基因工程制藥-基因工程制藥實例

生物制藥工藝課程干擾素的基因工程制藥1什么是干擾素概念(interferon,IFN)：機體免疫細胞產(chǎn)生的一類細胞因子，是機體受到病毒感染時，免疫細胞通過抗病毒應答反應而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能接近的生物調(diào)節(jié)蛋白。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異分為α、β、γ、ω等4個類型。1.1天然干擾素的分類

1.根據(jù)來源、基因序列和氨基酸組成分類

◆

I型干擾素：IFNα、IFNβ、IFNτ、IFNω

來源：白細胞、成纖維細胞、病毒感染的組織細胞等功能：抗病毒感染、抗腫瘤生長、免疫調(diào)節(jié)(較弱）

其中IFN-α為多基因產(chǎn)物，有23種以上的亞型。

◆

II型干擾素：干擾素γ（IFN)

來源：活化的T細胞和NK細胞產(chǎn)生

功能：免疫調(diào)節(jié)

提高單核巨噬細胞、樹突狀細胞的抗原提呈能力

增強Tc細胞和NK細胞的殺傷活性

抑制TH2細胞形成，下調(diào)體液免疫應答

趨化作用

抗病毒和抗腫瘤作用（次要）

2.

根據(jù)動物來源確定分類

人干擾素（HuIFN），小鼠干擾素（MuIFN）。不同來源的干擾素1.2重組干擾素的臨床應用廣譜抗病毒活性（rhuIFNα）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。直接抗腫瘤活性（rhuIFNα）毛細胞和慢性髓樣白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫調(diào)節(jié)活性——治療慢性肉芽腫瘤（rhuIFNγ）多發(fā)性硬化癥rhuIFNβ2基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝干擾素生產(chǎn)工藝路線上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；

1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；

2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys

表達產(chǎn)物：無糖基化，N-met，無活性包涵體工藝特點：發(fā)酵過程，隨后變性、復性過程?；蚬こ檀竽c桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:目的基因的分離克隆載體目的基因與克隆載體的體外重組→重組體導入大腸桿菌K12→受體菌的培養(yǎng)及篩選→從受體菌中獲取目的基因表達載體重組質(zhì)粒導入大腸桿菌受體菌的篩選，表達性、穩(wěn)定性等檢測工程菌→基因工程菌的制備一、目的基因的分離與擴增1.破碎細胞，用Trizol法提取總的RNA2.將生產(chǎn)干擾素的人白細胞的mRNA分級分離然后進行凝膠電泳切取目的基因片段3.用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄，把總mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA4.以cDNA為模板、干擾素引物為引物，PCR，得到完全的干擾素基因的PCR產(chǎn)物5.人工加尾形成“粘性末端”二、構(gòu)建重組質(zhì)粒1.提取載體（質(zhì)粒、病毒等），雙酶切，再把干擾素基因的PCR產(chǎn)物用相應的酶酶切，用連接酶連接EcoRIBamHIEcoRIBamHI2.連接完成后分離純化，測序，與原干擾素序列比對。3.鑒定序列無誤后，導入受體細胞，篩選三、重組體引入宿主細胞

將cDNA克隆到含有四環(huán)素、氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，重組的載體DNA分子在一定條件下轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，形成攜帶質(zhì)粒的菌株。四、受體菌的篩選

由于質(zhì)粒重組時有3種基本方式，即：目的基因與克隆載體重組，目的基因片段與目的基因片段重組，克隆載體與克隆載體重組；另外重組過程可能會發(fā)生基因突變情況五、分析保存

對基因工程大腸桿菌進行評價分析，并保存菌種。干擾素的發(fā)酵工藝過程啟開種子制備種子液發(fā)酵培養(yǎng)粗提精提半成品制備半成品檢定分裝凍干成品檢定成品包裝1．菌種培養(yǎng)

取－70℃下保存的甘油管菌種（工作種子批），于室溫下融化。然后，接入搖瓶，培養(yǎng)溫度30℃，pH7.0，250r/min活化培養(yǎng)18±2小時后，進行吸光值測定和發(fā)酵液雜菌檢查。2．種子罐培養(yǎng)

將已活化的菌種接入裝有30L培養(yǎng)基的種子罐中，接種量10%，培養(yǎng)溫度30℃，pH7.0，級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧為30%，培養(yǎng)3～4小時，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，同時取樣發(fā)酵液進行顯微鏡檢查和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌

3.發(fā)酵罐培養(yǎng)

