發(fā)育生物學(xué)研究的兩個(gè)核心問(wèn)題

發(fā)育生物學(xué)研究的兩個(gè)核心問(wèn)題

美國(guó)科學(xué)家泰勒蒙頓實(shí)驗(yàn)室的主要貢獻(xiàn)是遺傳，但在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了發(fā)展變化的突變。然而，在最初的幾十年里，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)的重點(diǎn)不是發(fā)育生物學(xué)，而是遺傳。20世紀(jì)初，德國(guó)wilhous和其他科學(xué)家開(kāi)始了實(shí)驗(yàn)胚胎培養(yǎng)。20世紀(jì)20年代，以德國(guó)哈斯韋恩為代表的科學(xué)家在兩次棲息地研究中發(fā)展了發(fā)育生物學(xué)的第二個(gè)高峰。20世紀(jì)30年代，山羊的首次祖先研究陷入了相對(duì)寒冷的時(shí)期，其他生物（如粗糙鏈菌、玉米、細(xì)菌、侵生菌等）對(duì)遺傳有貢獻(xiàn)。在缺乏普遍關(guān)注水果和蒼蠅發(fā)育的環(huán)境中。艾爾b.在20世紀(jì)50年代的美國(guó)理工學(xué)院，州長(zhǎng)b.lewis通過(guò)遺傳改良分析了水果和蒼蠅的發(fā)育突變，并深刻思考了遺傳規(guī)律。1980年前后,在德國(guó)海德堡工作的德國(guó)女科學(xué)家ChristianeNüsslein-Volhard和美國(guó)科學(xué)家EricWieschaus以遺傳突變廣泛篩選控制果蠅發(fā)育的大批基因,使果蠅研究光彩絢麗,并在德國(guó)形成第三次國(guó)際發(fā)育生物學(xué)研究高潮.20世紀(jì)80年代,很多分子生物學(xué)家加入果蠅研究,新的研究成果一波一波涌現(xiàn).在遺傳學(xué)帶領(lǐng)和分子克隆技術(shù)推動(dòng)下研究果蠅,1984年同源異形盒(homeobox)被發(fā)現(xiàn),使發(fā)育生物學(xué)與分子生物學(xué)兩個(gè)學(xué)科的重要領(lǐng)域得以匯合:調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄可以控制發(fā)育.研究果蠅的原理在很多生物普遍適用,發(fā)現(xiàn)大量新的基因及其功能,闡明一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,表觀遺傳學(xué)有些基因最初也發(fā)現(xiàn)于果蠅,而最初從果蠅發(fā)現(xiàn)的基因(特別是含同源異形盒的基因)在高等動(dòng)物中也起重要作用,不僅有些參與相同的發(fā)育過(guò)程(特別是身體前后軸),還參與其他重要過(guò)程,包括一些腫瘤的發(fā)生.從果蠅和高等動(dòng)物保守的發(fā)育遺傳學(xué)規(guī)律,迄今尚有難以完全理解的.果蠅研究結(jié)果提示能夠用基因人工制造器官,迄今未知能否在高等動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)及如何實(shí)現(xiàn).1同源異形突變一只由很多系統(tǒng)、組織和細(xì)胞組成的動(dòng)物來(lái)源于一個(gè)細(xì)胞:受精卵.它經(jīng)過(guò)分裂可以變成很多細(xì)胞,這些細(xì)胞如何變成不同細(xì)胞,取得不同的身份(identity),有不同的命運(yùn)(cellfate)?這是發(fā)育生物學(xué)的一個(gè)核心問(wèn)題.有了不同身份的細(xì)胞,才能形成不同的結(jié)構(gòu),產(chǎn)生不同的功能:紅細(xì)胞運(yùn)輸氧氣,心肌細(xì)胞泵血,神經(jīng)細(xì)胞參與思維……研究發(fā)育的途徑之一是遺傳學(xué),通過(guò)研究基因突變的后果,推論基因是否參與、如何參與發(fā)育.基因突變可以影響發(fā)育,而常見(jiàn)的變化是某些結(jié)構(gòu)沒(méi)有了或增大了.這些變化可以有有趣的解釋,有時(shí)也可以有無(wú)趣的解釋,比如可以觀察到的發(fā)育異常非基因的直接作用,而是在基因突變與最后看到的表型之間有很多環(huán)節(jié).很多研究者曾憂慮自己研究的基因不能提供較有意義的信息.發(fā)育過(guò)程最容易引人入勝的變化是身體的一種結(jié)構(gòu)變成另一種結(jié)構(gòu).1894年,英國(guó)的Bateson提出“同源異形”(homeosis)的概念,用于描述一種結(jié)構(gòu)變得像另一種結(jié)構(gòu),他舉例包括:有些蜜蜂沒(méi)有腿,而在腿的位置長(zhǎng)出觸角,將運(yùn)動(dòng)器官(腿)變成了嗅覺(jué)器官(觸角).在細(xì)胞水平,同源異形是一種細(xì)胞變成另一種細(xì)胞.基因突變?cè)斐赏串愋伪硇?稱為同源異形突變,被改變的基因稱為同源異形基因(homeoticgenes).在果蠅中,有個(gè)基因復(fù)合體稱為雙胸復(fù)合體(BithoraxComplex,BX-C),其DNA序列突變后可出現(xiàn)同源異形突變,結(jié)果是一個(gè)節(jié)段的身份變成另一節(jié)段的身份.第一個(gè)bithorax(bx)突變由摩爾根的學(xué)生CalvinBridges于1915年發(fā)現(xiàn),1923年由Bridges和Morgan報(bào)道,果蠅成蟲(chóng)第三胸節(jié)段(T3)的殘翅變成像正常果蠅第二胸節(jié)段(T2)才有的翅膀,使bx突變種果蠅有兩對(duì)翅膀.摩爾根的學(xué)生AlfredSturtevant的學(xué)生EdLewis對(duì)BX-C的研究從20世紀(jì)40年代末到70年代后期(下一節(jié)介紹).1929年,Balkashina發(fā)現(xiàn)aristopedia突變,果蠅觸角的末端為腿的末端所替代;1933年,Bridges和Dobzhansky報(bào)道1931年Bridges發(fā)現(xiàn)的proboscipedia突變,口器的部分結(jié)構(gòu)為腿的末端所替代.20世紀(jì)40年代后發(fā)現(xiàn)更多觸角變成腿的突變,是基因功能增加的突變,包括稱為“角腳”(Antennapedia,Antp)的基因.1980年,美國(guó)印第安納大學(xué)的TomKaufman提出Antennapedia也屬于一個(gè)基因復(fù)合體,含多個(gè)基因,包括antennapedia,proboscipedia(pb)和sexcombreduced(Scr)等,稱為“角腳復(fù)合體”(ANT-C),其作用是控制頭和胸節(jié)段的形成,缺乏這些基因時(shí),胸二節(