微注射瘦素對(duì)大鼠血壓的調(diào)節(jié)作用

微注射瘦素對(duì)大鼠血壓的調(diào)節(jié)作用

近年來(lái)，肥胖的發(fā)病率在世界上迅速增加，相關(guān)心血管疾病的發(fā)病率和死亡率也逐年增加，已成為人類(lèi)健康的大問(wèn)題。眾所周知,肥胖是高血壓的主要危險(xiǎn)因素之一,然而肥胖與高血壓的確切聯(lián)系機(jī)制尚未明了。肥胖基因(ob基因)編碼產(chǎn)物瘦素的發(fā)現(xiàn)為探討肥胖性高血壓的發(fā)病機(jī)制提供了新的途徑,目前國(guó)內(nèi)外的研究多集中在流行病學(xué)及臨床方面的觀察,對(duì)于其發(fā)病機(jī)制,特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)在瘦素血壓(BP)調(diào)節(jié)中的作用如何,尚不清楚。本研究利用腦立體定位技術(shù),通過(guò)核團(tuán)電刺激、核團(tuán)微注射瘦素的方法,觀察具有瘦素受體(LeptinReceptor,LR)分布的下丘腦室旁核(PVN)、腹內(nèi)側(cè)核(VMH)及背內(nèi)側(cè)核(DMH)在瘦素BP調(diào)節(jié)中的作用,為闡明肥胖相關(guān)性高血壓的中樞機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞系統(tǒng)健康、成年、雄性SD大鼠91只,體重260～285g(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。動(dòng)物喂以顆粒型大鼠飼料,自由飲水,動(dòng)物房溫度維持在18～26℃,光暗周期12:12h(7:00-19:00),實(shí)驗(yàn)前在上述條件下喂養(yǎng)3天。1.2注射減素組和鹽水組根據(jù)干預(yù)手段不同,將SD大鼠隨機(jī)分為3組:(1)電刺激組;(2)微注射瘦素組;(3)生理鹽水(對(duì)照組)。每組再分為3個(gè)亞組,分別對(duì)PVN、VMH、DMH3個(gè)核團(tuán)中的某一個(gè)核團(tuán)進(jìn)行操作,即每只大鼠只負(fù)責(zé)1個(gè)核團(tuán)的1種干預(yù),以排除核團(tuán)之間以及干預(yù)手段之間的相互干擾。1.3雙蒸水溶液配制重組鼠瘦素(瘦素,L3772)購(gòu)自CytoLab公司,將瘦素凍干粉用雙蒸水溶解、配制為5.0mg/mL溶液,-20℃凍存?zhèn)溆?使用時(shí)稀釋10倍。采用VDT-1型大鼠腦立體定向儀進(jìn)行定位,POWERLAB/8SP(Adinstrument公司)系統(tǒng)采集、分析心電、BP信號(hào)。1.4動(dòng)脈血壓檢測(cè)2%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔麻醉后,將SD大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上;連接心電監(jiān)護(hù),常規(guī)記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖;氣管插管改善呼吸;分離頸外靜脈并插管,用于補(bǔ)液(1mL/h)及追加麻藥;分離左側(cè)股動(dòng)脈并插管,導(dǎo)管通過(guò)三通活塞與壓力轉(zhuǎn)換器相連持續(xù)監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓;在恥骨聯(lián)合上方沿腹白線切開(kāi)腹壁肌肉層組織,將膀胱移至腹腔外,行膀胱插管,用于收集尿液。完成外周操作后,動(dòng)物取俯臥位,利用門(mén)齒鉤、雙側(cè)耳棒將大鼠頭部固定于腦立體定向儀上,2%鹽酸利多卡因局部浸潤(rùn)麻醉,沿正中矢狀線切開(kāi)頭皮,鈍性分離帽狀腱膜層,暴露顱骨,調(diào)整顱平面至水平位,根據(jù)核團(tuán)坐標(biāo)(PVN:前囟后1.8mm,中線旁開(kāi)0.4mm,腦平面下7.0mm;VMH:前囟后2.4mm,中線旁開(kāi)0.8mm,腦表面下8.5mm;DMH:前囟后3.2mm,中線旁開(kāi)0.7mm,腦表面下8.1mm),確定開(kāi)顱的部位,用微型電鉆鉆一小孔直徑為2mm,撕開(kāi)硬腦膜,在監(jiān)聽(tīng)裝置的控制下,將微電極或微量進(jìn)樣器插入到預(yù)定核團(tuán)內(nèi)。1.5微注射成本wp和小高s動(dòng)物穩(wěn)定15min后,開(kāi)始實(shí)驗(yàn),整個(gè)過(guò)程中持續(xù)記錄心電、BP信號(hào)。完成10min的基線數(shù)據(jù)采集后,電刺激組:接受頻率50Hz,波寬0.3ms,持續(xù)時(shí)間60s的脈沖電刺激。刺激后觀察30min;實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)以2mA,15s的陽(yáng)極直流電損毀核團(tuán),標(biāo)記刺激部位。微注射組:擠壓腹部,使尿液完全排出,膀胱插管下接試管收集尿液。微量進(jìn)樣器緩慢(注射時(shí)間不少于3min)微注射瘦素0.2μL(0.5μg/μL),停針5min后拔出,觀察1h;對(duì)照組給予等量生理鹽水注射。此過(guò)程收集尿液進(jìn)行分析。記錄結(jié)束后行核團(tuán)損毀,方法同上。