，帶有PL

或PR啟動子的表達載體在普通大腸桿菌中相當(dāng)不穩(wěn)定。

對宿主菌的要求

用溶源化l噬菌體的大腸桿菌作PL、PR啟動子表達載體的宿主菌N4830-1，POP2136等菌株已經(jīng)溶源化cI857(ts)

l噬菌體，可用作表達外源基因時的宿主菌。

把cI857(ts)

基因組裝在表達載體上宿主菌選擇范圍更大PL和PR表達系統(tǒng)存在的問題

由于PL和PR表達系統(tǒng)誘導(dǎo)時不加化學(xué)誘導(dǎo)劑，成本又低廉，最初幾個在大腸桿菌中制備的藥用重組蛋白質(zhì)都采用PL或PR表達系統(tǒng)。

缺陷在熱脈沖誘導(dǎo)過程中，大腸桿菌熱休克蛋白的表達也會被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表達的重組蛋白。在大體積發(fā)酵培養(yǎng)菌體時，通過熱平衡交換方式把培養(yǎng)溫度從30℃提高到42℃需要較長的時間，這種緩慢的升溫方式影響誘導(dǎo)效果，對重組蛋白表達量有一定的影響。

T7表達系統(tǒng)大腸桿菌T7噬菌體具有一套專一性非常強的轉(zhuǎn)錄體系，利用這一體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達系統(tǒng)稱為T7表達系統(tǒng)。T7表達系統(tǒng)T7噬菌體基因1編碼的T7RNA聚合酶選擇性的激活T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄。

T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉(zhuǎn)錄的序列。

在細胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵體啟動子的情形下，大腸桿菌宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競爭不過T7噬菌體轉(zhuǎn)錄體系，最終受T7噬菌體啟動子控制的基因的轉(zhuǎn)錄達到很高的水平。T7表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機理

T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄完全依賴于T7RNA聚合酶，因此T7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式就決定了表達系統(tǒng)的調(diào)控方式。

化學(xué)誘導(dǎo)型溫度誘導(dǎo)型雙質(zhì)粒系統(tǒng)T7RNA聚合酶T7啟動子目的基因

T7RNA聚合酶基因？啟動子T7表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機理

化學(xué)誘導(dǎo)型噬菌體DE3是l噬菌體的衍生株，一段含有l(wèi)acI、lacUV5啟動子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其int基因中

用噬菌體DE3的溶源菌作為表達載體的宿主菌，調(diào)控方式為

化學(xué)誘導(dǎo)型，類似于Lac表達系統(tǒng)。

T7RNA聚合酶基因

lac

啟動子E.Coli（DE3）T7啟動子

目的基因T7RNA聚合酶IPTG誘導(dǎo)T7表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機理

溫度誘導(dǎo)型PL

啟動子控制T7RNA聚合酶基因，通過熱誘導(dǎo)方式激發(fā)T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄。

這種方式可以使本底轉(zhuǎn)錄降到很低的水平，尤其適用于表達對大腸桿菌宿主有毒性的重組蛋白質(zhì)。

T7RNA聚合酶基因PL

啟動子E.Coli（CE6）T7啟動子

目的基因T7RNA聚合酶熱誘導(dǎo)cI857T7表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機理

雙質(zhì)粒系統(tǒng)一個質(zhì)粒帶有T7RNA聚合酶基因，另一個質(zhì)粒帶有T7啟動子和目的基因

兩個質(zhì)粒的復(fù)制子和抗性標記不能相同調(diào)控方式為控制T7RNA聚合酶的啟動子調(diào)控類型T7RNA聚合酶熱誘導(dǎo)T7啟動子

目的基因

T7RNA聚合酶基因

PL

啟動子

cI857

p15Aori

KanRColE1ori

AmpRT7表達系統(tǒng)存在的問題

T7表達系統(tǒng)表達目的基因的水平是目前所有表達系統(tǒng)中最高的，但也不可避免出現(xiàn)在相對較高的本底轉(zhuǎn)錄，如果目的基因產(chǎn)物對大腸桿菌宿主有毒性，會影響細胞的生長。

