銀屑病患者與健康患者外周血h1h2細(xì)胞表達(dá)的比較

銀屑病患者與健康患者外周血h1h2細(xì)胞表達(dá)的比較

銀屑病屬于中醫(yī)學(xué)的“白象”范疇?，F(xiàn)代中醫(yī)著名專家趙炳南認(rèn)為，本病屬于血分?？煨云谥饕茄簻嘏?，主要是肌肉表面感染，也是風(fēng)、冷、濕等因素引起的。靜態(tài)期主要是血液抑制。在疾病的發(fā)展過程中，不同的癥狀可能會(huì)同時(shí)發(fā)生，直到它們相互補(bǔ)償。而在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病是多基因遺傳背景下的T細(xì)胞失常的免疫性疾病,尤其是T輔助細(xì)胞(Thelpercell,Th細(xì)胞)亞群Ⅰ型T輔助細(xì)胞(Thelpercell1,Th1)和Ⅱ型T輔助細(xì)胞(Thelpercell2,Th2)的平衡失調(diào)以及相關(guān)細(xì)胞亞群產(chǎn)生的細(xì)胞因子如γ-干擾素(γ-interferon,IFN-γ)、白介素-4(interleukin-4,IL-4)等在銀屑病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用,其主要作用在于促進(jìn)銀屑病免疫病理損傷。本研究探討銀屑病血熱及血瘀證與外周血Th1/Th2細(xì)胞軸漂移的相關(guān)性,以Th細(xì)胞免疫學(xué)機(jī)制闡釋不同證候銀屑病發(fā)病轉(zhuǎn)歸的意義。病例選擇及一般資料1西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)皮損邊界清楚,紅色斑丘疹,表面覆蓋多層銀白色鱗屑,輕輕搔抓易脫落,露出淡紅色半透明薄膜,刮去薄膜可見點(diǎn)狀出血(Auspitz征陽性)［2］。2中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)血熱型:皮疹色紅,新疹不斷出現(xiàn),鱗屑較多,易于剝除,基底有點(diǎn)狀出血,瘙癢,常伴有口干舌燥,心煩易怒,便干溲黃。舌質(zhì)紅,苔黃膩,脈弦滑。血瘀型:皮損反復(fù)不愈,皮疹多呈斑塊狀,鱗屑較厚,顏色暗紅;舌質(zhì)紫暗有瘀點(diǎn)、瘀斑,脈澀或細(xì)緩。［3］3納入及排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn):符合診斷標(biāo)準(zhǔn);年齡18~65歲;病程0.1~20年;所選病例均為新發(fā)或最近2個(gè)月未作任何治療,且無其他疾病史者;患者及正常志愿者均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):3個(gè)月內(nèi)曾采用系統(tǒng)治療,包括大面積外用強(qiáng)效糖皮質(zhì)類固醇激素、免疫抑制劑;合并有心、腦血管,消化、泌尿和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病,精神病患者;哺乳期、妊娠或擬妊娠的婦女。4臨床資料30例尋常型銀屑病病例來源于2011年9月—2012年4月本院皮膚科,其中門診患者16例,住院患者14例,按中醫(yī)辨證分為血熱證組15例,血瘀證組15例,兩組性別均為男性8例,女性7例;血熱證組年齡24~65歲,平均(46.20±13.97)歲,病程2個(gè)月~7年,平均(3.26±2.98)年;血瘀證組年齡30~64歲,平均(46.13±16.24)歲,病程2~9年,平均(4.97±2.12)年。兩組年齡、性別和病程比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有患者均進(jìn)行銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)評(píng)分(thepsoriasisareaandseverityindexscore,PASI評(píng)分),血熱證組PASI評(píng)分為(15.8±8.6)分;血瘀證組PASI評(píng)分為(7.4±3.3)分。另選同期上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院體檢中心的體檢者16名作為健康對(duì)照組,通過健康查體和血生化檢查排除高血壓、糖尿病、冠心病、高脂血癥及肝、腎疾病,肝、腎功能檢查正常。其中男8名,女8名;年齡23~65歲,平均(42.31±13.61)歲,3組間性別、年齡比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。