jié)段(T2)和胸三節(jié)段(T3)成為胸一節(jié)段(T1).20世紀(jì)60～70年代,堅(jiān)持用果蠅研究發(fā)育的還有西班牙的AntonioGarcía-Bellido、瑞士的WalterGehring、美國(guó)的Postlethwait和Schneiderman(1969年,1971年)等.1929年,Ecker發(fā)現(xiàn)engrailed突變.1972年,García-Bellido和研究生報(bào)道,engrailed突變使T2節(jié)段的后半部變成前半部,繼續(xù)研究提出發(fā)育的compartment概念,不是表觀看到的形態(tài)的框架,而是發(fā)育的單位,明確提出同源異形基因是調(diào)節(jié)性節(jié)段的形成(Garcia-Bellido和Santamaria,1972年).1975年,García-Bellido進(jìn)一步提出:activator基因確定selector基因表達(dá)的范圍,selector基因控制realizator基因,后者具體確定細(xì)胞命運(yùn).在此概念中,Bithorax和engrailed都是selector基因.García-Bellido的想法為Crick和Lawrence于1975年特別推介.2bxd突變事件摩爾根本人對(duì)發(fā)育很感興趣,他研究果蠅以前就研究過(guò)發(fā)育和再生,1897年他出版的第一部書(shū)是《蛙卵的發(fā)育:實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)導(dǎo)論》,1901年出版《再生》.他晚期仍醉心思考發(fā)育,1926年出版《遺傳學(xué)與發(fā)育生理學(xué)》,1929年出版《實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)》,1934年出版的最后一部書(shū)是《胚胎學(xué)與遺傳學(xué)》.他自然認(rèn)為遺傳學(xué)對(duì)發(fā)育生物學(xué)有意義,摩爾根本人用果蠅做研究以后,還用其他動(dòng)物做實(shí)驗(yàn).有人認(rèn)為摩爾根心底里從來(lái)不是遺傳學(xué)家,而是發(fā)育生物學(xué)家.在20世紀(jì)50～70年代的30年間,用果蠅遺傳研究發(fā)育的科學(xué)家是加州理工學(xué)院的EdwardLewis(1918～2004年).Lewis在明尼蘇達(dá)大學(xué)念本科時(shí)的遺傳學(xué)老師C.P.Oliver,是HermannJosephMuller的學(xué)生,而Muller是摩爾根的學(xué)生.Lewis到加州理工跟摩爾根的另一位學(xué)生Sturtevant做研究生,于1942年獲博士.他用果蠅研究了多個(gè)問(wèn)題,而最為人所知的是果蠅發(fā)育.這一系列工作起初不是為研究發(fā)育,而是他繼續(xù)自己從1939年起研究基因精細(xì)圖譜(finemapping)和順?lè)?cis-trans)檢測(cè)等工作.前人有關(guān)基因重復(fù)(geneduplication)產(chǎn)生新基因和Sturtevant有關(guān)基因的位置效應(yīng),影響了Lewis的研究.在研究演化產(chǎn)生的新基因與相鄰基因互相作用的過(guò)程中,他選用了bx突變果蠅的胸部有3個(gè)節(jié)段,T2(胸二)節(jié)段長(zhǎng)翅膀,T3(胸三)節(jié)段長(zhǎng)平衡棒(也稱殘翅,haltere).Bridges發(fā)現(xiàn)bx突變導(dǎo)致T3節(jié)段變成T2節(jié)段,這樣的果蠅有4個(gè)翅膀,而缺乏平衡棒(圖1).Bridges于1919年再發(fā)現(xiàn)bxd突變,表型也是T3變成T2,bxd在基因圖譜上的位置與bx相近,而遺傳上卻比較奇怪:bx與bxd不能互補(bǔ)1934年,Hollander發(fā)現(xiàn)Bxl突變種,經(jīng)Bridges研究過(guò),Bxl后來(lái)被Lewis稱為Ubx.Ubx/+表型微弱Ubx/bx表型等于bx/bx,Ubx/bxd表型等于bxd/bxdLewis認(rèn)為它們3個(gè)可能是在演化上有關(guān)系而有相互作用的基因,他稱為“偽等位基因效應(yīng)”(pseudoallelism)(Lewis,1951年).基因圖譜定位發(fā)現(xiàn)3個(gè)“基因”中,bx最靠近染色體著絲點(diǎn),其右0.02單位為Ubx,再右0.01單位是bxd.Lewis進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),bx與bxd影響節(jié)段中不同而互補(bǔ)的部分:bx只使T3前部(anteriorT3)變成T2前部(anteriorT2),而bxd使T3后部(posteriorT3)變成T2后部(posteriorT2),而且還將腹1(A1)節(jié)段變成胸節(jié)段.Lewis提出,bx與bxd在演化中來(lái)源于基因重復(fù)(duplication),以T2節(jié)段為基態(tài),促進(jìn)T3節(jié)段和A1節(jié)段的發(fā)育.也就是說(shuō),在1951年Lewis意識(shí)到染色體上相鄰的基因?qū)?yīng)于身體上相鄰的部分.到1955年,他發(fā)現(xiàn)了更多的突變,如pbx和Cbx等,他認(rèn)為這幾個(gè)相鄰的基因功能相關(guān),在發(fā)育中有序地起作用.1953年,Watson和Crick推出DNA雙螺旋模型后,如何具體定義基因再度成為問(wèn)題.孟德?tīng)枙r(shí)代確定不同性狀的因子是后來(lái)認(rèn)為的不同基因.摩爾根時(shí)代的突變被認(rèn)為反映了基因.不過(guò),如何確定表型相似的兩個(gè)突變是位于兩個(gè)不同基因還是同一基因的兩個(gè)不同突變?那時(shí)是靠觀察兩個(gè)突變是否能有重組,做多個(gè)交配,看很多后代;如果兩個(gè)突變可以有重組,說(shuō)明它們是不同基因的突變,如果不能觀察到重組,說(shuō)明它們是同一基因上不同的突變.DNA時(shí)代以后,基因在DNA水平如何定義,從哪里到哪里是一個(gè)基因?美國(guó)的SeymourBenzer(1921～2007年)更新了基因的遺傳學(xué)定義.他用噬菌體的實(shí)驗(yàn)表明,突變就是DNA堿基對(duì)的改變.突變小到一個(gè)堿基對(duì)的改變,大到很長(zhǎng)一段DNA的改變.突變反映了基因,但不等同于整個(gè)基因,兩個(gè)突變可能是在同一個(gè)基因內(nèi)部,也可能是在兩個(gè)不同基因.不同染色體上的突變是不同的基因,很好檢測(cè).