淫羊藿苷對去卵巢大鼠骨和下丘腦不同核團ermrna表達的影響

淫羊藿苷對去卵巢大鼠骨和下丘腦不同核團ermrna表達的影響

骨質疏松癥（op）是一種以骨量少和骨微觀結構退化為特征的特征，導致骨脆弱和全身骨的代謝疾病。雌激素缺乏導致骨吸收亢進,是絕經后骨質疏松(postmenopausalosteoporosis,POP)的主要病因,以往多采用雌激素替代療法(estrogenreplacementtherapy,ERT),但是,近年來研究顯示ERT有增加乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌的風險,因此,從植物來源的選擇性雌激素受體調節(jié)劑(selectiveestrogenreceptormodulator,SERM),即植物雌激素逐漸引起學者的興趣。前期研究表明,由淫羊藿組成的補腎復方在抑制骨量丟失,改善骨密度方面有明顯療效;體外實驗也證實淫羊藿總黃酮可以促進成骨細胞增殖與分化、抑制破骨細胞的分化和吸收功能。眾多學者對于淫羊藿抗骨質疏松作用的研究以總黃酮及總提物為主,2010年《中國藥典》指定淫羊藿苷(Icariin,ICA)為淫羊藿(Epimediifolium)的質量鑒定指標,目前ICA對骨和下丘腦ERβmRNA表達量的影響國內外研究較少。深入研究ICA對去卵巢所致的骨質疏松大鼠骨和下丘腦不同核團ERβmRNA的調節(jié),對于研究淫羊藿抗骨質疏松作用機制具有非常重要意義。1材料和方法1.1材料表面1.1.1實驗動物健康10～11月齡SD♀大鼠60只,體質量(400±50)g,由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。1.1.2乙醇-水梯度洗脫小檗科植物淫羊藿(EpimediumbrevicornuMaxim)干燥地上部分45kg,用10倍量水回流提取2次,每次2h,經大孔吸附樹脂柱色譜分離,體積分數(shù)為0%、30%、50%、95%乙醇-水梯度洗脫。取50%乙醇洗脫部分浸膏1.2kg,用硅膠柱色譜分離,氯仿-甲醇梯度洗脫,得到16個流份。第10個流份析出沉淀13.5g,經SephadexLH-20柱色譜純化、HPLC制備后得一單體化合物(純度>99%),通過NMR、IR等波譜學方法鑒定產物為淫羊藿苷(C33H40O15),其結構見Fig1。1.1.3pcr檢測產物儀器:OLYMPUS顯微鏡(日本),PCR擴增儀(GeneAmpPCRSystem2400,美國),美國MIS-2000SP型3Y顯微圖像分析儀,3Y分析軟件(Pro,Ver,4.0)。試劑:17β-雌二醇(17β-E2,Sigma),RT反轉錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、dNTP和TRIzol總RNA提取試劑盒均為MBI公司產品。瓊脂糖為上海博亞生物工程公司產品,ERβmRNA原位雜交試劑盒(購自武漢博士德生物工程有限公司)。PCR引物由上海博亞生物工程公司合成,ERβ引物序列:上游5′-TCACCGTCGAGCCTTAGTTC-3′,下游5′-TCTGCATAGAGGAGCGATGA-3′,擴增片段長度為286bp。內參GAPDH引物序列:上游5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,下游5′-TCCACCACCCTGCTGTA-3′,擴增片段長度為450bp。1.2方法1.2.1組織病理學檢測大鼠按清潔級標準,適應性喂養(yǎng)1周后,用本實驗室建立的背馱式切除雙側卵巢方法造成骨質疏松動物模型:腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40mg·kg-1BW)麻醉后,切除雙側卵巢,余12只做相同的手術操作,背部切口,找到卵巢后,只切除少量脂肪組織后縫合,但不切除卵巢,作為假手術組(Sham)。將切除卵巢的大鼠隨機分為4組:去卵巢模型組,淫羊藿苷治療小、中、大劑量組:分別給予25、50、100mg·kg-1ICA混懸液。模型組和Sham組:灌胃給予等體積蒸餾水,每周測體重1次,每組12只,切除雙側卵巢術后1周,開始給藥,持續(xù)給藥4個月,頸動脈取血處死動物,分離血清,取椎骨、脛骨、下丘腦、子宮(稱濕重)等標本檢測。1.2.2樣品的收集和檢測1.2.2.1.血清激素測試采用放射免疫法(RIA法)檢測雌二醇(E2),放免分析試劑盒由中國醫(yī)學科學院核醫(yī)學技術中心提供,操作步驟按說明書進行。1.2.2.骨密度的測定取椎骨(L3),剔除肌肉及筋膜,生理鹽水沖洗,用美國Lunar公司雙能X線骨密度儀及其所附的“TheSmallSubjectScan”小動物測定軟件測量。1.2.2.灌流液及多聚甲醛磷酸鹽緩沖液注意事項用10%水合氯醛麻醉動物(3ml·kg-1BW),腹面朝上,四肢固定在木板上,剪開胸腔,將右心房及左心室尖剪開,用乳膠管從左心室尖插入心室并從左房室孔進入主動脈,將0.9%生理鹽水從乳膠管滴入體循環(huán),血液從右心房流出5～10min后,右心房流出的液體基本無色(0.1L0.9%生理鹽水)時,將灌流液換為4.0%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(PBS)固定液,這時動物會抽搐(表明灌注效果良好),繼續(xù)灌注20～30min,取出下丘腦不同核團組織于預先備好的EP管中,封口,立即放入液氮罐中,后放入超低溫冰箱保存。