將種子液通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量10%，培養(yǎng)溫度30℃，pH7.0。級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧30%，培養(yǎng)4小時。然后控制培養(yǎng)溫度20℃，pH6.0，溶解氧60%，繼續(xù)培養(yǎng)5～6.5小時。同時進行發(fā)酵液雜菌檢查，當OD值達9.0±1.0后，用5℃冷卻水快速降溫至15℃以下，以減緩細胞衰老?；蛘邔l(fā)酵液轉(zhuǎn)入收集罐中，加入冰塊使溫度迅速降至10℃以下。4.菌體收集

將已降溫的發(fā)酵液轉(zhuǎn)入連續(xù)流離心機，16000r/min離心收集。進行干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性等項目的檢測。菌體于－20℃冰柜中保存時，不得超過12個月。每保存3個月，檢查一次活性。3.干擾素的分離純化工藝過程

3.1、干擾素分離工藝過程

3.2、干擾素的純化工藝過程3.1干擾素分離工藝過程菌體裂解預處理初級分離(1)菌體裂解

裂解緩沖液：純化水配制，2℃～10℃（pH7.5）使用保護劑：EDTA，PMSF。破碎菌體：2厘米以下的碎塊攪拌：加裂解緩沖液，2℃～10℃，2hr凍融:細胞完全破裂，釋放干擾素。(2)預處理-沉淀加絮凝劑聚乙烯亞胺:2℃～10℃，攪拌45min，對菌體碎片進行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液:2℃～10℃,攪拌15min，對菌體碎片、DNA等進行沉淀。(3)離心

連續(xù)流離心機：2℃～10℃，16000r/min收集上清液：含有重組干擾素蛋白質(zhì)雜質(zhì)沉淀：121℃、30min蒸汽滅菌,焚燒處理。（4）初級分離

鹽析:硫酸銨，2℃～10℃，攪勻,靜置過夜。離心：連續(xù)流離心機，16000r/min保存：收集沉淀，粗干擾素，4℃保存。3.2、干擾素純化工藝過程溶解粗干擾素沉淀與疏水層析陰離子交換層析與濃縮陽離子交換層析與濃縮凝膠過濾層析無菌過濾分裝(1)溶解粗干擾素

配制純化緩沖液：超純水，pH7.5磷酸緩沖液，0.45μm濾器和10ku超濾系統(tǒng)，百級層流下收集。冷卻至2℃～10℃。檢查:緩沖液的pH值和電導值。溶解：2℃～10℃，勻漿，完全溶解。(2)沉淀與疏水層析等電點沉淀（1）：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心收集上清液。疏水層析：干擾素吸附在疏水層析柱中

除非疏水性蛋白

洗脫與收集：0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）等電點沉淀（2）：磷酸調(diào)節(jié)pH4.5，調(diào)節(jié)電導值40ms/cm，2℃～10℃，靜置過夜。超濾：1000ku超濾膜過濾，除去大蛋白。透析除鹽：調(diào)整溶液pH8.0，電導值，10ku超濾膜，0.005M緩沖液。(3)無菌過濾分裝0.22μm濾膜過濾干擾素溶液分裝－20℃以下的冰箱中保存。(4)檢測項目

干擾素鑒別試驗干擾素效價測定蛋白質(zhì)含量，純度測定，分子量宿主殘余蛋白、殘余DNA干擾素結(jié)構(gòu)鑒定：紫外光譜，肽譜，N端序列其他：熱原，內(nèi)毒素，殘留抗生素半成品檢定（1）效價測定

用細胞病變抑制法，以Wish細胞、VSV病毒為基本檢測系統(tǒng)，測定中必須用國家或國際參考品校準為國際單位。（2）蛋白質(zhì)含量測定福林-酚法，以中國藥品生物制品檢定所提供的標準蛋白為標準。（3）比活性效價的國際單位與蛋白質(zhì)含量的毫克數(shù)之比。（4）純度電泳純度用非還原型SDS法，銀染顯色應為單一區(qū)帶，經(jīng)掃描儀測定純度應在95%以上。（5）相對分子量測定還原型SDS，加樣量不地域微克，同時用已知相對分子量的蛋白標準系列做對照，以遷移率為橫坐標，相對分子量的對數(shù)為縱坐標作圖，計算相對分子量。與理論值比較，誤差不得高于10%。（6）殘余外源性DNA含量測定用放射性核素或生物素探針法測定，每劑量中殘余外源性DNA應低于100pg。（7）殘余血清IgG含量測定在應用抗體親和層析法作為純化方法時必須進行此項檢定。（8）殘余抗生素活性測定半成品中不應有抗生素活性存在。（9）紫外光譜掃描