但是,如何檢測(cè)同一個(gè)染色體上相近位置的兩個(gè)突變,確定它們是同一個(gè)基因還是不同基因?Benzer于1957年在會(huì)議上、1959年正式發(fā)表文章提出順?lè)礄z測(cè)(cis-transtest)來(lái)證明是同一基因還是兩個(gè)基因(圖2).順?lè)礄z測(cè)將兩個(gè)突變放在同一個(gè)染色體(順)和配對(duì)的兩個(gè)染色體(反)上分別檢測(cè)表型.順式無(wú)表型、反式有表型的兩個(gè)突變屬于同一基因,順式和反式皆無(wú)表型的兩個(gè)突變屬于兩個(gè)基因.Lewis在1951年分析果蠅時(shí)含有順?lè)礄z測(cè).他在1955年實(shí)際已提出互補(bǔ)檢測(cè)(Lewis,1955年).他發(fā)現(xiàn),bx與Ubx的順式bxUbx/++表型微弱,反式bx+/+Ubx表型很強(qiáng),Ubx與bxd的順式Ubxbxd/++只顯Ubx表型,反式Ubx+/+bxd顯bxd的表型(Lewis,1951年).Lewis通過(guò)表型推論bx和Ubx兩基因有相互作用,Ubx與bxd有相互作用.20世紀(jì)50年代末后,按Benzer的定義,順式無(wú)表型、反式有表型的兩個(gè)突變應(yīng)該是同一個(gè)基因的兩個(gè)突變,而不是兩個(gè)基因,對(duì)Lewis的結(jié)果如果簡(jiǎn)單地推論,可以說(shuō):他研究的不是多個(gè)基因,而是編碼同一個(gè)蛋白質(zhì)的基因上不同位點(diǎn)的改變?對(duì)此,Lewis感到迷茫.當(dāng)然,對(duì)Ubx與bxd的順?lè)礄z測(cè)得到結(jié)果并非最簡(jiǎn)單.1961年,法國(guó)遺傳學(xué)家Fran?oisJacob(1920年～)和JacquesMonod(1910～1976年)提出操縱子學(xué)說(shuō),認(rèn)為基因有結(jié)構(gòu)部分和調(diào)節(jié)部分(當(dāng)時(shí)稱為結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因,相當(dāng)于現(xiàn)在編碼蛋白質(zhì)部分和調(diào)節(jié)區(qū)域)在細(xì)菌中幾個(gè)功能(如半乳糖代謝)相關(guān)的基因可以組成一個(gè)操縱子(operon),但在高等生物很少見(jiàn)相關(guān)功能的基因聚集在一起.例如,Lewis指出孟德?tīng)栄芯康膸讉€(gè)影響豌豆豆莢顏色和皺褶的基因相距很遠(yuǎn).一直到20世紀(jì)50年代,Lewis研究的注意力在基因發(fā)生和演化,盡管他實(shí)際已經(jīng)開(kāi)始了發(fā)育研究1963年,Lewis明確將注意力轉(zhuǎn)移到發(fā)育,研究相鄰的5個(gè)基因:bx,Cbx,Ubx,bxd,pbx.他提出這些基因形成一個(gè)復(fù)合體(genecomplex),正如細(xì)菌的操縱子里有幾個(gè)功能相關(guān)的基因,這些相鄰基因參與相關(guān)的功能:確定果蠅身體的節(jié)段.Lewis檢測(cè)基因的效應(yīng)作用后提出:bx,Ubx,bxd和pbx等突變?cè)斐苫蚬δ苋笔?dǎo)致表型(loss-of-function,缺失功能突變),而Cbx突變?cè)斐苫蚬δ茉黾訉?dǎo)致表型(gain-of-function增加功能突變),這是遺傳學(xué)第一次明確使用這兩個(gè)詞,以前常用Muller提出的hypomorph和neomorph等詞.因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)Cbx+/+Ubx有Cbx的表型(T2變成T3)而CbxUbx/++無(wú)表型,且兩種突變同時(shí)存在時(shí)僅有可能顯Cbx表型,不顯Ubx表型,Lewis提出Cbx的作用是調(diào)節(jié)Ubx.在無(wú)Cbx突變的情況下,Ubx缺失功能性突變(Ubx-)導(dǎo)致正常Ubx(Ubx+)功能降低,表型為T(mén)3變成T2.而在有正常Ubx+時(shí),Cbx導(dǎo)致正常Ubx+功能增加,表型為T(mén)2變成T3.他進(jìn)一步提出,bx和Cbx兩個(gè)都是調(diào)節(jié)子(operator),調(diào)節(jié)Ubx,bdx和pbx.通過(guò)分析遺傳嵌合體,他發(fā)現(xiàn)這些基因的作用都是細(xì)胞自主的,也就是說(shuō)有突變的細(xì)胞有表型,而不是影響鄰近的細(xì)胞(在分子機(jī)理上,我們現(xiàn)在的理解是有些基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)物可以彌散作用于其他細(xì)胞,而不是在產(chǎn)生蛋白質(zhì)的細(xì)胞本身起作用,這種是細(xì)胞非自主作用(cellnon-autonomous).1964和1968年,Lewis還發(fā)表了有關(guān)文章(Lewis1964年,1968年),其后10年只在系里年會(huì)以及偶爾在學(xué)術(shù)報(bào)告講其結(jié)果,未發(fā)表相關(guān)論文.1978年,英國(guó)劍橋的發(fā)育遺傳學(xué)家PeterLawrence(1941年～)建議Nature主編邀請(qǐng)Lewis撰文.Lewis發(fā)表于1978年的文章“控制果蠅節(jié)段形成的基因復(fù)合體”總結(jié)了自己多年的研究,而且主要用果蠅胚胎的節(jié)段進(jìn)行研究,因?yàn)閷?shí)際上影響果蠅胸腹節(jié)段形成的基因,突變后多半導(dǎo)致死亡,不能存活到成蟲(chóng)期,最初那些可以看到成蟲(chóng)的都是一些特別突變,沒(méi)有完全失去基因功能,要研究多數(shù)的突變,需要觀察胚胎.在1969～1977年無(wú)論文發(fā)表期間,Lewis繼續(xù)做研究.他發(fā)現(xiàn)一個(gè)缺陷型突變(DfP9),失去相當(dāng)一段染色體,缺失整個(gè)雙胸集合區(qū),他從此命名基因集落為雙胸復(fù)合體(Bithoraxcomplex,BX-C).雙胸復(fù)合體全部缺失的表型是第一期幼蟲(chóng)致死,胚胎的T3至A8節(jié)段全部變成T2節(jié)段.在較大段的染色體缺失的基礎(chǔ)上,Lewis逐段加回小段染色體,從而確定不同段的功能.他發(fā)現(xiàn)加入越長(zhǎng)的片段,體節(jié)恢復(fù)越多:如果在DfP9基礎(chǔ)上,通過(guò)Dp100引入bx和Ubx,可以恢復(fù)T3,如果通過(guò)DpP10引入bx,Ubx,bxd和pbx,可以恢復(fù)A1節(jié)段.如果加其他基因,包括iab2,iab3,iab8等,才能恢復(fù)所有8個(gè)腹節(jié)段.