質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定

第一章質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定第一節(jié)概述把一個(gè)有用的目的DNA片段通過(guò)重組DNA技術(shù),送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的工具叫載體（Vector）。細(xì)菌質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中常用的載體。質(zhì)粒（Plasmid）是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,大小從l-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力,能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù),并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開(kāi)宿主細(xì)胞則不能存活,而宿主即使沒(méi)有它們也可以正常存活。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如對(duì)抗生素的抗性等。F質(zhì)粒（又稱(chēng)F因子或性質(zhì)粒）、R質(zhì)粒（抗藥性因子）和Col質(zhì)粒（產(chǎn)大腸桿菌素因子）等都是常見(jiàn)的天然質(zhì)粒。質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類(lèi)型:緊密控制型（Stringentcontrol）和松馳控制型（Relaxedcontrol）。前者只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，當(dāng)染色體不復(fù)制時(shí)，它也不能復(fù)制，通常每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含有1個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒分子，如F因子。后者的質(zhì)粒在整個(gè)細(xì)胞周期中隨時(shí)可以復(fù)制,在每個(gè)細(xì)胞中有許多拷貝,一般在20個(gè)以上，如ColE1質(zhì)粒。在使用蛋白質(zhì)合成抑制劑-氯霉素時(shí)，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、染色體DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂均受到抑制，緊密型質(zhì)粒復(fù)制停止，而捾馳壓褨碒竧竭復(fù)制，質(zhì)粒拷貝數(shù)可由原來(lái)20多個(gè)擴(kuò)增至1000-3000個(gè)，此時(shí)質(zhì)粒DNA占總DNA的含量可由原來(lái)的2%增加至40-50%。利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中共同存在，當(dāng)兩種質(zhì)粒同時(shí)導(dǎo)入同一細(xì)胞時(shí)，它們?cè)趶?fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過(guò)程中彼此競(jìng)爭(zhēng)，在一些細(xì)胞中，一種質(zhì)粒占優(yōu)勢(shì)，而在另一些細(xì)胞中另一種質(zhì)粒卻占上風(fēng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)幾代后，占少數(shù)的質(zhì)粒將會(huì)丟失，因而在細(xì)胞后代中只有兩種質(zhì)粒的一種，這種現(xiàn)象稱(chēng)質(zhì)粒的不相容性（Incompatibility）。但利用不同復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒則可以穩(wěn)定地共存于同一宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒通常含有編碼某些酶的基因，其表型包括對(duì)抗生素的抗性，產(chǎn)生某些抗生素，降解復(fù)雜有機(jī)物，產(chǎn)生大腸桿菌素和腸毒素及某些限制性內(nèi)切酶與修飾酶等。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作而進(jìn)行人工構(gòu)建的。與天然質(zhì)粒相比，質(zhì)粒載體通常帶有一個(gè)或一個(gè)以上的選擇性標(biāo)記基因（如抗生素抗性基因）和一個(gè)人工合成的含有多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作。大多質(zhì)粒載體帶有一些多用途的輔助序列，這些用途包括通過(guò)組織化學(xué)方法肉眼鑒定重組克隆、產(chǎn)生用于序列測(cè)定的單鏈DNA、體外轉(zhuǎn)錄外源DNA序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達(dá)等。一個(gè)理想的克隆載體大致應(yīng)有下列一些特性：（1）分子量小、多拷貝、松馳控制型；（2）具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點(diǎn)；（3）能插入較大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的檢測(cè)表型。常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb至10kb之間，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（簡(jiǎn)稱(chēng)pBS）等。從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟:培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞;分離和純化質(zhì)粒DNA。