檢查半成品的光譜吸收值，最大吸收值應在280±2納米。（10）肽圖測定用CNBr裂解法，測定結(jié)果應符合干擾素的結(jié)構(gòu)，且批與批之間應一致。（11）等電點測定等電聚焦電泳。（12）除菌半成品應做干擾素效價測定、無菌試驗和熱源質(zhì)試驗。成品檢定（1）物理性狀凍干品白色或微黃色疏松體，加入注射水后不得含有肉眼可見不溶物。（2）鑒別試驗應用ELISA或中和試驗檢定。（3）水分測定用卡氏法，應低于3%。（4）無菌試驗同半成品。（5）熱原質(zhì)試驗

同半成品檢定。（6）干擾素效價測定

同半成品檢定，效價不應低于標示量。（7）安全試驗

取體重為350-400克豚鼠3只，每只腹側(cè)皮下注射量為成人每千克體重臨床使用最大量的3倍，觀察7天，若豚鼠局部無紅腫、壞死、總體重不下降，說明成品合格。

取體重18-20克小鼠5只，每只尾靜脈注射劑量按人每千克體重臨床使用最大量的3倍，觀察7天，若動物全部存活，說明成品合格。4國內(nèi)基因工程藥物產(chǎn)業(yè)發(fā)展狀況

我國的生物技術(shù)藥物卻一直苦于缺乏自主創(chuàng)新的產(chǎn)品，絕大多數(shù)上市藥物為仿制藥，創(chuàng)新藥物的開發(fā)一直未能打開局面。一種新藥從研發(fā)到投放市場，投入大約為30億~60億美元。存在的問題：

（1）同種產(chǎn)品生產(chǎn)廠家過多，造成市場惡性競爭，嚴重影響產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

（2）融資渠道單一、產(chǎn)業(yè)發(fā)展資金不足。

（3）醫(yī)藥市場競爭無序，行業(yè)不正之風嚴重。

（4）企業(yè)管理相對滯后，技術(shù)兼經(jīng)營型人才匱乏。生物制藥工藝課程人胰島素的基因工程制藥胰島素概況胰島素是一種蛋白質(zhì)類激素,體內(nèi)胰島素是由胰島β細胞分泌的。在人體十二指腸旁邊，有一條長形的器官，叫做胰腺。在胰腺中散布著許許多多的細胞群，叫做胰島。胰島素是由胰島β細胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素胰島素是機體內(nèi)唯一降低血糖的激素，也是唯一同時促進糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素。作用機理屬于受體酪氨酸激酶機制人工合成胰島素的必要性胰島素這類活性蛋白多肽和細胞因子居有高度生物活性，分子量很大，立體結(jié)構(gòu)異常復雜，體外難以人工合成。所以過去糖尿病患者只能服用從牛、豬體中提取的胰島素來治療；但牛、豬胰島素結(jié)構(gòu)上與人胰島素有差別，如與豬胰島素B鏈第30個基酸殘基不同，長期服用會引起腎和眼的疾病，故必需要用基因工程方法獲得重組人胰島素進行治療。胰島素結(jié)構(gòu)胰島素由A、B兩個肽鏈組成。人胰島素A鏈有11種21個氨基酸，B鏈有15種30個氨基酸，共26種51個氨基酸組成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四個半胱氨酸中的巰基形成兩個二硫鍵，使A、B兩鏈連接起來。此外A鏈中A6(Cys)與A11(Cys)之間也存在一個二硫鍵

胰島素立體結(jié)構(gòu)胰島素的性質(zhì)

〖化學本質(zhì)〗蛋白質(zhì)

〖分子式〗C257H383N65O77S6

〖分子量〗5807.69

〖性狀〗白色或類白色的結(jié)晶粉末

〖熔點〗233℃（分解）

〖比旋度〗-64°±8°(C=2,0.003mol/LNaOH)

〖溶解性〗在水、乙醇、氯仿或乙醚中幾乎不溶；在礦酸（無機酸）或氫氧化堿溶液中易溶

〖酸堿性〗兩性，等電點pI5.35-5.45

胰島素的英文縮寫，INS.（insulin）胰島素的發(fā)現(xiàn)

胰島素于1921年由加拿大人F.G.班廷和C.H.貝斯特首先發(fā)現(xiàn)

1955年英國F.桑格小組測定了牛胰島素的全部氨基酸序列1965年9月17日，中國科學家人工合成了具有全部生物活力的結(jié)晶牛胰島素，它是第一個在實驗室中用人工方法合成的蛋白質(zhì)