他發(fā)現(xiàn)以后稱為“共線性”(co-linearity)的規(guī)律:調(diào)節(jié)身體偏前端體節(jié)的基因,在雙胸復(fù)合體內(nèi)部靠染色體近端;而調(diào)節(jié)身體偏后端體節(jié)的基因,在染色體上偏遠(yuǎn)端(圖3).1978年,Lewis總結(jié)了控制BX-C的6條規(guī)則:(ⅰ)基因的抑制和去抑制常由順式調(diào)節(jié)元件控制;(ⅱ)基因一般是單獨(dú)而不是協(xié)調(diào)性地抑制;(ⅲ)BX-C受一個(gè)主要的調(diào)節(jié)基因Pc等所負(fù)調(diào)控;(ⅳ)在一個(gè)節(jié)段去抑制的基因在其后面的節(jié)段都去抑制(也就是表達(dá));(ⅴ)越靠后面的節(jié)段,越多的BX-C基因去抑制(ⅵ)越靠復(fù)合體近端的基因,越可能去抑制.其中Lewis妻子Pam在1947年發(fā)現(xiàn)Pc(Polycomb,“多梳”)基因,Lewis證明Pc是BX-C的主要負(fù)性調(diào)節(jié)基因到20世紀(jì)80年代以后,他和實(shí)驗(yàn)室的人(特別是IanDuncan)對(duì)Pc的抑制作用還有更多研究.近年來(lái),很多人對(duì)Pc感興趣,它是表觀遺傳學(xué)的一個(gè)熱點(diǎn).Lewis研究BX-C時(shí),還提出和考慮了果蠅胸節(jié)段翅膀形成的演化:果蠅是T2節(jié)段長(zhǎng)出一對(duì)翅膀T3節(jié)段長(zhǎng)殘翅,而其演化的前體是兩對(duì)翅膀,T3也長(zhǎng)翅膀,演化再遠(yuǎn)的前體其腹部也長(zhǎng)翅膀.BX-C的作用是抑制T3以及腹節(jié)段長(zhǎng)翅膀,使它們不同于T2.20世紀(jì)50～60年代,Lewis研究輻射與癌癥的關(guān)系時(shí),他認(rèn)為“輻射可以致癌”的結(jié)論與美國(guó)政府主持原子能的將軍發(fā)生沖突,遭多方面攻擊,包括有科學(xué)家聲稱他的分析不科學(xué).Lewis多年堅(jiān)持發(fā)表多篇論文以事實(shí)和分析得出科學(xué)結(jié)論,最終大家接受他的結(jié)論,而不相信外行或相信貌似公允但為偏見(jiàn)和利益發(fā)言的那些科學(xué)家.Lewis發(fā)明了遺傳研究很有用的工具.遺傳學(xué)研究經(jīng)常要誘導(dǎo)突變,如Muller的物理方法和化學(xué)方法.1968年,Lewis和Bacher發(fā)現(xiàn)甲基磺酸乙酯(ethymethanesulfonate,EMS)是很好的化學(xué)誘變劑.后來(lái)知道EMS通常造成很小的突變(常常是點(diǎn)突變),而突變位點(diǎn)分布相對(duì)比較均勻,被應(yīng)用于果蠅和其他動(dòng)物的遺傳研究,目前仍與ENU(N-ethyl-N-nitrosourea)為常用的化學(xué)致變劑.3用遺傳研究果蠅胚胎發(fā)育果蠅一生分幾個(gè)時(shí)期,在室溫中:受精后開(kāi)始胚胎發(fā)育(embryo),24h后變成一期幼蟲(chóng)(firstinstarlarva),6天左右經(jīng)過(guò)兩次蛻皮變成三期幼蟲(chóng),其后結(jié)繭蛹化(pupation),4天左右羽化(eclosion)為成蟲(chóng)(adult),8h后性成熟,其后可以活幾十天.為什么20世紀(jì)前幾十年少有科學(xué)家研究果蠅胚胎發(fā)育?除因其體積小以外,它與人類差異很大也是原因.果蠅胚胎最早是合胞體,細(xì)胞核分裂而在同一個(gè)細(xì)胞共享細(xì)胞漿,細(xì)胞核分裂達(dá)256個(gè)細(xì)胞核時(shí),細(xì)胞核才移動(dòng)到細(xì)胞膜附近,繼續(xù)分裂至6000個(gè)細(xì)胞核左右才形成細(xì)胞膜,分成6000個(gè)細(xì)胞.而人類與一般脊椎動(dòng)物的受精卵1個(gè)細(xì)胞分裂成為2個(gè),2個(gè)成為4個(gè),如此以往,細(xì)胞核一直分在不同的細(xì)胞中.這種巨大的差別,使人們覺(jué)得研究果蠅的胚胎對(duì)于理解高等動(dòng)物胚胎發(fā)育意義不大,所以熱衷研究果蠅胚胎的人不是很多.摩爾根時(shí)代用遺傳研究發(fā)育還有一個(gè)障礙:當(dāng)時(shí)發(fā)育的主要對(duì)象是胚胎學(xué),而摩爾根與學(xué)生們重視成蟲(chóng)的表型,不重視胚胎,雖然他們并非完全無(wú)視胚胎.曾有人認(rèn)為,早期胚胎發(fā)育不由遺傳控制,而是簡(jiǎn)單的生長(zhǎng)和擴(kuò)大.DonaldPoulson的一系列研究推翻了這種想法.Poulson在加州理工做研究生時(shí)開(kāi)始描述果蠅胚胎發(fā)育,研究染色體異常與胚胎發(fā)育的關(guān)系.他長(zhǎng)年在耶魯大學(xué)任教期間繼續(xù)這些研究,包括確定了Notch的胚胎表型是表皮減少、神經(jīng)系統(tǒng)增加,后者增加的代價(jià)是表皮減少,從而提示細(xì)胞可能需要選擇變成神經(jīng)還是表皮(Poulson,1937年,1940年,1950年).Lewis從20世紀(jì)50～60年代研究果蠅成蟲(chóng)的發(fā)育,20世紀(jì)70年代后,他和其他人都主要研究胚胎的發(fā)育.實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)的發(fā)源地是德國(guó),在19世紀(jì)末以WilhelmRoux(1850～1924年)研究胚胎兩個(gè)細(xì)胞的差別為代表,而20世紀(jì)初以HansSpemann(1869～1941年)于1924年發(fā)表的組織者(organizer)實(shí)驗(yàn)為代表.有趣的是,德國(guó)經(jīng)過(guò)希特勒時(shí)代后,科學(xué)大幅度滑坡,20世紀(jì)80年代又再次成為世界發(fā)育生物學(xué)的中心,且吸引了一批美國(guó)人到德國(guó)做博士后,短暫、局部地逆轉(zhuǎn)了當(dāng)時(shí)已形成的歐洲到美國(guó)的留學(xué)潮.用遺傳學(xué)研究果蠅胚胎發(fā)育,帶來(lái)了發(fā)育生物學(xué)研究第三次高潮,其主力之一是女科學(xué)家ChristianeNüsslein-Volhard(1942年～).在迄今仍少見(jiàn)女科學(xué)家的德國(guó),Nüsslein-Volhard的成功很突出.因經(jīng)常不做家庭作業(yè)、有幾門(mén)功課考分不高,她被中學(xué)老師評(píng)語(yǔ)稱“決定性懶惰”的學(xué)生,認(rèn)為她只對(duì)自己感興趣的東西用功,不管其他.