第十章酶學(xué)和酶工程研究今后的方向、進(jìn)展、熱點問題

酶學(xué)和酶工程研究今后的

方向、進(jìn)展、熱點問題

二十一世紀(jì)是生物學(xué)世紀(jì)，將在生物學(xué)領(lǐng)域有所發(fā)明，有所發(fā)現(xiàn)。

在酶學(xué)和酶工程領(lǐng)域會有哪些進(jìn)展呢？在21世紀(jì)國際酶學(xué)和酶工程若干熱點和前沿課題的研討會上科學(xué)家提供了一些觀點，值得提供給大家。一、基因工程和蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用 有關(guān)基因工程在酶工程領(lǐng)域的研究文章大量涌現(xiàn)。 運(yùn)用基因工程技術(shù)可以有什么好處？

改善原有酶的各種性能， 1.如提高酶的產(chǎn)量、 2.增加酶的穩(wěn)定性、 3.使酶適應(yīng)低溫環(huán)境、 4.提高酶在有機(jī)溶劑中的反應(yīng)效率、 5.使酶在后提取工藝和應(yīng)用過程中更容易操作等， 6.運(yùn)用基因工程技術(shù)也可以將原來有害的;未經(jīng)批準(zhǔn)的微生物產(chǎn)生的酶的基因;

7.或由生長緩慢的動植物產(chǎn)生的酶的基因，克隆到安全 的、生長迅速的、產(chǎn)量很高的微生物體內(nèi)，改由微 生物來生產(chǎn)。 8.運(yùn)用基因工程技術(shù)還可以通過增加編碼該酶的基因的拷貝數(shù)，來提高微生物產(chǎn)生的酶的數(shù)量．這一原理已成功地應(yīng)用于酶制劑的工業(yè)生產(chǎn)． 目前，世界上最大的工業(yè)酶制劑生產(chǎn)廠商丹麥諾維信公司，由原諾和諾德公司酶制劑部獨立而成)．生產(chǎn)酶制劑的菌種約有80%是基因工程菌 由基因工程發(fā)展起來的蛋白質(zhì)工程更加吸引人們的廣泛關(guān)注。在興起之初，主要采用定點突變技術(shù)，

對天然酶蛋白進(jìn)行改造，已經(jīng)取得很多成果。例如，將T4溶菌酶的第51位蘇氨酸轉(zhuǎn)變成脯氨酸，使該酶對ATP的親和力增強(qiáng)，酶活力提高了25倍。但定點突變技術(shù)只能對天然酶蛋白中某些氨基酸殘基進(jìn)行替換，酶蛋白的高級結(jié)構(gòu)基本維持不變，因此對酶的功能的改造非常有限． 不過，如果通過多代遺傳將突變積累起來，也可以較好地拓展酶的功能。

近來，Arndd利用所謂“定向酶進(jìn)化”技術(shù)，在試管中模擬達(dá)爾文進(jìn)化論的關(guān)鍵過程。先進(jìn)行無序突變和重組，繼而進(jìn)行篩選，再通過多代遺傳，可以大大改進(jìn)和拓展酶的功能。 近來國際上又提出酶蛋白全新設(shè)計的概念。

眾所周知，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)由其氨基酸的序列控制，而其功能又與結(jié)構(gòu)密切有關(guān)。據(jù)計算，300個氨基酸可以組成10390種不同序列的蛋白質(zhì)。而從生物出現(xiàn)以來，自然界估計有1055種蛋白質(zhì)．即絕大多數(shù)新序列和新功能的蛋白質(zhì)或酶，在許多億年的生物進(jìn)化過程中還沒有出現(xiàn)過或者沒有研究過的酶，有待我們?nèi)ラ_發(fā)和創(chuàng)造．

基因工程的飛速發(fā)展，我們可以通過研究能夠獲得自然界原先并不存在的、具有全新結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)．同樣，這一項新技術(shù)也可以用于組建自然界原先并不存在的、結(jié)構(gòu)和功能全新酶蛋白。在確定設(shè)計目標(biāo)后，先根據(jù)一定規(guī)則產(chǎn)生初始序列，經(jīng)過結(jié)構(gòu)預(yù)測和構(gòu)建模型，對序列進(jìn)行初步的修改，然后進(jìn)行基因表達(dá)或多肽合成，再經(jīng)結(jié)構(gòu)檢測，確定是否與原定目標(biāo)相符。并根據(jù)檢測結(jié)果，指導(dǎo)進(jìn)一步的設(shè)計。盡管目前對蛋白質(zhì)全新設(shè)計的理論基礎(chǔ)，即蛋白質(zhì)折疊規(guī)律的認(rèn)識還不夠深入，蛋白質(zhì)全新設(shè)計還處在探索階段，但定，其應(yīng)用前景非常誘人，值得深入探索和研究二、酶在環(huán)境治理方面的應(yīng)用研究 當(dāng)前，環(huán)境污染己經(jīng)成為制約人類社會發(fā)展的重要因素．我國每年排出大量廢水(416億噸)廢氣和煙塵(2000萬噸)，以及固體廢棄物(1000億噸)，污染規(guī)模達(dá)到相當(dāng)嚴(yán)重的地步．美國也有大量土地、淡水和海水區(qū)域被污染。據(jù)估計，僅治理被污染的土地一項，就耗資巨大。