1.2.2.dntps-pcr反應①組織總RNA提取:用變性液將脛骨骨骺均質化后,用TRIzol試劑一步法提取下丘腦不同核團組織和脛骨總RNA。②反轉錄(reversetranscription,RT):總反應體積為40μl,提取的RNA2μg,引物(OligodT)2μl,充分混勻,70℃5min;再加入5×反應緩沖液8L,4μldNTPs,RNase抑制劑0.5μl,DEPC水定容至39μl,充分混勻,37℃5min;再加入MMLV反轉錄酶1μl,充分混勻,42℃孵化60min;70℃加熱10min停止反應。③PCR擴增:PCR總反應體積為20μl,其中包括:10×PCRbuffer2μl,MgCl22μl,dNTP0.2μl,ERβ上游引物和下游引物各1μl,ddH2O11.6μl;RT反應物2μl;TaqDNA多聚酶0.2μl,離心1min,進入PCR循環(huán)。擴增條件:95℃3min;32個循環(huán)(94℃1min,59.4℃1min,72℃1min);72℃7min。④電泳:1.5%瓊脂糖凝膠,電壓100V。⑤檢測:應用Smartview生物電泳圖像分析系統(tǒng)進行吸光度掃描,分析ERβ和內參GAPDHmRNA表達,二者吸光度比值作為所測樣品中ERβmRNA相對表達量。1.3統(tǒng)計分析數(shù)據用xˉ±sxˉ±s表示,應用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計學處理,組間比較采用方差分析。2各組大鼠血清中ermrna表達比較與假手術(Sham)組相比,模型組大鼠BMD、E2、子宮濕重和子宮/體重比值明顯下降(P<0.01)。與模型組相比,淫羊藿苷50.0和與100.0mg·kg-1組大鼠BMD、E2明顯升高(P<0.01),子宮濕重和子宮/體重比值差異無顯著性(P>0.05)。見Tab1。與假手術組相比,模型組大鼠脛骨和下丘腦弓狀核ERβmRNA表達明顯降低(P<0.01),下丘腦室旁核、視上核ERβmRNA表達均明顯升高(P<0.01)。與模型組相比,淫羊藿苷50.0和100.0mg·kg-1組治療后,脛骨和下丘腦弓狀核ERβmRNA表達明顯升高(P<0.01),下丘腦室旁核、視上核ERβmRNA表達均明顯降低(P<0.01),子宮濕重無改變(P>0.05)。見Tab2。3藥代動力學—討論絕經后婦女體內雌激素水平下降,骨量丟失增加,導致絕經后骨質疏松(postmenopausalosteoporosis,POP)已成為老齡化社會問題,卵巢切除SD大鼠是一個成熟的絕經后骨質疏松動物模型。本實驗大鼠卵巢切除后,血清雌激素水平明顯降低,說明卵巢切除完全;椎骨骨密度明顯降低,表明模型成功。淫羊藿苷使卵巢切除大鼠骨量丟失減少,可以提高去卵巢大鼠的椎骨骨密度,對子宮沒有不良反應。一般認為,卵巢功能衰退是引起POP的始動因素,但隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)生殖衰老過程有多個啟動點,下丘腦等上位腺體功能改變先于卵巢功能的衰退,中樞神經系統(tǒng)(centralnervoussystem,CNS)改變是造成POP的重要因素,CNS中存在雌激素受體(estrogenreceptor,ER),CNS是雌激素(estrogen,E)的靶器官,下丘腦是ER重要靶器官,ER在下丘腦主要分布于視上核、室旁核、視前區(qū)和腹內側核等核團。ER與雌激素結合后,直接與DNA上的ER反應元件結合,調節(jié)雌激素應答轉錄因子的活動,ERs存在兩種亞型:ERα和ERβ,二者區(qū)別在于其C末端配體結合區(qū)和N末端活性轉化區(qū)不同,從而在靶組織中分布也不同。下丘腦室旁核(paraventricularnucleus,PVN)緊貼第三腦室,呈長條形,背側達下丘腦溝,頭腹端在視交叉上方,PVN是一個重要的神經內分泌核團,ERs在PVN的表達具有動物種屬差異性:在大鼠PVN,ERβ是唯一的雌激素受體,介導雌激素對大鼠PVN神經結構與神經內分泌活動的調節(jié);在小鼠PVN內還有ERα表達,但相對于ERβ來說,ERα的表達很低。類固醇激素可下調小鼠PVN內ERβ的表達。“腎主骨”的理論是“腎-骨-髓-血-腦”一體,腎為先天之本,主藏精,精生髓,髓居于骨中,骨賴髓以充養(yǎng),脊髓上通于腦,腦為髓之海。腎藏五臟六腑之精,灌輸、濡養(yǎng)、滋潤靶器官-骨、腦。女子七七(49歲)腎氣衰,骨髓生化乏源,髓海不足,骨骼失養(yǎng),易發(fā)骨質疏松癥,治療骨質疏松癥,多用補腎法。淫羊藿辛、甘,溫,歸肝、腎經,《本草備要》記載“補命門,益精氣,強筋骨”,用于腎陽虛衰,筋骨痿軟,陽痿遺精,風濕痹痛,麻木拘攣。淫羊藿對POP動物模型有對抗作用,其所含植物雌激素淫羊藿苷是主要有效部位,體外實驗證實植物源性雌激素與ERβ的親和力較高,而動物源性雌激素與ERα有較高親和力。以往有關植物源性雌激素對下丘腦不同核團ER調節(jié)作用的報道很少,本實驗結果顯示,大鼠卵巢切除后,脛骨和下丘腦弓狀核ERβmRNA表達明顯降低,下丘腦室旁核、視上核ERβmRNA表達均明顯升高。與去卵巢模型組比較,淫羊藿苷50.0和100.0mg·kg-1組治療后,脛骨和下丘腦弓狀核ERβmRNA表達明顯升高,下丘腦室旁核、視