她研究生時(shí)期的分子生物學(xué)論文發(fā)表于Nature,于1973年獲博士學(xué)位.那時(shí),分子生物學(xué)是方興未艾的熱門(mén),果蠅已經(jīng)多年冷門(mén),她的同學(xué)后來(lái)有發(fā)展分子生物學(xué)技術(shù)而既做好事業(yè)又致富的,她卻自己讀文獻(xiàn)、找人交談,想用遺傳學(xué)研究發(fā)育;讀到果蠅的bicaudal(“雙尾”)突變后進(jìn)一步思考,最后決定于1975年初去瑞士Gehring的實(shí)驗(yàn)室做博士后學(xué)習(xí)研究果蠅兩年.她回德國(guó)找不到教職而到KlausSander的昆蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室再做了一年博士后,學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)的經(jīng)典方法.Nüsslein-Volhard博士后期間沒(méi)有太多成果,不過(guò)她在Gehring實(shí)驗(yàn)室與其他人合作發(fā)明改進(jìn)了兩個(gè)小而有用的技術(shù),從而可以較快地收集大量胚胎,用化學(xué)清潔劑后可以較清晰地觀察胚胎,為她以后的工作埋下了伏筆.她在Gehring實(shí)驗(yàn)室還為以后的合作建立了基礎(chǔ):認(rèn)識(shí)了美國(guó)科學(xué)家EricWieschaus(1947年～).生于美國(guó)南方天主教家庭的Wieschaus,在印第安納的圣母大學(xué)念本科后到耶魯念研究生,第一年跟Poulson學(xué)了果蠅的胚胎發(fā)育,第二年轉(zhuǎn)為當(dāng)時(shí)在耶魯任教的Gehring的研究生,并跟Gehring到瑞士巴塞爾,曾試圖體外培養(yǎng)果蠅胚胎細(xì)胞未果,以制造遺傳嵌合體研究果蠅不同部位是否共有相同細(xì)胞來(lái)源為研究生論文.1978年,德國(guó)海德堡成立了“歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室”(EMBL),讓Nüsslein-Volhard和Wieschaus分別主持青年科學(xué)家小組的工作,他們共用實(shí)驗(yàn)室空間和技術(shù)員,不久決定合作,大量篩選影響果蠅胚胎發(fā)育的基因.4基因組織的基因1978～1980年的3年中,Nüsslein-Volhard和Wieschaus的工作改觀了發(fā)育生物學(xué).他們希望篩選影響特定發(fā)育過(guò)程(如胚胎節(jié)段形成)的所有基因.一般認(rèn)為,他們首創(chuàng)了篩選控制多細(xì)胞生物特定生物學(xué)過(guò)程全部基因的“飽和突變”(saturationmutagenesis)或“飽和篩選”.在單細(xì)胞生物,美國(guó)遺傳學(xué)家LelandHartwell于1970年已做過(guò)大量篩選:用酵母尋找控制細(xì)胞分裂周期的基因.但研究多細(xì)胞生物的科學(xué)家只做單個(gè)或幾個(gè)基因,而Nüsslein-Volhard和Wieschaus(1980年)通過(guò)“飽和突變”篩選了很多基因.Nüsslein-Volhard和Wieschaus工作的理論基礎(chǔ)是前人已研究了影響節(jié)段形成的基因,多半在成蟲(chóng)、少數(shù)在胚胎,他們決定要找影響胚胎節(jié)段形成的所有或大多數(shù)基因.對(duì)一個(gè)個(gè)基因分別進(jìn)行突變,然后確定是否影響了特定的過(guò)程,這就是飽和突變.如何知道突變已經(jīng)飽和?一是應(yīng)該有多個(gè)基因突變導(dǎo)致相似的表型,二則同一基因應(yīng)該有多次不同的突變.他們的工作還有技術(shù)基礎(chǔ),如:(ⅰ)他們假設(shè)參與胚胎節(jié)段形成的突變基因很可能導(dǎo)致隱性致死,所以用Muller的平衡致死系為起始尋找基因;(ⅱ)要研究胚胎發(fā)育,需要快速大量觀察胚胎的形態(tài),這依賴于他們改進(jìn)Nüsslein-Volhard在博士后期間的技術(shù),可以讓胚胎發(fā)育剛完成的一期幼蟲(chóng)透明,然后通過(guò)胚胎表面的剛毛分布(位于腹側(cè),每個(gè)節(jié)段不同,節(jié)段內(nèi)前后有別)識(shí)別果蠅胚胎的節(jié)段和節(jié)段前后;(ⅲ)他們需要造成基因突變,每次突變一個(gè)基因,且基因改變要比較小.用Lewis和Bacher于1968年發(fā)明的EMS做化學(xué)誘變劑可以滿足要求.在Nüsslein-Volhard和Wieschaus的工作以前,已知影響果蠅胚胎發(fā)育的基因有兩類:一類如bicaudal,是母親的基因影響胚胎,表型是影響胚胎全局,突變種的胚胎有兩個(gè)尾部結(jié)構(gòu),長(zhǎng)在首尾兩端,沒(méi)有頭、胸以及腹的前部,這種表型提示正常bicaudal基因參與前后軸(anterior-posterioraxis)的形成;另一類是同源異形突變,導(dǎo)致一個(gè)節(jié)段變成另外一個(gè)節(jié)段,反映被突變的基因正常時(shí)參與確定節(jié)段身份(segmentidentity)(圖4).在這兩種之間,應(yīng)該還有其他基因.果蠅有4套染色體.在篩選了第2號(hào)染色體上4000多個(gè)突變以及平時(shí)收集的一些突變后,NüssleinVolhard和Wieschaus選擇了其中15個(gè)突變,總結(jié)其結(jié)果得出推論發(fā)表于1980年的Nature(圖5).他們報(bào)道的15個(gè)基因(6個(gè)由前人發(fā)現(xiàn),9個(gè)由他們發(fā)現(xiàn))在胚胎中導(dǎo)致的表型可以歸為3類:(ⅰ)區(qū)段基因(gapgenes),這類基因突變導(dǎo)致胚胎多個(gè)節(jié)段缺失,如knirps突變?nèi)笔2～A7節(jié)段,Krüppel突變?nèi)笔1～A5且有A6的鏡像重復(fù),hunchback(“駝背”)突變?nèi)笔2和T3;(ⅱ)成對(duì)規(guī)則基因(pair-rulegenes),如odd-skipped(“奇跳”)突變?nèi)笔2,A1,A3,A5,A7節(jié)段,even-skipped(“偶跳”)突變?nèi)笔1,T3,A2,A4A6,A8節(jié)段,paired突變?nèi)笔1,T3,A2,A4,A6,A8節(jié)段等;(ⅲ)節(jié)段極性基因(segmentationpolarity),每個(gè)節(jié)段內(nèi)有前后極性,這些基因突變導(dǎo)致節(jié)段內(nèi)極性改變,如gooseberry突變導(dǎo)致節(jié)段內(nèi)后半缺失,而前半鏡像重復(fù).