1.6腦膠質(zhì)瘤觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,所有動(dòng)物麻醉過(guò)量致死,4%多聚甲醛灌注固定腦組織,開(kāi)顱取腦,將腦組織浸泡于固定液后固定24h,入30%蔗糖溶液至完全沉底,冰凍切片機(jī)做連續(xù)冠狀切片,片厚約75μm,載于多聚賴氨酸涂片的載玻片上,自然干燥,進(jìn)行尼氏染色觀察干預(yù)部位。凡損毀灶在核團(tuán)之外者,數(shù)據(jù)棄去。1.7標(biāo)準(zhǔn)液的配制和存儲(chǔ)UNa測(cè)定采用原子吸收分光光度法。儀器條件設(shè)定如下:鈉離子波長(zhǎng):589.0nm;光譜帶寬:0.4nm;燈電流:1mA;燃燒器高度:5mm;空氣壓力:0.3MPa;乙炔壓力:0.09MPa;空氣流量:6.5L/min;乙炔流量:1.1L/min;火焰類(lèi)型:氧化性藍(lán)色焰。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和存儲(chǔ):氯化鈉標(biāo)準(zhǔn)液原液(購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)濃度1000μg/mL。取原液1mL,稀釋100倍,該液體濃度為0.01mg/mL,將0.01mg/mL溶液定為母液。分別取母液2、4、6、8、10mL各自置于100mL容量瓶中定容,即得到濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/L的標(biāo)液。將標(biāo)準(zhǔn)液保存在聚乙烯瓶中。該溶液中氯化鈉的工作曲線的線性范圍可達(dá)到0～1.0mg/L。將尿液稀釋后進(jìn)行測(cè)量。1.8pss11.0統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)用(xˉ±s)(xˉ±s)表示,SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,根據(jù)資料選擇配對(duì)或成組t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01為差異有非常顯著性意義。2組織學(xué)鑒定結(jié)果共使用SD大鼠91只,各種意外死亡10只,完成實(shí)驗(yàn)81只。組織學(xué)鑒定后,63只定位準(zhǔn)確,數(shù)據(jù)納入統(tǒng)計(jì)分析,定位準(zhǔn)確率為77.8%。各組大鼠的基礎(chǔ)條件(主要指體重)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.1刺激前dmh和刺激后30s內(nèi)dmh的下降脈沖電刺激PVN、VMH及DMH后,大鼠BP、HR在短期內(nèi)明顯、急劇升高,于刺激的當(dāng)時(shí)(PVN)或刺激后30s內(nèi)(DMH和VMH)達(dá)到峰值,但持續(xù)時(shí)間短,刺激未結(jié)束或結(jié)束即刻開(kāi)始下降,5～10min內(nèi)恢復(fù)到刺激前水平。分別將各核團(tuán)刺激前的基礎(chǔ)值和刺激后的最大值進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn),差異均有非常顯著性意義(P<0.01)(圖1)。2.2微注射不同途徑控制施拉氏針錨索下bp、hr的變化與對(duì)照組相比,PVN內(nèi)微注射瘦素后,可引起大鼠平均動(dòng)脈壓(MAP)升高(16.3±5.0vs對(duì)照組3.5±0.6)mmHg及HR升高(57.7±15.2vs14.7±6.1)次/min,P<0.01。從趨勢(shì)圖來(lái)看,注射瘦素后5minBP開(kāi)始逐漸上升,注射后25～30min達(dá)到峰值(125.1±7.1)mmHg,持續(xù)15min,于45min開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì),在觀察期內(nèi)未降至干預(yù)前水平。HR表現(xiàn)為平穩(wěn)上升趨勢(shì),注射后45min達(dá)到最大值(466.3±63.5)次/min,此后一直在該水平維持,直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束(圖2)。與對(duì)照組相比,VMH微注射瘦素后,BP、HR均有明顯上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與PVN不同,該核團(tuán)內(nèi)注射即刻BP迅速升高,注射后15～20min達(dá)到峰值(123.1±8.1)mmHg,HR表現(xiàn)為平穩(wěn)上升趨勢(shì),注射后15～20min即BP達(dá)到峰值期間,出現(xiàn)一個(gè)平臺(tái)期,此后又緩慢上升,注射后50min達(dá)到最大值(422.9±13.2)次/min,之后出現(xiàn)下降趨勢(shì),直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束(圖3)。與對(duì)照組相比,DMH微注射瘦素后引起的BP升高及HR加快均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從趨勢(shì)分析,注射后BP逐漸上升,25～30min后達(dá)到峰值(126.8±5.4)mmHg,持續(xù)15min后,開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì),但在觀察期內(nèi)未降至干預(yù)前水平。