泥同工酶的結(jié)構(gòu)和表達(dá)分析

泥同工酶的結(jié)構(gòu)和表達(dá)分析

1泥基因表達(dá)的選擇性研究它通常被稱為血卟、粒蟲(chóng)、花混合物。這是雅維諾科的一個(gè)分支。分布在內(nèi)灣海灘，有淡水、平坦、水流順暢的沼澤。它生活在洞穴里。它是一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類。由于其豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和優(yōu)美的口感，它深受人們的喜愛(ài)。目前，這項(xiàng)研究主要集中在組織、繁殖技術(shù)和種子栽培上，對(duì)生化遺傳的研究較少。于子牛等人研究了五種組織中的不同異質(zhì)酶，但不同組織的表型沒(méi)有太大的不同。在本研究中，采用聚吡咯電泳法對(duì)五種組織中的19種同工酶進(jìn)行檢測(cè)和分析，以了解不同組織的遺傳特征。為探索貝類研究提供了一些理論參考，并對(duì)其他組織的遺傳特征、物種識(shí)別和生物進(jìn)化進(jìn)行了研究。2材料和方法2.1組織的解剖泥蚶樣本取自浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所.泥蚶殼長(zhǎng)度為2.2～2.7cm,把活體帶回實(shí)驗(yàn)室,取其中的15～20個(gè)個(gè)體立即解剖,取外套膜、閉殼肌、足、鰓、消化腺等5種組織,-70℃低溫冰箱保存.2.2方法2.2.1離心酶提取法將準(zhǔn)確稱取的5種組織,蒸餾水漂洗后,以1∶3的比例(體重與體積之比)加入0.05%巰基乙醇,冰浴下勻漿,4℃冷凍離心機(jī)中12000r/min離心30min(消化腺離心2次或更多次,直至提取的酶液純清)取上清,加入適量溴酚蘭后分裝,樣品放入-70℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆?2.2.2電泳酶類及有關(guān)系統(tǒng)采用不連續(xù)垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳法.分離膠濃度為8.2%(pH8.9),濃縮膠濃度為3.6%(pH6.7),電泳在4℃冰箱中進(jìn)行.TG系統(tǒng)恒壓230V,TC系統(tǒng)恒壓80V,EBT系統(tǒng)恒壓140V,電泳時(shí)間為5～6h.實(shí)驗(yàn)所測(cè)酶類及有關(guān)系統(tǒng)見(jiàn)表1.同工酶的顯色方法均見(jiàn)參考文獻(xiàn)本文略作改動(dòng).染色完畢后用7.5%冰醋酸溶液固定,生物電泳圖像系統(tǒng)進(jìn)行攝影記錄.電泳酶譜分析見(jiàn)參考文獻(xiàn).2.2.3酶譜帶鑒定以各種酶譜的相對(duì)遷移率Rf由小到大依次命名,即向陽(yáng)極運(yùn)動(dòng)的酶譜帶開(kāi)始依次命名為1,2,3,…Rf=l/L,l為陰極端至各譜帶中點(diǎn)的距離,L為陰極端至指示劑終點(diǎn)的距離.3酶類活性鑒定本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)了19種同工酶,如表1所示.其中過(guò)氧化氫酶、甲酸脫氫酶、半乳糖脫氫酶、D-葡萄糖脫氫酶等4種酶未顯示任何有活性的區(qū)帶,磷酸-6-葡萄糖脫氫酶和谷氨酸脫氫酶只顯示很微弱且不穩(wěn)定的區(qū)帶,α-淀粉酶、酸性磷酸酶只在消化腺中存在有明顯的譜帶,而其他種酶類則在各個(gè)組織中都顯示出清晰穩(wěn)定的圖譜(見(jiàn)圖1,2).3.1表面活性劑mdh的抗氧化酶活性MDH是細(xì)胞中三羧酸循環(huán)中重要的脫氫酶之一,三羧酸循環(huán)對(duì)于任何一機(jī)體都起著重要的作用.由圖1可見(jiàn),泥蚶的蘋(píng)果酸脫氫酶分布較廣,在5種組織中均存在較強(qiáng)的活性區(qū)帶,即MDH-1,2,3,4,5,6,但不同組織譜帶相對(duì)活性存在明顯不同,MDH在閉殼肌、足中的染色最深,這與肌肉收縮需要大量能量,在檸檬酸循環(huán)過(guò)程中MDH把蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)為草酰乙酸有關(guān).3.2me的活性分類泥蚶的蘋(píng)果酸酶存在2～4條譜帶,其中ME-1和4在各個(gè)組織中都存在,而ME-2,3只存在于足、閉殼肌組織和消化腺中,泥蚶各組織中的蘋(píng)果酸酶不僅存在譜帶數(shù)的差異,在活性上也存在較明顯的差別,但不管是數(shù)量上還是活性上消化腺中的蘋(píng)果酸酶的表達(dá)都是占優(yōu)勢(shì)的,其次是足組織.