有些基因參與兩個(gè)過(guò)程,如engrailed突變時(shí),既導(dǎo)致成對(duì)問(wèn)題也導(dǎo)致節(jié)段內(nèi)部的問(wèn)題,說(shuō)明一個(gè)基因可以多次在不同過(guò)程中發(fā)揮作用.在討論中,Nüsslein-Volhard和Wieschaus從節(jié)段形成擴(kuò)展到前后軸形成,提出胚胎整體的前后由母性基因提供的產(chǎn)物所確定,其后胚胎自己的基因起作用,逐步從大的多節(jié)段到兩個(gè)節(jié)段、到每個(gè)節(jié)段一步一步確定,而他們發(fā)現(xiàn)的基因就在這些步驟中起作用.這樣,他們通過(guò)遺傳突變種的表型推測(cè)了發(fā)育的機(jī)理,并發(fā)現(xiàn)了具體的基因,供進(jìn)一步驗(yàn)證和研究,了解發(fā)育是否分步進(jìn)行,各個(gè)基因如何單獨(dú)或合作參與發(fā)育.他們?cè)诤Y選第2號(hào)染色體后,繼續(xù)篩選了第3號(hào)染色體、X染色體(第1號(hào))和比較小的第4號(hào)染色體,尋找影響果蠅幼蟲(chóng)表皮發(fā)育的基因,共發(fā)現(xiàn)了約130個(gè)基因(Nüsslein-Volhardetal.,1984年;Wieschausetal.,1984年),一系列文章發(fā)表于德國(guó)的發(fā)育生物學(xué)刊物RouxArchiveofDevelopmentalBiology(以德國(guó)實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)家Roux命名,原為德文的雜志,這時(shí)已改用英文).此后,Wieschaus離開(kāi)海德堡回美國(guó),一直在普林斯頓研究果蠅胚胎發(fā)育,特別是腸胚化過(guò)程(gastrulation)中細(xì)胞的移動(dòng).Nüsslein-Volhard不久得到圖賓根的馬普研究所職位,以后一直在圖賓根.Nüsslein-Volhard和Wieschaus在1980年報(bào)道的15個(gè)基因是受精卵發(fā)育開(kāi)始后胚胎發(fā)育過(guò)程中由胚胎本身細(xì)胞所表達(dá).Nüsslein-Volhard和其他實(shí)驗(yàn)室另外還特意篩選了母性效應(yīng)基因(maternaleffecgenes).母性效應(yīng)基因最初是用遺傳學(xué)定義:母親的基因型而不是胚胎本身的基因型決定胚胎的表型具體是因?yàn)槭芫押团咛ナ窃谀阁w進(jìn)行發(fā)育,所以父親對(duì)胚胎只是貢獻(xiàn)DNA,而母體不僅貢獻(xiàn)DNA也控制胚胎發(fā)育的一些步驟,這些控制是通過(guò)母體基因表達(dá)在母體細(xì)胞,比如多個(gè)圍繞受精卵的母體細(xì)胞形成一層,這些細(xì)胞的位置和特性影響受精卵和胚胎的發(fā)育.另外,有些母體合成的RNA或蛋白質(zhì)進(jìn)入卵細(xì)胞后影響胚胎發(fā)育.篩選母體影響后代的基因,從設(shè)計(jì)和分析角度,比篩選在胚胎內(nèi)起作用的基因要麻煩,迄今在其他動(dòng)物中研究母體對(duì)后代發(fā)育的影響常常很難,不過(guò)研究果蠅的人有辦法.幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室在果蠅中發(fā)現(xiàn)約30個(gè)影響胚胎發(fā)育的母體效應(yīng)基因,其中Nüsslein-Volhard實(shí)驗(yàn)室著重研究了bicoid,其功能缺失時(shí),果蠅胚胎有兩個(gè)尾,分別在首尾兩端,沒(méi)有頭部.后續(xù)遺傳、發(fā)育和分子生物學(xué)的研究顯示,bicoid是果蠅早期AP軸形成的關(guān)鍵基因.5采用高效聚氧體化合物用于誘導(dǎo)果蠅dna斯坦福大學(xué)的DavidHogness(1925年～)首先提出現(xiàn)在所謂的基因組分析.他在20世紀(jì)50～60年代研究噬菌體的分子生物學(xué)和生物化學(xué).1968年,在噬菌體熱潮中領(lǐng)先的Hogness決定到美國(guó)的Lewis、澳大利亞和德國(guó)的3個(gè)果蠅實(shí)驗(yàn)室學(xué)術(shù)休假,學(xué)習(xí)果蠅和多線染色體.1972年,在他的研究經(jīng)費(fèi)申請(qǐng)中,他提出要將果蠅染色體的所有DNA分成有重疊的片段,用噬菌體裝到細(xì)菌中,建成果蠅的基因組DNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary),通過(guò)遺傳表型和基因定位找到突變的基因(后來(lái)稱為位置克隆,positionalcloning).Hogness認(rèn)為,研究果蠅要能像分析噬菌體一樣,從表型到DNA.他的提議很大膽,因?yàn)槭删w比果蠅簡(jiǎn)單很多:噬菌體是細(xì)菌的病毒,由DNA和蛋白質(zhì)組成,細(xì)菌是單細(xì)胞,噬菌體沒(méi)有細(xì)胞,而果蠅是多細(xì)胞生物;后來(lái)得知,Hogness于20世紀(jì)60年代研究的噬菌體的DNA僅有48000個(gè)堿基對(duì)(bp),而2000年得知,果蠅的基因組含160000000bp,是前者的4000倍.回過(guò)頭來(lái)看,在多細(xì)胞生物中克隆基因,果蠅相對(duì)比較容易.一是可以從已經(jīng)克隆的基因,利用染色體的突變(包括倒位和缺失等),在染色體上行走(甚至跳躍)(Benderetal.,1983年),直至目的基因;如果沒(méi)有物理位置近的基因,也可以直接利用唾液腺的多線染色體的粗大,在遺傳定位了基因的大體位置后,用小刀從多線染色體上切下一段,克隆后再進(jìn)一步尋找目的基因.用刀切染色體DNA只能在果蠅,而不能在其他常用實(shí)驗(yàn)生物上實(shí)現(xiàn).