5觀察指標(biāo)及方法抽取患者及健康人外周靜脈血5mL(肝素抗凝),1000r/min離心5min后取血漿-80℃冰箱凍存?zhèn)錅y(cè),ELISA檢測(cè)血清中Th1細(xì)胞表達(dá)的主要細(xì)胞因子IFN-γ和Th2細(xì)表達(dá)的主要細(xì)胞因子IL-4的水平:具體實(shí)驗(yàn)步驟參照抗人IFN-γ及IL-4ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(theperipheralbloodmononuclearcells,PBMCs)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4的表達(dá),取分離出PBMCs,5000r/min離心5min,去上清后再加磷酸緩沖液(phosphatebufferso-lution,PBS),再次5000r/min離心5min,棄上清,加250μLPBS重懸,200μL/孔PBMC細(xì)胞懸液鋪入96孔板,加試劑(PMA100ng/mL,離子霉素1μg/mL,莫能霉素2μmol/L)刺激6h后收細(xì)胞,300μLPBS,振蕩2000r/min離心5min,去上清后加50μLPBS,再加5μLCD4,孵育10min后,加300μLPBS,振蕩2000r/min離心5min,去上清加胞內(nèi)固定液500μL,30min后再加500μL胞內(nèi)穿膜液,2000r/min離心5min,去上清加70μL胞內(nèi)穿膜液,分別加抗體IFN-γ和IL-4后振蕩過夜。加500μL胞內(nèi)穿膜液振蕩2000r/min離心5min,去上清加300μL胞內(nèi)穿膜液上流式細(xì)胞儀分析。6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì),計(jì)量資料如正態(tài)分布以u(píng)e0af±s表示,成組比較采用方差分析,組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布者,采用非參數(shù)檢驗(yàn)。相關(guān)性比較采用Spearman相關(guān)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。13組外周血PBMCs中CD4+IFN-γ+表達(dá)的比較(表1,圖1)血熱證組外周血PBMC中CD4+IFN-γ+水平顯著高于血瘀證組及健康對(duì)照組(P<0.05),且與PASI評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.05)。2血熱證組、血瘀證組銀屑病患者及健康對(duì)照組外周血PBMCs中CD4+IL-4+表達(dá)(圖2,表2)經(jīng)秩和檢驗(yàn)分析,3組CD4+IL-4+組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),血熱證組、血瘀證組PBMC中CD4+IL-4+水平與PASI評(píng)分均無相關(guān)性(P>0.05)。3血熱證組、血瘀證組銀屑病患者及健康對(duì)照組外周血清中IFN-γ的表達(dá)(表3)血熱證組銀屑病患者外周血清中IFN-γ水平顯著高于血瘀證組及健康對(duì)照組(P<0.05)。血熱證組銀屑病患者血漿中IFN-γ水平與PASI評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.05);血瘀證組銀屑病患者血漿中IFN-γ水平與PASI評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。4血熱證組、血瘀證組銀屑病患者及健康對(duì)照組外周血清中IL-4的表達(dá)(表4)血熱證組銀屑病患者外周血清中IL-4水平顯著低于血瘀證組及健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。血熱、血瘀證銀屑病患者血漿中IL-4水平與PASI評(píng)分無相關(guān)性(P>0.05)。銀屑病早在隋代《諸病源候論.干癬候》就記載:“干癬但有匡郭,皮枯索癢,搔之白屑出是也”［4］。近代國(guó)內(nèi)諸中醫(yī)名家按證候?qū)⑵浞譃檠獰嶙C、血瘀證等多種證候,而證候的分型對(duì)于辨證論治有極大的裨益。趙炳南先生認(rèn)為本病當(dāng)“血分論治”,急性期辨證以血熱為主,兼風(fēng)、寒、濕等因素,治以涼血活血為先［1］。顧氏外科(上海顧伯華、顧伯康兄弟為首的中醫(yī)顧氏外科)［5］倡導(dǎo)用清熱涼血之法犀角地黃湯加減治療該病。朱仁康教授將“血分論治”深入至血熱風(fēng)燥和血虛風(fēng)燥兩證論治［6］。