原先人們常用的化學(xué)方法和物理方法，己經(jīng)很難達(dá)到完全清除污染物的目的。

微生物在環(huán)境治理方面發(fā)揮了十分巨大的作用，最常用、最成熟的活性污泥廢水處理技術(shù)，就是依靠了微生物的作用、同樣，各種微生物酶能夠分解糖類、脂肪、蛋白質(zhì)，纖維素、木質(zhì)素;環(huán)烴、芳香烴、有機(jī)磷農(nóng)藥、氰化物、某些人工合成的聚合物等，正成為環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域研究的一個熱點課題．三、人工合成酶和模擬酶

酶的高度催化活性以及酶在工業(yè)上應(yīng)用帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益，促使人們研究人工合成的酶型催化劑．

通常，人們將人工合成時具有類似酶活性的聚物稱之為人工合成酶。

人工合成酶在結(jié)構(gòu)上必具有兩個特殊部位，即一個是底物結(jié)合位點，一是催化位點。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建底物結(jié)合位點比較容易，而構(gòu)建催化位點比較困難．兩個位點可以分設(shè)計。

但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果人工合成酶有一個反應(yīng)過渡態(tài)的結(jié)合位點，則該位點常常會同時具有結(jié)合位點和催化位點的功能．人工合成酶通常也遵循Michaelis-Menten方程，例如高分子聚合物聚-4-乙烯基吡啶-烷化物，具有糜蛋白酶的功能，含輔基或不含輔基的高分子聚合物，具有氧化還原酶、參與光合作用的酶和各種水解酶等功能。

在“模擬酶”方面，固氮酶的模擬最令人矚目。人們從天然固氮酶由鐵蛋白和鐵鉬蛋白兩種成分組成得到啟發(fā)，提出了多種固氮酶模型。

如過渡金屬(鐵、鈷、鎳等)的氮絡(luò)合物，過渡金屬(釩、鈦等）的氮化物，石墨絡(luò)合物，過渡金屬的氨基酸絡(luò)合物等;此外，利用銅、鐵、鈷等金屬的絡(luò)合物，可以模擬過氧化氫酶等． 近來，國際上又發(fā)展起一種分子壓印技術(shù)，又稱為生物壓印(bidimprinting)技術(shù)。該技術(shù)可以借助模板在高分子物質(zhì)上形成特異的識別位點和催化位點。目前，此項技術(shù)已經(jīng)獲得廣泛的應(yīng)用。例如，模擬酶可用于催化反應(yīng)，分子壓印的聚合物可用作特制的分離材料，

抗體和受體結(jié)合位點的模擬物可用于識別和檢測系統(tǒng)，分子壓印的聚合物可用作生物傳感器的識別單元。 有專家在演講中介紹了人工合成酶在氧化還原反應(yīng)方面的進(jìn)展。他將天然酶和人工合成酶置于膜反應(yīng)器內(nèi)，比較了二者在連續(xù)氧化還原反應(yīng)系統(tǒng)中的反應(yīng)能力。 轉(zhuǎn)換頻率 空間時間產(chǎn)率天然酶 高低人工合成酶． 低 高在使用有機(jī)溶劑和各式各樣不同的底物方面，人工合成酶也要比天然酶優(yōu)越得多．四.核酸酶抗體酶 近年來，人們發(fā)現(xiàn)去除蛋白質(zhì)的RNA和DNA也具有催化功能，1982年Cech發(fā)現(xiàn)四膜蟲的26SrRNA的前體，在沒有蛋白質(zhì)存在的情況下，能夠進(jìn)行內(nèi)含子的自我剪接，形成成熟的rRNA，證明RNA分子具有催化功能，并將其稱為核酸酶,也有人稱為核酶)。1995年Cuenoud又發(fā)現(xiàn)某些DNA分子也具有催化功能，改變了只有蛋白質(zhì)才能有催化功能的傳統(tǒng)觀念，也為先有核酸，后有蛋白質(zhì)，提供了進(jìn)化的證據(jù)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)核酸酶是一種多功能的生物催化劑，不僅可以作用于RNA和DNA，而且還可以作用于多糖、氨基酸酯等底物。核酸酶還可以同時具有信使編碼功能和催化功能，實現(xiàn)遺傳信息的復(fù)制轉(zhuǎn)錄和翻譯，是生命進(jìn)化中最簡單．最經(jīng)濟(jì)最原始的、催化核酸自身復(fù)制、加工的方式。 核酸酶具有核苷酸序列的高度專一性．這種專一性使核酸酶具有很大的應(yīng)用價值。只要知道某種核酸的核苷酸序列，就可以設(shè)計并合成出催化其自我切割和斷裂的核酸酶。