拿到DNA后,可以制備標(biāo)記的探針對(duì)唾液腺多線染色體進(jìn)行原位雜交,確定得到的DNA是否確實(shí)在遺傳預(yù)計(jì)的染色體部位,這也是果蠅的優(yōu)點(diǎn).Hogness提出研究果蠅基因組一年后,1973年,舊金山加州大學(xué)的HebertBoyer和斯坦福大學(xué)的StanleyCohen才發(fā)明大家常用的重組DNA技術(shù).1974年,Hogness實(shí)驗(yàn)室用質(zhì)粒將果蠅的DNA克隆到細(xì)菌中(Wensinketal.,1974年);1978年,當(dāng)時(shí)在加州理工的TomManiatis(1943年～)等將果蠅、絲蠶和家兔的基因組DNA分別剪切后裝入噬菌體載體,制備了3個(gè)基因組文庫(kù)(Maniatisetal.,1978年).Hogness實(shí)驗(yàn)室1978年克隆了BX-C的DNA,1979年確定Ubx基因,結(jié)果于1980年在斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化系的學(xué)術(shù)會(huì)議上展出,但直到1983年才正式發(fā)表克隆雙胸復(fù)合體DNA的文章(Benderetal.,1983年a);同年Hogness實(shí)驗(yàn)室與Lewis合作報(bào)道了BX-C遺傳突變?cè)贒NA的改變,從而將BX-C中特定基因與已有遺傳突變聯(lián)系起來(lái)(Benderetal.,1983年b).Hogness實(shí)驗(yàn)室在幾篇摘要中報(bào)道,他們確定了BX-C編碼UbxmRNA的部分,其博士后Akam回到英國(guó)劍橋后,于1983年報(bào)道了用原位雜交觀察到Ubx的mRNA確實(shí)在第3期幼蟲(chóng)表達(dá)于可以預(yù)計(jì)的區(qū)域(T3和腹節(jié)段的成蟲(chóng)盤(pán),imaginaldiscs)(Akam,1983年a,1983年b)Ubx基因較長(zhǎng),基因組DNA有約70kb(千堿基對(duì))而轉(zhuǎn)錄多個(gè)mRNA,Hogness實(shí)驗(yàn)室一時(shí)未發(fā)表其編碼的蛋白質(zhì)序列.1983年,美國(guó)印第安納大學(xué)Kaufman和瑞士巴塞爾大學(xué)生物中心的Gehring兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室報(bào)道克隆了ANT-C(Scottetal.,1983年;Garberetal.,1983年).在克隆基因組DNA的過(guò)程中,這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室都用了Hogness實(shí)驗(yàn)室發(fā)明的染色體行走方法.1984年WilliamMcGinnis,MichaelLevine,ErnestHafenAtsushiKuroiwa和WalterGehring等5位作者于3月MathewScott和AmyWeiner兩位作者于7月分別發(fā)表文章,獨(dú)立發(fā)現(xiàn)ANT-C與BX-C編碼的mRNA之間有相似的核苷酸序列,且另外一些基因也含有這一序列(McGinnisetal.,1984年a;Scott和Weiner1984年).這一核酸序列編碼約60個(gè)氨基酸(Scott和Weiner,1984年),被稱為同源異形盒(homeobox)(McGinnisetal.,1984年b).同源異形盒編碼的蛋白質(zhì)區(qū)域稱為同源異形域(homeodomain).Gehring實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn),果蠅同源異形域的序列與酵母的交配型位點(diǎn)基因uf0611和uf0612(MATuf0611,uf0612)相似(Shepherdetal.1984年),而已知這些基因編碼的蛋白質(zhì)在酵母中控制其他基因的轉(zhuǎn)錄.Laughon和Scott(1984年)發(fā)現(xiàn)果蠅同源異形域還相似于細(xì)菌的DNA結(jié)合蛋白:uf06c抑制子(uf06crepressor).而以哈佛大學(xué)MarkPtashne為代表的分子生物學(xué)家到那時(shí)已較多研究過(guò)uf06c抑制子,知道它如何結(jié)合DNA而調(diào)節(jié)其他基因的轉(zhuǎn)錄,uf06c抑制子當(dāng)時(shí)是基因表達(dá)調(diào)控的最佳范例(Ptashne,1986年)同源異形域被預(yù)計(jì)相似于uf06c抑制子的5個(gè)uf061螺旋中的螺旋2和螺旋3,其間1個(gè)uf062轉(zhuǎn)折,亦稱螺旋-轉(zhuǎn)-螺旋(helix-turn-helix),而uf061螺旋3已知為uf06c抑制子識(shí)別DNA的部分.以后結(jié)構(gòu)生物學(xué)通過(guò)X衍射分析同源異形域有1個(gè)N端臂(Nterminalarm)和3個(gè)uf061螺旋,其中uf061螺旋3確實(shí)與uf06c抑制子的uf061螺旋3一樣嵌入DNA的大溝(majorgroove)與磷酸和堿基都有作用,而N端臂也與DNA有結(jié)合.控制果蠅發(fā)育的基因編碼的同源異形域含有uf06c抑制子中被證明為結(jié)合DNA的序列,自然立即提示同源異形域能結(jié)合DNA.加州大學(xué)舊金山分校的TomKornberg和PatrickO’Farrell合作克隆到engrailed基因后(Kuneretal.,1985年),也發(fā)現(xiàn)其cDNA編碼的蛋白質(zhì)含同源異形域(Pooleetal.,1985年).O’Farrell實(shí)驗(yàn)室的法裔科學(xué)家ClaudeDesplan等實(shí)驗(yàn)證明果蠅的同源異形域能結(jié)合特異的DNA序列(Desplanetal.,1985年),包括engrailed基因本身的上游序列,從而提示可以調(diào)節(jié)基因表達(dá).而Gehring實(shí)驗(yàn)室的日本科學(xué)家YasushiHiromi克隆調(diào)節(jié)發(fā)育的基因fushitarazu(ftz)的上游序列,將此序列于ftz基因編碼蛋白質(zhì)的部分分開(kāi),而放到編碼細(xì)菌lacZ的基因上游,制造融合基因(Hiromi和Gehring,1985年):ftz上游-lacZ編碼部分.然后,通過(guò)轉(zhuǎn)基因?qū)⒋巳诤匣驅(qū)牍?發(fā)現(xiàn)lacZ基因編碼的蛋白質(zhì)在果蠅胚胎表達(dá)的模式與果蠅內(nèi)源的ftz基因很相像,證明控制發(fā)育的基因其非蛋白質(zhì)編碼的上游序列確實(shí)能夠控制編碼蛋白質(zhì)部分的基因之表達(dá).6ap軸的轉(zhuǎn)錄和分子鑒定20世紀(jì)80年代中期以后,很多調(diào)節(jié)果蠅發(fā)育的基因紛紛被克隆.基因的功能、表達(dá)和調(diào)控,呈現(xiàn)了美麗的分子機(jī)理.Lewis認(rèn)為BX-C含有多個(gè)基因,他的工作與后人的分析BX-C突變有9類(abx/bx,bxd/pbx,iab-2,iab-3,iab-4,iab-5,iab-6,iab-7,iab-8,9).SanchezHerreroetal.(1985年)和Tiongetal.(1985年)發(fā)現(xiàn)有3個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因(Ubx,abdA,AbdB).這3個(gè)蛋白質(zhì)都含有同源異形域.