采用溶菌酶可以破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷基磺酸鈉(SDS)和TritonX-100可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS或TritonX-100處理后，細(xì)菌染色體DNA會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上,同時(shí)由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多，易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線性染色體DNA變性，而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，簡(jiǎn)稱(chēng)cccDNA)的兩條鏈不會(huì)相互分開(kāi)，當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體DNA片段難以復(fù)性，而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起，而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過(guò)程中，除了超螺旋DNA外，還會(huì)產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松馳型的環(huán)狀分子,稱(chēng)開(kāi)環(huán)DNA(OpencircularDNA,簡(jiǎn)稱(chēng)ocDNA)；如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂，則形成線狀DNA(LinearDNA)。當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA電泳時(shí)，同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動(dòng)速度要比開(kāi)環(huán)和線狀分子的泳動(dòng)速度快。第二節(jié)材料、設(shè)備及試劑一、材料含pBS的E.coliDH5a或JM系列菌株，1.5ml塑料離心管(又稱(chēng)eppendorf管)，離心管架。二、設(shè)備微量取液器(20pl,200pl,1000pl)，臺(tái)式高速離心機(jī)，恒溫振蕩搖床，高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)，渦旋振蕩器，電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和恒溫水浴鍋等。三、試劑1、 LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani):稱(chēng)取蛋白胨(Tryptone)10g,酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml去離子水中，用NaOH調(diào)pH至7.5,加去離子水至總體積1升，高壓下蒸氣滅菌20分鐘。2、 LB固體培養(yǎng)基:液體培養(yǎng)基中每升加12g瓊脂粉，高壓滅菌。3、 氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配成50mg/ml水溶液,-20°C保存?zhèn)溆谩?、 溶菌酶溶液：用10mmol/LTris?Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分裝成小份(如1.5ml)保存于-20C,每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。5、3mol/lNaAc(pH5.2)：50ml水中溶解40.81gNaAc?3H2O,用冰醋酸調(diào)pH至5.2,加水定容至100ml,分裝后高壓滅菌,儲(chǔ)存于4C冰箱。6、溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.O),10mmol/LEDTA(pH8.O)。溶液I可成批配制，每瓶100ml,高壓滅菌15分鐘,儲(chǔ)存于4°C冰箱。7、 溶液II：0.2mol/LNaOH(臨用前用10mol/LNaOH母液稀釋)，1%SDS。8、溶液III：5mol/LKAc60ml,冰醋酸11.5ml,H2O28.5ml,定容至100ml,并高壓滅菌。溶液終濃度為:K+3mol/L,Ac_5mol/L。9、 RNA酶A母液：將RNA酶A溶于10mmol/LTris?Cl(pH7.5),15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液,于100C加熱15分鐘，使混有的DNA酶失活。冷卻后用1.5mleppendorf管分裝成小份保存于-20C。10、 飽和酚：市售酚中含有醌等氧化物，這些產(chǎn)物可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導(dǎo)致RNA和DNA的交聯(lián)，應(yīng)在160C用冷凝管進(jìn)行重蒸。重蒸酚加入0.1%的8-羥基喹啉(作為抗氧化劑),并用等體積的0.5mol/LTris?Cl(pH8.0)和0.1mol/LTris?Cl(pH8.0)緩沖液反復(fù)抽提使之飽和并使其pH值達(dá)到7.6以上，因?yàn)樗嵝詶l件下DNA會(huì)分配于有機(jī)相。11、 氯仿:按氯仿:異戊醇二24:1體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機(jī)相的分開(kāi)，異戊醇則可起消除抽提過(guò)程中出現(xiàn)的泡沫。按體積/體積二1:1混合上述飽和酚與氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很強(qiáng)的腐蝕性,操作時(shí)應(yīng)戴手套。12、 TE緩沖液：10mmo/LTris?Cl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。高壓滅菌后儲(chǔ)存于4C冰箱中。