我們知道，動植物病毒的基因組由核酸組成． 根據(jù)這些基因組的全部序列，就可設(shè)計并合成出防治一些病毒引起的人、畜和植物病毒病的核酸酶。例：能夠防治流感、肝炎及滋病和煙草花葉病等．核酸酶也可以用來治療某些遺傳病和癌癥。 核酸酶還可以用作研究核酸圖譜和基因表達(dá)的工具。一般說來，人工合成的模擬酶與天然酶的催化效率相差較大，且反應(yīng)類型大都為水解反應(yīng)。

人們從酶與底物過渡態(tài)中間物是酶催化過程中的關(guān)鍵一步得到啟發(fā)，結(jié)合到抗原引起生物體內(nèi)抗體的合成，以及抗原和抗體的緊密結(jié)合，設(shè)想考慮利用抗原抗體相互作用原理來模擬酶的催化作用。人們設(shè)想以一些底物過渡態(tài)中間物的類似物作半抗原，誘導(dǎo)合成與其結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的相應(yīng)抗體，試圖得到能夠催化上述物質(zhì)進(jìn)行活性反應(yīng)的酶。1986年這種努力在實驗室里獲得了成功，為人工合成酶和模擬酶，開創(chuàng)了一條嶄新的途徑。人們將這種具有催化活性的抗體稱為抗體酶)，又稱催化抗體。

抗體酶在本質(zhì)上是免疫球蛋白，人們在其易變區(qū)賦予了酶的催化活性?？贵w是目前已知的最大的多樣性體系，但無催化活性。而抗體酶則具有較高的催化活性。制備抗體酶的方法主要有誘導(dǎo)法、 拷貝法、 插入法、 化學(xué)修飾法 基因工程法。

抗體酶的催化效率遠(yuǎn)比模擬酶高;同時，從原理上講，只要能找到合適的過渡態(tài)類似物，幾乎可為任何化學(xué)反應(yīng)提供全新的蛋白質(zhì)催化劑-抗體酶。

目前抗體酶催化的反應(yīng)，

除水解反應(yīng)外，催化合成反應(yīng)，交換反應(yīng)，閉環(huán)反應(yīng)，異構(gòu)化反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)等。

此外，與模擬酶相比，抗體酶表現(xiàn)出一定程度的底物專一性和立體專一性。業(yè)已證明，抗體酶可以在體內(nèi)執(zhí)行催化功能?？贵w梅的應(yīng)用前景非常誘人?？贵w酶已經(jīng)用于酶作用機(jī)理的研究， 手性藥物的合成和拆分， 抗癌藥物的制備．

目前人們正在致力于提高抗體酶的作用效率，期望在深入了解酶的作用機(jī)理，以及抗體和酶結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)上，能夠真正按照人們的意愿構(gòu)建出具有特定催化活性和專一性的催化效率高的能滿足各種用途需要的抗體酶．五.分子酶學(xué) 研究分子結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系．到1999年1月。在Brookhaven蛋白質(zhì)資料庫中己經(jīng)收集到8000多個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其中酶的結(jié)構(gòu)有4800個。近年來，多標(biāo)記和多維技術(shù)的發(fā)展，使得利用核磁共振檢測生物高分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)成為可能。近年來，利用NMR技術(shù)解析酶的研究迅速發(fā)展．對某些蛋白質(zhì)進(jìn)行動態(tài)結(jié)構(gòu)的研究，如測定肌紅蛋白。 近來，基因定點突變技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的研究，將在今后的研究中會取得突破性的進(jìn)展。六.功能酶學(xué)進(jìn)展 從1990年開始的、被稱為生物學(xué)的“阿波羅登月計劃”的人類基因組計劃，是整個生物學(xué)領(lǐng)域人力、物力和財投入最大的一項巨大工程。其任務(wù)是完成人體23對染色體、約10萬個基因、30億對堿基的DNA的全序列測定，原來計劃2005年完成。有美國、日本、中國等國家合作，已經(jīng)于2000年6月26日公布了人類基因組的基本框架。預(yù)計，將在2002年全部完成。