胰島細胞根據(jù)其分泌激素的功能分為以下幾種：

①B細胞(β細胞)，約占胰島細胞的60%～80%，分泌胰島素，胰島素可以降低血糖。②A細胞(α細胞)，約占胰島細胞的24%～40%，分泌胰升糖素，胰升糖素作用同胰島素相反，可增高血糖。③D細胞，約占胰島細胞總數(shù)的6%～15%，分泌生長激素抑制激素。

胰島素生物合成胰島素生物合成的控制基因在第11對染色體短臂上。在β細胞的細胞核中，第11對染色體短臂上胰島素基因區(qū)DNA向mRNA轉(zhuǎn)錄，mRNA從細胞核移向細胞漿的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，轉(zhuǎn)譯成由105個氨基酸殘基構(gòu)成的前胰島素原。前胰島素原經(jīng)過蛋白水解作用除其前肽，生成86個氨基酸組成的長肽鏈——胰島素原。胰島素原隨細胞漿中的微泡進入高爾基體，經(jīng)蛋白水解酶的作用，切去31、32、60三個精氨酸連接的鏈，斷鏈生成沒有作用的C肽，同時生成胰島素，分泌到β細胞外，進入血液循環(huán)中。未經(jīng)過蛋白酶水解的胰島素原，一小部分隨著胰島素進入血液循環(huán)胰島素的分類

動物胰島素：從豬和牛的胰腺中提取，兩者藥效相同，但與人胰島素相比，豬胰島素中有1個氨基酸不同，牛胰島素中有3個氨基酸不同，因而易產(chǎn)生抗體半合成人胰島素：將豬胰島素第30位丙氨酸，置換成與人胰島素相同的蘇氨酸，即為半合成人胰島素生物合成人胰島素：利用生物工程技術(shù)，獲得的高純度的生物合成人胰島素，其氨基酸排列順序及生物活性與人體本身的胰島素完全相同怎樣獲得人的胰島素基因？怎樣將目的基因?qū)氲绞荏w細胞中？怎樣將重組質(zhì)粒導入到受體細胞中？目的基因是否在受體細胞中表達？4123一、提取目的基因基因的剪刀——限制性內(nèi)切酶作用與特性：一種酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的內(nèi)切點切割DNA分子。重播限制性內(nèi)切酶既從人的DNA中提取胰島素基因,可使用限制性內(nèi)切酶將目的基因從原DNA中分離。

二、提取質(zhì)粒使用細胞工程,培養(yǎng)大腸桿菌，從大腸桿菌的細胞質(zhì)中提取質(zhì)粒，質(zhì)粒為環(huán)狀。

質(zhì)?！虻倪\載工具質(zhì)粒是真核細胞細胞核外或原核生物擬核區(qū)外能夠進行自主復制的遺傳單位，包括真核生物的細胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細菌細胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸(DNA)分子。（部分為RNA）現(xiàn)在習慣上用來專指細菌(大腸桿菌）、酵母菌和放線菌等生物中細胞核或擬核中的DNA以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。許多細菌除了擬核中的DNA外，還有大量很小的環(huán)狀DNA分子

三、基因重組取出目的基因與質(zhì)粒，先利用同種限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒切開，再使用DNA連接酶將目的基因與質(zhì)粒"縫合"，形成一個能表達出胰島素的DNA質(zhì)粒。基因的針線──DNA連接酶

DNA被限制酶切斷后有兩個反向互補的“黏性末端”。被同一種限制切斷的幾個DNA具有相同的黏性末端，能夠通過互補進行配對。

連接酶的作用是：將互補配對的兩個黏性末端連接起來，使之成為一個完整的DNA分子。重播四、將質(zhì)粒送回大腸桿菌

為獲得目的基因的表達產(chǎn)物時，通常以大腸桿菌等無害易得的細菌為受體。為使重組的DNA分子更容易進入受體細胞，常還要用一些物質(zhì)（含有Ca++的物質(zhì)，如CaCl2

）對受體細胞進行處理，使受體細胞具有更大的通透性。導入擴增將質(zhì)粒送回大腸桿菌在大腸桿菌的培養(yǎng)液中加入含有Ca++的物質(zhì)，如CaCl2，這使細胞會吸收外源基因。此時將重組的質(zhì)粒也放入培養(yǎng)液中，大腸桿菌便會將重組質(zhì)粒吸收。CaCl2法的作用機理