解決辦法之一

在表達系統(tǒng)中低水平表達T7溶菌酶基因。因為T7溶菌酶除了作用于大腸桿菌細胞壁上肽聚糖外，還能與T7RNA聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄的活性。目前T7溶菌酶基因都通過共轉(zhuǎn)化質(zhì)拉導(dǎo)入表達系統(tǒng)，它能明顯降低本底轉(zhuǎn)錄，但對誘導(dǎo)后目的基因的表達水平無明顯影響。營養(yǎng)調(diào)控型采用大腸桿菌堿性磷酸酯酶基因

phoA啟動子或甘油3’-磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)ugp

啟動子構(gòu)建表達載體。

這兩個啟動子受在培養(yǎng)基中的無機磷（Pi）濃度調(diào)控（Pi﹥5mmol/L時抑制，Pi﹤1mmol/L時激活)，具有較高的轉(zhuǎn)錄水平。其他表達系統(tǒng)

糖原調(diào)控型采用的有大腸桿菌半乳糖轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（mglBAEC)mgl啟動子或沙門氏菌阿拉伯糖基因araB啟動子構(gòu)建表達載體。

這兩個啟動子受葡萄糖抑制，巖藻糖和阿拉伯糖是它們的誘導(dǎo)物。其調(diào)控機理類似于Lac表達系統(tǒng).其他表達系統(tǒng)pH調(diào)控型采用大腸桿菌賴氨酸脫羧酶基因cadA

啟動子構(gòu)建表達載體。

cadA啟動子受培養(yǎng)基中H+濃度，即pH值調(diào)控。（在pH﹥8時抑制，pH﹤6時激活，pH=6時轉(zhuǎn)錄活力最高）。

該表達系統(tǒng)要求菌體發(fā)酵溫度控制在27～30℃之間才能使目的基因得到穩(wěn)定的表達.其他表達系統(tǒng)溶氧調(diào)控型采用大腸桿菌丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl

啟動子，硝基還原酶基因nirB啟動子或透明顫菌血紅蛋白基因

vgb

啟動子構(gòu)建表達載體。這些啟動子中都含有對氧響應(yīng)的調(diào)節(jié)因子fnr的作用位點。

在富氧條件下轉(zhuǎn)錄被抑制，在貧氧或微氧條件下轉(zhuǎn)錄被激活。其他表達系統(tǒng)溶氧調(diào)控型大腸桿菌GJ100有透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）啟動子控制下的T7RNA聚合酶基因表達質(zhì)粒，vgb基因的轉(zhuǎn)錄是受環(huán)境溶氧濃度調(diào)控的，在貧氧條件下vgb基因的啟動子被激活。

因此，用大腸桿菌GJ100作為宿主時，表達系統(tǒng)調(diào)控方式為貧氧誘導(dǎo)型，菌體發(fā)酵時的溶氧濃度可以通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量加以調(diào)節(jié)，與其他調(diào)控模式相比更適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程。其他表達系統(tǒng)生物素調(diào)控型

用大腸桿菌生物素操縱子及其調(diào)控區(qū)構(gòu)建表達載體，菌體生長過程中生物素會不斷消耗，當(dāng)濃度到達2ng/ml以下時啟動子被激活。

能夠在沒有外界的物理，化學(xué)信號的介入條件下自動誘導(dǎo)表達目的基因是這類表達載體的特點，其缺陷是不容易精確控制自動誘導(dǎo)的時刻。其他表達系統(tǒng)強化轉(zhuǎn)錄終止的必要性

外源基因在強啟動子的控制下表達，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達，其原因如下：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子mRNA所需的時間就相應(yīng)增加，外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降；如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區(qū)域，如選擇性標記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，則RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性；過長的mRNA往往會產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無謂的能量消耗；更為嚴重的是，過長的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級結(jié)構(gòu)，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率終止子強終止子的選擇與使用目前外源基因表達質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2

以及T7噬菌體DNA上的Tf。

對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強其轉(zhuǎn)錄終止作用終止子核糖體結(jié)合位點外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。大腸桿菌細胞中結(jié)構(gòu)不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達數(shù)百倍。mRNA翻譯的起始效率主要由其5‘端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點（RBS）

核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點大腸桿菌核糖體結(jié)合位點包括下列四個特征結(jié)構(gòu)要素：