13、 STET：0.1mol/LNaCl,10mmol/LTris?Cl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0), 5%TritonX-100。14、 STE：0.1mol/LNaCl,10mmol/LTris?Cl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。15、電泳所用試劑：(1)TBE緩沖液(5X)：稱(chēng)取Tris54g，硼酸27.5g，并加入0.5MEDTA(pH8.0)20ml,定溶至1000ml。 (2)上樣緩沖液(6X)：0.25%溴酚藍(lán)，40%(w/v)蔗糖水溶液。第三節(jié)操作步驟一、 細(xì)菌的培養(yǎng)和收集將含有質(zhì)粒pBS的DH5a菌種接種在LB固體培養(yǎng)基(含50pg/mlAmp)中,37C培養(yǎng)12-24小時(shí)。用無(wú)菌牙簽挑取單菌落接種到5mlLB液體培養(yǎng)基(含50pg/mlAmp)中,37C振蕩培養(yǎng)約12小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。二、 質(zhì)粒DNA少量快速提取質(zhì)粒DNA小量提取法對(duì)于從大量轉(zhuǎn)化子中制備少量部分純化的質(zhì)粒DNA十分有用。這些方法共同特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速，能同時(shí)處理大量試樣，所得DNA有一定純度，可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。一）、煮沸法1、 將1.5ml培養(yǎng)液倒入eppendorf管中,4°C下12000g離心30秒。2、 棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。3、 將菌體沉淀懸浮于120mlSTET溶液中，渦旋混勻。4、 加入10ml新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml）,渦旋振蕩3秒鐘。5、 將eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。6、 用微量離心機(jī)4C下12000g離心10分鐘。7、 用無(wú)菌牙簽從eppendorf管中去除細(xì)菌碎片。8、 取20ml進(jìn)行電泳檢查。［注意］對(duì)大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落直接進(jìn)行煮沸法提取質(zhì)粒DNA。煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,濃度高時(shí),細(xì)菌裂解效果反而不好。有時(shí)不同溶菌酶也能溶菌。提取的質(zhì)粒DNA中會(huì)含有RNA,但RNA并不干擾進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，如限制性內(nèi)切酶消化，亞克隆及連接反應(yīng)等。（二）、堿法1、 取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5mleppendorf管中,4C下12000g離心30秒。2、 棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。3、 菌體沉淀重懸浮于100pl溶液I中（需劇烈振蕩），室溫下放置5-10分鐘。4、 加入新配制的溶液II200pl,蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次，以混勻內(nèi)容物（千萬(wàn)不要振蕩）,冰浴5分鐘。5、 加入150pl預(yù)冷的溶液III,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒，使沉淀混勻，冰浴中5-10分鐘,4C下12000g離心5-10分鐘。6、上清液移入干凈eppendorf管中，加入等體積的酚/氯仿（1:1）,振蕩混勻,4°C下12000g離心5分鐘。7、 將水相移入干凈eppendorf管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，振蕩混勻后置于-20C冰箱中20分鐘，然后4C下12000g離心10分鐘。8、 棄上清，將管口敞開(kāi)倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入1ml70%乙醇洗沉淀一次,4C下12000g離心5-10分鐘。9、 吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，真空干燥10分鐘或室溫干燥。10、 將沉淀溶于20plTE緩沖液（pH8.0,含20pg/mlRNaseA）中，儲(chǔ)于-20C冰箱中。［注意］提取過(guò)程應(yīng)盡量保持低溫。提取質(zhì)粒DNA過(guò)程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨(dú)用酚或氯仿好，要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低溫條件下放置時(shí)間稍長(zhǎng)可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用異丙醇（一般使用等體積），且沉淀完全，速度快，但常把鹽沉淀下來(lái)，所以多數(shù)還是用乙醇。（三）、Wizard少量DNA純化系統(tǒng)Promega公司的Wizard少量DNA純化系統(tǒng)可快速有效的抽提質(zhì)粒DNA，整個(gè)過(guò)程只需15分鐘。提取的質(zhì)?？芍苯佑糜贒NA測(cè)序、酶切分析和體外轉(zhuǎn)錄等。該系統(tǒng)中所含試劑和柱子可以用于50次1-3ml質(zhì)粒培養(yǎng)液的分離和純化，試劑包括10ml細(xì)胞懸浮液,10ml細(xì)胞裂解液；10ml中和液，50mlWizard少量DNA純化樹(shù)脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml）和50支Wizard微型柱。1、 1-3ml過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)胞液4C下12000g離心1-2分鐘。