遺傳分析發(fā)現(xiàn),同時(shí)缺失這3個(gè)基因的表型等同于缺失整個(gè)BX-C.BX-C區(qū)域DNA完全測(cè)序后也證實(shí)只有這3個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因,其他DNA片段是調(diào)節(jié)編碼蛋白質(zhì)的基因(Martinetal.,1995年;Maeda和Karch,2006年).Nüsslein-Volhard實(shí)驗(yàn)室也從遺傳到分子研究了果蠅發(fā)育的基因.他們確定bicoid基因是胚胎形成AP軸關(guān)鍵的早期基因,克隆后發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)物蛋白也含同源異形域.進(jìn)一步的研究表明,母親的bicoid基因轉(zhuǎn)錄成mRNA后,被運(yùn)送到受精卵中,積聚于相當(dāng)于以后胚胎最前段的部位,其指導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)也集中于胚胎最前段,Bicoid蛋白質(zhì)有限地彌散,在胚胎中產(chǎn)生從前到后的濃度梯度,改變其梯度就能改變AP軸,說(shuō)明Bicoid蛋白質(zhì)是典型的形態(tài)發(fā)生元(morphogen),在不同位置存在于不同濃度決定細(xì)胞不同的命運(yùn)(圖6).多個(gè)實(shí)驗(yàn)室克隆了影響AP軸的其他基因后,在分子層面驗(yàn)證了Nüsslein-Volhard和Wieschaus在1980年的設(shè)想.首先,很多都是含同源異形域的轉(zhuǎn)錄因子,其次原位雜交研究它們?cè)诠壟咛サ闹斜磉_(dá)后發(fā)現(xiàn):gap基因在需要其功能的幾個(gè)連續(xù)節(jié)段中表達(dá),pair-rule基因在需要其工作的每隔1個(gè)節(jié)段表達(dá)segmentationpolarity基因在其工作的節(jié)段內(nèi)前后特定局部表達(dá).分子生物學(xué)與遺傳學(xué)優(yōu)美地互補(bǔ),在分子水平理解發(fā)育的機(jī)理:母性效應(yīng)基因的產(chǎn)物(如Bicoid)在胚胎僅有1個(gè)細(xì)胞的時(shí)候就呈濃度梯度分布,它們少數(shù)幾個(gè)蛋白質(zhì)確定AP軸,再調(diào)節(jié)gap基因的轉(zhuǎn)錄而不同的gap基因相互作用,確定pair-rule基因的轉(zhuǎn)錄,后者再確定segmentpolarity基因的轉(zhuǎn)錄.在同一個(gè)節(jié)段內(nèi)起作用的segmentpolarity基因有多種,分別表達(dá)在不同排的細(xì)胞內(nèi).從AP軸的確定到segmenpolarity基因的表達(dá)都是轉(zhuǎn)錄調(diào)控,但segmentpolarity基因編碼不同產(chǎn)物,有些如engrailed是轉(zhuǎn)錄因子,有些如wingless(“無(wú)翅”)基因和hedgehog(“刺猬”)基因編碼分泌型的蛋白質(zhì),可以作用于其他細(xì)胞.所以細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,細(xì)胞間的因子引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),都在發(fā)育中起作用,只是果蠅的胚胎因?yàn)殚_(kāi)始是合胞體,前幾步就都用細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄因子,而細(xì)胞成型后也使用細(xì)胞間的信號(hào).除了研究AP軸,Nüsslein-Volhard和Wieschaus的篩選中還發(fā)現(xiàn)了影響背腹軸(DVaxis)的基因(NüssleinVolhardetal.,1980年).美國(guó)Nüsslein-Volhard實(shí)驗(yàn)室的博士后KathrynAnderson等進(jìn)一步研究和分析了DV軸的形成(Anderson和Nüsslein-Volhard,1984年)他們和其他實(shí)驗(yàn)室的一系列研究結(jié)果可以總結(jié)為:母性效應(yīng)的幾個(gè)基因?qū)е孪鄬?duì)于胚胎腹側(cè)的母體細(xì)胞分泌較多,且加工成熟的Sp?tzle蛋白質(zhì)激活胚胎細(xì)胞膜的Toll受體,觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)Tube蛋白質(zhì),激活Pelle蛋白激酶,使Cactus蛋白質(zhì)脫離Dorsal蛋白質(zhì),最終胚胎腹側(cè)的轉(zhuǎn)錄因子Dorsal蛋白較多,形成從腹側(cè)到背側(cè)由高而低的濃度梯度,Dorsal蛋白質(zhì)再通過(guò)濃度依賴性調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá),確定腹側(cè)到背側(cè)形成不同的細(xì)胞命運(yùn).當(dāng)然,AP軸和DV軸可以相互作用,最后決定每個(gè)細(xì)胞的不同身份.在果蠅胚胎只有腸子有左右不對(duì)稱(left-rightaxis),所以LR軸長(zhǎng)期未受重視.20世紀(jì)90年代以后,對(duì)蛙胚、雞胚和鼠胚的研究推動(dòng)了對(duì)LR軸的理解.3個(gè)軸確定胚胎全部體細(xì)胞的發(fā)育,種系發(fā)生細(xì)胞很早與體細(xì)胞分開(kāi),另外有一套調(diào)控的基因,只是其位置受AP軸的影響.3個(gè)軸的確定說(shuō)明動(dòng)物是按軸坐標(biāo)系發(fā)育,以前曾在有些發(fā)育過(guò)程提出過(guò)可能有極坐標(biāo)系,迄今適用甚少(Bryant,1993年).7基因組織疾病果蠅胚胎以合胞體模式開(kāi)始的發(fā)育與脊椎動(dòng)物有巨大差別,自然引起疑問(wèn):研究果蠅胚胎發(fā)育對(duì)理解人在內(nèi)的高等動(dòng)物有意義嗎?Nüsslein-Volhard和Wieschaus的文章發(fā)表后,幾年之內(nèi)有上千科學(xué)家研究果蠅的基因.對(duì)于果蠅前后軸、背腹軸的基因及其產(chǎn)物如何調(diào)控發(fā)育,有較詳盡的研究,發(fā)現(xiàn)它們?nèi)绾畏植?如何相互作用,如何形成上下游關(guān)系,使一個(gè)原本同質(zhì)的單細(xì)胞,逐步變成很多不同身份的細(xì)胞,其中理解了細(xì)胞身份與其所處位置的關(guān)系.果蠅研究的突破很快推動(dòng)人們發(fā)現(xiàn)果蠅基因在高等動(dòng)物的同源基因(homologs和orthologs).同源異形盒發(fā)現(xiàn)后,