位于翻譯起始密碼子上游的6–8個核苷酸序列

5’UAAGGAGG3’即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結(jié)合將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯；

翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點，有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子

SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基序列核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點對外源基因表達的影響

SD序列的影響一般來說，mRNA與核糖體的結(jié)合程度越強，翻譯的起始效率就越高，而這種結(jié)合程度主要取決于SD（UAAGGAGG）序列與16SrRNA的堿基互補性，其中以GGAG四個堿基序列尤為重要。對多數(shù)基因而言，上述四個堿基中任何一個換成C或T，均會導(dǎo)致翻譯效率大幅度降低核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點對外源基因表達的影響

SD序列與起始密碼子之間的序列的影響SD序列下游的堿基若為AAAA或UUUU，翻譯效率最高；而CCCC或GGGG的翻譯效率則分別是最高值的50%和25%。

緊鄰AUG的前三個堿基成份對翻譯起始也有影響。對于大腸桿菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在這個位置上最佳的堿基組合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，則酶的表達水平低20倍核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點對外源基因表達的影響

SD序列與起始密碼子之間的距離的影響SD序列與起始密碼子AUG

之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的P位，這是翻譯啟動的前提條件。

在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約七個堿基處，在此間隔中少一個堿基或多一個堿基，均會導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點對外源基因表達的影響

起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響大腸桿菌中的起始tRNA分子可以同時識別AUG、GUG和UUG三種起始密碼子，但其識別頻率并不相同，通常GUG為AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。

除此之外，從AUG開始的前幾個密碼子堿基序列也至關(guān)重要，至少這一序列不能與mRNA的

5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便會嚴重干擾mRNA在核糖體上的準確定位

目前廣泛用于外源基因表達的大腸桿菌表達型質(zhì)粒上，均含有與啟動子來源相同的核糖體結(jié)合位點序列，序列和間隔是最佳的。核糖體結(jié)合位點不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性，其決定因素是：生物基因組中的堿基含量在富含AT的生物（如單鏈DNA噬菌體φX174）基因組中，密碼子第三位上的U和A出現(xiàn)的頻率較高；在GC豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有G或C的簡并密碼子占90%以上的絕對優(yōu)勢密碼子與反密碼子相互作用的自由能性中等強度規(guī)律如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多細胞內(nèi)tRNA的含量密碼子生物體對密碼子的偏愛性密碼子密碼子偏愛性對外源基因表達的影響

由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。

一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細胞中獲得最佳表達：

外源基因全合成同步表達相關(guān)tRNA編碼基因質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)?？截悢?shù)對細菌生長代謝的影響目前實驗室里廣泛使用的表達型質(zhì)粒在每個大腸桿菌細胞中可達數(shù)百甚至上千個拷貝，質(zhì)粒的擴增過程通常發(fā)生在受體細胞的對數(shù)生長期內(nèi)，而此時正是細菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達勢必會影響受體細胞的生長代謝，進而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達水平的下降

解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴增納入可控制的軌道

外源基因在大腸桿菌中的表達蛋白質(zhì)的合成是在細胞之中進行的目標蛋白在細胞質(zhì)中表達的主要優(yōu)點是：表達質(zhì)粒的構(gòu)建比較簡單；能夠達到很高的目標蛋白表達量，一般可以達到占細胞總蛋白的20%～40%。目標蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)表達的形式有二種：

在細胞內(nèi)表現(xiàn)為不溶性的包涵體顆粒

包涵體存在于大腸桿菌細胞質(zhì)中

在細胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì)

可溶性的目標蛋白質(zhì)除可存在于細胞質(zhì)中外，還可借助于本身的功能序列和大腸桿菌蛋白質(zhì)加工、運輸體系，最終分泌到周質(zhì)空間，或外泌到培養(yǎng)液中。大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略

包涵體型異源蛋白的表達分泌型異源蛋白的表達融合型異源蛋白的表達寡聚型異源蛋白的表達整合型異源蛋白的表達蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構(gòu)建外源基因在大腸桿菌中的表達包涵體及其性質(zhì)在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（InclusionBodies，IB）。富含蛋白質(zhì)的包涵體多見于生長在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質(zhì)往往會喪失其理化特性和生物功能，從而集聚形成包涵體。由高效表達質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細菌細胞內(nèi)。除此之外，包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子包涵體型異源蛋白的表達以包涵體形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點