2、 去除上清液，菌體細(xì)胞懸浮于200pl細(xì)胞懸浮液中，充分混合,并移入eppendorf管中。3、 加200pl細(xì)胞裂解液，顛倒離心管數(shù)次，直到溶液變清亮。4、 加200pl中和液，顛倒離心管數(shù)次。5、4C下12000g離心5分鐘，取上清液于新的eppendorf管中。6、加lmlWizard少量DNA純化樹(shù)脂，顛倒離心管數(shù)次以充分混勻。7、 取一次性注射器，取出注塞,并使注射筒與Wizard微型柱連接，用移液槍將上述混合液加入注射筒中，并用注塞輕推，使混合物進(jìn)入微型柱。8、 將注射器與微型柱分開(kāi)，取出注塞，再將注射筒與微型柱相連，加入2ml柱洗液，并用注塞輕推，使柱洗液進(jìn)入微型柱。9、 取出微型柱置于eppendorf管中，離心2分鐘以除去微型柱中的柱洗液。10、 將微型柱放在一個(gè)新eppendorf管中，加50“1TE（或水）于微型柱中，靜止1分鐘后，4°C下12000g離心20秒。11、 丟棄微型柱，將eppendorf管中的質(zhì)粒DNA貯于4C或-20C冰箱。［注意］樹(shù)脂使用前應(yīng)充分混勻，如有結(jié)晶，可將樹(shù)脂用25-37C水浴處理10分鐘。三、質(zhì)粒DNA的大量提取和純化在制作酶譜、測(cè)定序列、制備探針等實(shí)驗(yàn)中需要高純度、高濃度的質(zhì)粒DNA，為此需要大量提取質(zhì)粒DNA。大量提取的質(zhì)粒DNA一般需進(jìn)一步純化，常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。（一）、堿法1、 取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的含pBS質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)液250ml，4C下5000g離心15分鐘，棄上清,將習(xí)戈口渠壘哲清液全部流盡。2、 將細(xì)菌沉淀重新懸浮于50ml用冰預(yù)冷的STE中（此步可省略）。3、 同步驟1方法離心以收集細(xì)菌細(xì)胞。4、 將細(xì)菌沉淀物重新懸浮于5ml溶液I中,充分懸浮菌體細(xì)胞。5、 加入12ml新配制的溶液II,蓋緊瓶蓋，緩緩地顛倒離心管數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物，冰浴10分鐘。6、 加9ml用冰預(yù)冷的溶液III,搖動(dòng)離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物，冰上放置15分鐘,此時(shí)應(yīng)形成白色絮狀沉淀。7、 4C下5000g離心15分鐘。8、取上清液，加入50mlRNA酶A（10mg/ml）,37C水浴20分鐘。9、加入等體積的飽和酚/氯仿，振蕩混勻,4°C下12000g離心10分鐘。10、 取上層水相，加入等體積氯仿，振蕩混勻,4C下12000g離心10分鐘。11、 取上層水相，加入1/5體積的4mol/LNaCl和10%PEG（分子量6000）,冰上放置60分鐘。12、 4C下12000g離心15分鐘，沉淀用數(shù)ml70%冰冷乙醇洗滌，4C下12000g離心5分鐘。13、 真空抽干沉淀，溶于500mlTE或水中。［注意］提取過(guò)程中應(yīng)盡量保持低溫。加入溶液II和溶液III后操作應(yīng)混和，切忌劇烈振蕩。由于RNA酶A中常存在有DNA酶，利用RNA酶耐熱的特性，使用時(shí)應(yīng)先對(duì)該酶液進(jìn)行熱處理（80C1小時(shí)），使DNA酶失活。（二）、Wazard大量DNA純化系統(tǒng)堿法大量提取DNA往往需要很長(zhǎng)的時(shí)間.Promega公司的Wiazrd大量DNA純化系統(tǒng)既簡(jiǎn)單又快速,只需要離心和真空抽干，這個(gè)系統(tǒng)可以從500ml培養(yǎng)液中在3小時(shí)以內(nèi)獲得1mg以上的高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA（200-20000bp）。該系統(tǒng)不需要酚和氯仿抽提，純化后的DNA溶于水或TE緩沖液中，不含任何鹽份，可以直接用于DNA序列分析和酶切反應(yīng)，也可以用于在核酸酶抑制劑（如RNasin）存在的條件下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)等。該系統(tǒng)中含有的試劑和柱子可以用于10次100-500ml質(zhì)粒培養(yǎng)液的分離和純化，試劑包括:150ml細(xì)胞懸浮液，150ml細(xì)胞裂解液，150ml中和液，100mlWizard大量DNA純化樹(shù)脂，125mlWizard柱子洗脫溶液和10支Wizard帶有存儲(chǔ)離心管的柱子。1、 100-500ml細(xì)胞培養(yǎng)液置離心管中,22-25C下5000g離心10分鐘，所得細(xì)胞沉淀充分懸浮于細(xì)胞懸浮液中。2、 加15ml細(xì)胞裂解溶液并輕輕混合，可以反復(fù)倒置混合，但不能用渦旋振蕩，細(xì)胞裂解完全時(shí),溶液會(huì)變清,這一步需要20分鐘。3、 加15ml中和溶液，立即反復(fù)倒置離心管數(shù)次，并使之混勻。4、 14000g,22-25C離心15分鐘。5、小心地將上清液吸出并移至一個(gè)新離心管中。6、 加0.5倍體積的異丙醇，混合均勻，14000g22-25下離心15分鐘。7、 棄上清，懸浮DNA沉淀于2mlTE緩沖液中。這一步中也許有的沉淀不能溶解。8、 加10mlWizard大量DNA純化樹(shù)脂溶液，并渦旋混合。9、 每一個(gè)樣品，使用一支Wizard大量柱子，柱子的頭插在真空器上(Promega產(chǎn)品,與此配套)。10、 將樹(shù)脂/DNA混合液轉(zhuǎn)入柱子中，真空抽取樹(shù)脂/DNA混合液。11、 將樹(shù)脂/DNA混合液抽干后，加13ml柱子洗脫溶液至離心管中，對(duì)管底部的樹(shù)脂/DNA進(jìn)行洗脫(柱子一邊旋轉(zhuǎn)一邊加入洗脫液)，并加入柱子中。12、 真空抽干所加入的洗脫。13、 再加12ml柱子洗脫液進(jìn)柱子并抽干。14、 加入5ml80%乙醇漂洗柱中的樹(shù)脂，柱子真空抽干后將柱子放入用戶提供的離心管中,2500rpm(1300g)離心5分鐘。15、 取出柱子，真空抽干5分鐘,再將柱子放入系統(tǒng)中所提