今年4月在上海開的國際人類基因組會議提出，明年上半年公布全部結(jié)果，供全世界使用。

2001年2月12日美日英中德等國的科學(xué)家和美國的塞萊拉公司，聯(lián)合公布了在原“工作框架圖”基礎(chǔ)上經(jīng)過整理分類和排列而得到的人類基因組圖譜和初步分析結(jié)果。

每種生物只有一個基因組。但每種生物的不同細(xì)胞的蛋白質(zhì)的組成和數(shù)量不同，其功能狀態(tài)也不同而有很大差異。因此，基因組是唯一的，但基因組內(nèi)成千上萬個基因并不在相同時間內(nèi)全部得到表達(dá)。即使得到表達(dá)，其表達(dá)程度也各不相同．

當(dāng)然，基因的表達(dá)并非是無序進(jìn)行的，而是有內(nèi)在的規(guī)律。不同的基因有其各自不同的表達(dá)模式．這正是基因調(diào)控的結(jié)果。基因組研究的根本目的是揭示整個生命活動的規(guī)律。

人類基因組全序列的測定完成后，只是解決了人類全部基因DNA序列問題(即遺傳信息庫問題)， 今后人們必須進(jìn)一步了解這些基因的功能，以及這些基因如何發(fā)揮其功能。因此功能基因組的研究在今后的研究中就非常重要。

實際上，每一種生命活動形式都是由特定的蛋白質(zhì)類群在不同時間和空間存在，發(fā)揮其不同組合功能的綜合結(jié)果。 基因DNA的序列并不能提供上述全部信息，僅用核酸的語言還不能描述整個生命活動的規(guī)律。

在基因表達(dá)過程中，還存在基因剪接、蛋白質(zhì)翻譯后修飾及蛋白質(zhì)剪接，使基因遺傳信息的表達(dá)規(guī)律更加復(fù)雜。一個基因?qū)?yīng)一個蛋白質(zhì)的經(jīng)典理論已經(jīng)被實踐所否定。已發(fā)現(xiàn)，一個基因可以表達(dá)的蛋白質(zhì)的數(shù)目可能遠(yuǎn)大于l。對細(xì)菌而言，可能表達(dá)的蛋白質(zhì)數(shù)目為1.2-1.3;對酵母而言，則為3;而對于人，則可以高達(dá)I0。

即人類3.5萬個基因表達(dá)的蛋白質(zhì)數(shù)目可能高達(dá)35萬。在基因編碼的蛋白質(zhì)中，酶占了大約為60%。因此，后基因組研究，亦即功能基因組研究中，酶蛋白質(zhì)組研究的任務(wù)極為繁重。七.酶的定向固定化問題 酶固定化以后活性部分失去，甚至全部失去。一般認(rèn)為酶活性的失去是由于酶蛋白通過幾種氨基酸殘基在固定化載體上的附著造成的，這些氨基酸殘基主要有:賴氨酸的(ε-氨基和N-末端氨基,疏基，天門冬氨酸和谷氨酸的羧基等）。

由于酶蛋白多點附著在載體上用起了固定化酶蛋白無序的定向和結(jié)構(gòu)變形的增加。這種增加直接導(dǎo)致酶活性下降或者丟失。

近來，國外的研究者們在探索酶蛋白質(zhì)的固定化技術(shù)方面，己經(jīng)尋找到幾條不同途徑，使酶蛋白能夠以有序方式附著在載體上，有一定的定向作用，而使酶活性的損失降低到最小程度。酶蛋白的固定化技術(shù)具有以下一些優(yōu)點:a.每個酶分子通過其一個特定的位點以可重復(fù)的方式進(jìn)行固定化，b.蛋白質(zhì)的定向固定化技術(shù)有利于進(jìn)了步研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)c.這種固定化技術(shù)可以借助一個與酶蛋白的酶活性無關(guān)或影響很小的氨基酸來實現(xiàn)。

目前所用的方法：1)

借助化學(xué)方法的位點專一性固定化;2)

磷蛋白的位點專一性固定化;3)

糖蛋蛋白的位點專一性固定化;4)