包涵體表達形式的優(yōu)點在一定程度上保持表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定能夠避免細胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標蛋白的富集

簡化外源基因表達產(chǎn)物的分離操作包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來

能夠表達對大腸桿菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標蛋白。包涵體型異源蛋白的表達以包涵體形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點

包涵體表達形式的缺點以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對目標產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。

經(jīng)過復(fù)性處理的目標蛋白不一定能完全恢復(fù)原來的生物學(xué)活性，有時甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其當(dāng)目標蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)?，一般不超過30%

復(fù)性處理工藝可使目標蛋白的制備成本上升。包涵體型異源蛋白的表達包涵體的變性與復(fù)性操作包涵體的溶解與變性包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是拆開錯配的二硫鍵和次級鍵。在人工條件下，使包涵體溶解并重新進入復(fù)性途徑中。

能有效促進包涵體溶解變性的試劑和條件包括：

清洗劑SDS、正十二醇肌氨酸，廉價，但影響復(fù)性和純化

促溶劑鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發(fā)形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應(yīng)

混合溶劑如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強

極端pH廉價，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng)包涵體型異源蛋白的表達包涵體的變性與復(fù)性操作

包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）包涵體的復(fù)性與重折疊的主要任務(wù)：將多肽鏈中被拆開的游離巰基重新折疊通過次級鍵的形成使蛋白質(zhì)復(fù)性包涵體型異源蛋白的表達在細胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì)目標蛋白以可溶性蛋白質(zhì)形式表達雖然可以避免包涵體復(fù)性帶來的問題，但是也有一定的缺陷，主要表現(xiàn)為大腸桿菌本身存在于細胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)往往只含有少量的，甚至沒有半胱氨酸殘基。富含半胱氨酸殘基，需要形成二硫鍵的蛋白質(zhì)大部份被轉(zhuǎn)運到細胞的其他部位。

分泌型異源蛋白的表達

這是因為大腸桿菌細胞質(zhì)微環(huán)境的氧化還原態(tài)勢不利于蛋白質(zhì)二硫鍵的形成，而且缺少一種形成二硫鍵所必須的體系。一些需要通過二硫鍵的形成來維持其構(gòu)象的目標蛋白在大腸桿菌的細胞質(zhì)中往往不能正確折疊。解決這一問題的途徑之一是用大腸桿菌氧硫還蛋白還原酶基因trxB缺陷株作為宿主菌表達目標蛋白。研究表明trxB缺陷株細胞質(zhì)的氧化還原態(tài)勢發(fā)生了變化，蛋白質(zhì)在trxB缺陷株的細胞質(zhì)中能夠形成二硫鍵。這一菌株對于表達結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)而言是一·個相當(dāng)重要的工具。分泌型異源蛋白的表達在細胞質(zhì)中直接表達不帶有前導(dǎo)序列的成熟蛋白質(zhì)

在細胞質(zhì)中直接表達不帶有前導(dǎo)序列的成熟蛋白質(zhì)需要起始密碼，通常為編碼甲硫氨酸的ATG。⑴在多數(shù)情況下，N端附加的甲硫氨酸對蛋白質(zhì)的性質(zhì)沒有特別的影響，但是也有附加的甲硫氨酸嚴重影響蛋白質(zhì)生物學(xué)活力的報道。⑵另外，附加的甲硫氨酸也可能改變蛋白質(zhì)的免疫性質(zhì)和藥理性質(zhì)。從制備用于醫(yī)療目的的蛋白質(zhì)的角度來看，這是一個需要引起重視的問題。

去除附加的甲硫氨酸有二種方法：

⑴在表達系統(tǒng)中共表達甲硫氨酸氨肽酶基因。⑵在分離純化后在體外用外肽酶處理。但它們都對與甲硫氨酸相鄰的氨萊酸殘基類型有一定要求，因此在使用上有一定的限制。目標蛋白與有親合配基的序列融合表達

與純化包涵體相比，細胞質(zhì)中以可溶性形式表達蛋白質(zhì)的分離純化過程比較復(fù)雜，一般要通過親合層析才能達到比較高