HR表現(xiàn)為平穩(wěn)上升趨勢(shì),注射后50min達(dá)到最大值(438.1±21.8)次/min,較干預(yù)前增加(51.9±19.2)次/min,此后該水平維持至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(圖4)。2.3dmh和dmhPVN、VMH微注射瘦素引起UNa排泄減少,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而DMH雖然有減少趨勢(shì),但缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;PVN微注射瘦素可以使UV減少,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,VMH、DMH微注射瘦素后有UV減少的趨勢(shì),但是與對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。3肥素及其類(lèi)物質(zhì)激素對(duì)肝腎功能的影響研究主要結(jié)果顯示,PVN、VMH、DMH微注射瘦素后,與對(duì)照組相比,可引起明顯的BP升高和HR加快等BP調(diào)節(jié)效應(yīng),與單純脈沖電刺激引起的即時(shí)效應(yīng)不同,這種作用發(fā)生慢而持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。因此,我們認(rèn)為微注射瘦素后出現(xiàn)的BP改變應(yīng)該歸結(jié)于其對(duì)BP的某種復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制,而不僅僅是注射本身刺激神經(jīng)元所致。我們推測(cè)具有瘦素受體分布的PVN、VMH及DMH有可能是瘦素調(diào)節(jié)心血管活動(dòng)的中樞部位,至少是眾多位點(diǎn)中的一部分。Shek等發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期慢性輸入瘦素可以引起B(yǎng)P升高;中樞途徑輸入小劑量瘦素具有升壓效應(yīng),但同樣劑量從外周靜脈給藥則不引起B(yǎng)P的改變,推測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)很可能是瘦素BP調(diào)節(jié)的途徑之一,然而其確切機(jī)制并不清楚,目前的觀點(diǎn)傾向于瘦素的交感神經(jīng)系統(tǒng)(SNS)激活作用。Haynes等給大鼠靜脈內(nèi)輸入瘦素后觀察了血漿瘦素濃度及交感神經(jīng)活性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)交感神經(jīng)活性確實(shí)明顯增加,和其他研究的結(jié)果一致,但是這種活化作用和血漿瘦素濃度無(wú)明顯的相關(guān)性,引起棕色脂肪組織和腎交感神經(jīng)活性明顯增強(qiáng)的劑量(10和100μg/kg)卻不能引起血漿瘦素濃度的顯著升高。此外,在輸入瘦素的過(guò)程中還觀察到血漿瘦素濃度升高和交感神經(jīng)激活的時(shí)程是分離的,表現(xiàn)為交感神經(jīng)的延遲激活。說(shuō)明血漿瘦素并不是立即濃集于瘦素激活SNS的作用位點(diǎn)。由于瘦素是通過(guò)一種特殊的可飽和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)入腦脊液的,因此,中樞神經(jīng)系統(tǒng)很可能是瘦素激活SNS的作用位點(diǎn)。另外,在本研究中我們發(fā)現(xiàn),隨著時(shí)間的推移,伴隨HR的持續(xù)升高,BP出現(xiàn)了平臺(tái)期甚至開(kāi)始下降,我們推測(cè)可能是瘦素的某種降壓機(jī)制拮抗了這種中樞性升壓效應(yīng)。目前對(duì)瘦素降壓作用的研究主要集中在3方面:1)促進(jìn)NO生成和釋放;2)腎臟的利鈉作用:瘦素可直接作用于腎臟引起UV增加,UNa排泄,但對(duì)腎血流量、腎小球?yàn)V過(guò)率、尿鉀排泄無(wú)明顯影響,這種效應(yīng)可使血容量減少,BP下降;3)瘦素還可以促進(jìn)胰島素的釋放,增加胰島素的敏感性,改善胰島素抵抗。對(duì)于瘦素的上述降壓機(jī)制,目前的研究更多的集中于外周組織,本實(shí)驗(yàn)雖為中樞干預(yù),但結(jié)果仍提示潛在降壓機(jī)制的存在。究竟是某種中樞機(jī)制觸發(fā)了上述的某些效應(yīng)還是瘦素本身存在中樞性降壓作用?國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道,有待進(jìn)一步研究。本研究采用UV和尿電解質(zhì)分析的方法來(lái)研究核團(tuán)微注射瘦素對(duì)腎功能的影響。核團(tuán)微注射瘦素可導(dǎo)致UV及UNa排泄減少趨勢(shì),該現(xiàn)象符合腎交感神經(jīng)活性增強(qiáng)時(shí)腎臟排泄功能的改變,因此我們推測(cè)瘦素對(duì)腎臟的作用可能仍然來(lái)自SNS的激活。盡管