抗體(免疫球蛋白)的位點專一性固定化;5)利用基因工程的位點專一性固定化。以及共價固定化、氨基酸置換、疏水定向固定化等

這種有序的、定向固定化技術(shù)己經(jīng)用于生物芯片、生物傳感器"、生物反應(yīng)器、臨床診斷藥物設(shè)計、親和層析及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究。八雜交酶

所謂雜交酶是指由來自兩種或兩種以上的酶的不同結(jié)構(gòu)片段構(gòu)建成的新酶。雜交酶的出現(xiàn)及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，為酶工程的研究和應(yīng)用開創(chuàng)了一個新的領(lǐng)域。是人們可以利用高度同源的酶之間的雜交， 將一種酶的耐熱性、穩(wěn)定性等非催化特性“轉(zhuǎn)接”給另一種酶。這種雜交是通過相關(guān)酶同源區(qū)間殘基或結(jié)構(gòu)的交換來實現(xiàn)的，

雜交酶的特性通常介于其雙親酶的特性之間。

例如，利用根癌土壤桿菌和淡黃色纖維弧菌的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行雜交，構(gòu)建成的雜交β-葡萄糖苷酶，其最佳反應(yīng)條件和對各種多糖的Km值都介于雙親酶之間。2是人們可以創(chuàng)造具有新活性的雜交酶。 其最便捷的途徑就是調(diào)節(jié)現(xiàn)有酶的專一性或催化活性。 現(xiàn)在所有雜交酶大都屬于這類酶。有時單個氨基酸殘基的變化就能夠改變酶的催化活性。如：發(fā)酵氨基酸球菌的戊烯二酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶點突變后，可以轉(zhuǎn)化成酚基輔酶A烴化酶。 采用循環(huán)點突變和篩選技術(shù)，經(jīng)3輪的突變，可構(gòu)建出高活性的能夠?qū)⒓谆锼釋ο趸锦ミM(jìn)行手性拆分的雜交脂酶。其酶活性可以從野生型的2%上升到81%。 ` 創(chuàng)造新雜交酶還可以利用功能性結(jié)構(gòu)域的交換，以及向合適的蛋白質(zhì)骨架引入底物專一性和催化特性的活性位點等技術(shù)。

雜交酶技術(shù)還可以用于研究酶的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系。例如，可以用來確定相關(guān)酶之間的差異。 當(dāng)某個酶的特性在同源酶中缺失時，人們可以用雜交酶技術(shù)分析研究與該特性有關(guān)的殘基或片段等。 近年來，雜交酶的發(fā)展非常迅速，1998年就有14個利用雜交酶技術(shù)改良的酶，獲得了美國專利?？梢灶A(yù)期，雜交酶技術(shù)必將為酶工程的研究和應(yīng)用發(fā)揮更大的作用。九．極端環(huán)境微生物和不可培養(yǎng)微生物的新酶種研究 自然界蘊(yùn)藏著巨大的微生物資源． 據(jù)測算1g土壤中含有l(wèi)億個微生物。美國華盛頓大學(xué)的JamesStaley教授說過，未知的微生物世界或許是地球上最大的未開發(fā)的自然資源，能夠利用這個微生物資源的國家，勢必會取得技術(shù)上的優(yōu)勢。

自有酶一詞以來，隨著研究工作的深入，酶的種類在不斷增加。到目前為止，還不知道自然界究竟有多少種酶。同樣，也不清楚，每個細(xì)胞內(nèi)究竟有多少種酶。 有人估計大腸桿菌細(xì)胞中有“3000種蛋白質(zhì)， 而真核細(xì)胞中有50000種蛋白質(zhì)．這些蛋白質(zhì)中的大多數(shù)是酶。如果估計可靠，酶的種類將達(dá)到幾萬種。近來，人們從生產(chǎn)實踐的需要出發(fā)，非常重視開發(fā)新的酶種。

現(xiàn)在人們對極端環(huán)境微生物和不可培養(yǎng)微生物研究還很不夠．這兩個資源寶庫值得人們?nèi)ラ_發(fā)。

人們首先注意從極端環(huán)境條件下生長的微生物內(nèi)篩選新的酶種。其中主要研究嗜熱微生物、 嗜冷微生物、 嗜鹽微生物、 嗜酸微生物、 嗜堿微生物、 嗜壓微生物等。

目前，人們己經(jīng)發(fā)現(xiàn)能夠在250-350℃條件下生長的嗜熱微生物，能夠在-10-0℃條件下生長的嗜冷微生物，能夠在pH2.5條件下生長的嗜酸微生物，