西醫(yī)認(rèn)為銀屑病是多基因遺傳背景下的T細(xì)胞失常的免疫性疾病,以表皮角化不全、角化過度,真皮毛細(xì)血管擴(kuò)張、炎細(xì)胞浸潤(rùn)為病理特征［2］。其發(fā)病與免疫異常的關(guān)系表現(xiàn)在免疫細(xì)胞活化、細(xì)胞因子釋放、免疫表型及免疫球蛋白異常表達(dá)等方面。銀屑病發(fā)病的細(xì)胞免疫過程包括下列3方面:(1)抗原誘導(dǎo)DC成熟,繼而釋放在銀屑病發(fā)病中起主導(dǎo)作用的細(xì)胞因子,如白介素-23(IL-23)［7］、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ干擾素(IFN-γ)等。(2)T細(xì)胞活化、分化與增殖;(3)活化T細(xì)胞遷移到皮膚,產(chǎn)生炎癥因子并發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)［8］。目前公認(rèn)Th細(xì)胞的失衡與銀屑病的發(fā)病密切相關(guān)。Th細(xì)胞分為Th0、Th1、Th2、Th17、T調(diào)節(jié)細(xì)胞等亞型。Th1細(xì)胞是Th0細(xì)胞在IL-12等細(xì)胞因子作用下分化而成,Th1細(xì)胞為CD4+細(xì)胞,主要分泌白細(xì)胞介素-2(IL-2)、IFN-γ、腫瘤壞死因子-β(TNF-β)等,T-bet為其關(guān)鍵的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子。其功能為參與調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫,輔助細(xì)胞毒性T細(xì)胞分化,介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答,參與遲發(fā)型超敏反應(yīng)等。Th2細(xì)胞是Th0細(xì)胞在IL-4等細(xì)胞因子作用下分化而成,主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-13等細(xì)胞因子,GATA-3為其關(guān)鍵的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子,主要功能為輔助B細(xì)胞增殖、分化,介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答,參與Ⅰ型超敏反應(yīng)等。Th細(xì)胞與銀屑病的相關(guān)性研究在西醫(yī)領(lǐng)域普遍開展,但其與銀屑病中醫(yī)證候的研究目前尚未見報(bào)道。本課題就最常見的Th1/Th2細(xì)胞與血熱、血瘀證銀屑病發(fā)病的相關(guān)性作一探討。西醫(yī)領(lǐng)域方面吳苗等［9］研究了尋常型銀屑病外周血單一核細(xì)胞中T-bet和GATA-3的基因表達(dá),結(jié)果表明尋常型銀屑病患者血清中IFN-γ的水平明顯高于健康對(duì)照組,IL-4的水平明顯低于健康對(duì)照組;患者PB-MCs中轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組,GATA3的表達(dá)明顯低于健康對(duì)照組,上述結(jié)果提示Th1特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet可能通過調(diào)節(jié)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的產(chǎn)生介導(dǎo)尋常型銀屑病的發(fā)生和發(fā)展。本研究將銀屑病Th免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制與白疕中醫(yī)證候的相關(guān)性進(jìn)行探討,觀察血熱、血瘀證銀屑病患者與健康對(duì)照組外周血Th1/Th2細(xì)胞表達(dá)的差異,研究血熱、血瘀證銀屑病的發(fā)病與外周血Th1/Th2細(xì)胞軸漂移的相關(guān)性。結(jié)果顯示血熱證組銀屑病外周血血清IFN-γ及PBMC中CD4+IFN-γ+的表達(dá)顯著高于血瘀證組及健康對(duì)照組,且與銀屑病皮損的嚴(yán)重程度(PASI評(píng)分)呈正相關(guān),提示血熱證銀屑病的發(fā)病與外周血Th1細(xì)胞密切相關(guān),外周血Th1細(xì)胞在血熱證銀屑病的發(fā)病中占主導(dǎo)地位,當(dāng)血熱證銀屑病向血瘀證轉(zhuǎn)化或正常轉(zhuǎn)歸時(shí),外周血Th1細(xì)胞的表達(dá)下降;雖然血熱證組銀屑病患者外周血清中IL-4