魚(yú)類的ME可分為細(xì)胞質(zhì)型(s-ME)和線粒體型(m-ME),其中m-ME由一個(gè)基因位點(diǎn)編碼,為四聚體產(chǎn)物,在電泳圖譜上遷移較慢;s-ME也只有一個(gè)基因位點(diǎn)編碼,本研究揭示泥蚶的ME與魚(yú)類一樣,也有s-ME和m-ME,但在酶譜上與魚(yú)類略有差異.3.3消化腺的代謝活性泥蚶的酯酶表型較復(fù)雜,有13條酶帶明顯分為5個(gè)區(qū)域,各組織有5～12條酶帶,其中EST-1,2,5僅存在于鰓和消化腺中,EST-3只存在于鰓組織,而EST-6只存在于外套膜、鰓和消化腺中,EST-7,8,9也僅在消化腺中表達(dá).從圖1可見(jiàn)消化腺的酯酶最復(fù)雜有12條帶,而且表現(xiàn)出的酶活性也最強(qiáng),這與酯酶的生理功能是一致的.EST是催化酯類化合物水解并進(jìn)入中間代謝的重要酶類,其作用除維持細(xì)胞正常的能量代謝外,還能水解大量非生理正常存在的酯類化合物,被認(rèn)為可能與機(jī)體的解毒作用密切相關(guān).消化腺是泥蚶重要的消化器官,同時(shí)也是機(jī)體最重要的解毒器官,泥蚶中EST-7,8,9酶帶僅存于消化腺中,因而可能與解毒的代謝活動(dòng)有關(guān).3.4sod的分布SOD酶譜較簡(jiǎn)單,各組織均表現(xiàn)出4條酶帶,但在活性上略有差別,其中閉殼肌和消化腺中的SOD較其他組織略強(qiáng).SOD是生物體防御氧化損傷的重要酶類,當(dāng)生物體受到外界病原體侵染后,體內(nèi)自由基濃度將升高,而SOD能清除體內(nèi)過(guò)多的自由基,以免除其對(duì)自身細(xì)胞的毒害.消化腺是較易受到外界病原體侵害或不利因素影響的組織,這恰與消化腺中SOD同工酶活性高于其他組織相適應(yīng).另外一般認(rèn)為SOD有兩個(gè)座位控制,分二聚體的s-SOD(上清液型)和四聚體的m-SOD(線粒體型)兩類,在相同的電泳條件下,s-SOD因是可溶性的,從而在上清液中酶含量較高而易于檢測(cè)出來(lái),且遷移較快;而m-SOD常因難溶于上清液中使上清液中酶含量較低而難檢測(cè)出.結(jié)合以上特征,本研究的SOD所得的譜帶很可能是s-SOD,至于其位點(diǎn)控制情況還有待于進(jìn)一步探討.3.5帶數(shù)量和活性泥蚶的乳酸脫氫酶的活性較弱,表現(xiàn)為兩條酶帶,酶帶數(shù)量上各組織間無(wú)顯著差異,其中LDH-1很微弱,LDH-2則較強(qiáng).在活性上足組織表達(dá)較強(qiáng),這可能與足肌纖維收縮時(shí)需要大量的能量供應(yīng)有關(guān).3.6pod的表達(dá)泥蚶的過(guò)氧化物酶各組織有3～5條帶,明顯的分為4個(gè)區(qū)域.其中POD-3,5僅存在于消化腺中,在酶的表達(dá)活性上消化腺表達(dá)略強(qiáng).植物的POD一般被認(rèn)為是由一個(gè)位點(diǎn)控制的單體或二聚體酶;魚(yú)類POD的亞基組成尚未清楚.從已有的研究結(jié)果來(lái)看,有的魚(yú)類POD被認(rèn)為是二聚體酶,有的則認(rèn)為是單體酶,還有的認(rèn)為是四聚體酶.對(duì)于泥蚶POD的位點(diǎn)控制情況及其亞基組成情況怎樣還有待于進(jìn)一步研究.3.7魚(yú)類idh的活性泥蚶的異檸檬酸脫氫酶有4條區(qū)帶,其中m-IDH-1較容易失活,儲(chǔ)存較長(zhǎng)時(shí)間的樣品不宜檢測(cè)到,有關(guān)IDH同工酶部分酶帶失活的現(xiàn)象在其他生物體中也有過(guò)類似報(bào)道.在IDH譜帶上各組織無(wú)顯著差異,僅活性上略有差別.一般魚(yú)類IDH分為細(xì)胞質(zhì)型(s-IDH)和線粒體型(m-IDH),m-IDH由一個(gè)基因位點(diǎn)編碼,在電泳圖譜上表型為1條帶,遷移慢;s-IDH由兩個(gè)基因位點(diǎn)編碼,表型為3條帶,遷移快.泥蚶的IDH酶譜表型上與之相似,但結(jié)合泥蚶的居群分析資料(將另文發(fā)表)表明,泥蚶的IDH同工酶實(shí)際是受兩個(gè)位點(diǎn)控制的,IDH-2,3,4三條酶帶是一個(gè)位點(diǎn)的雜合形式,這與姜建國(guó)等對(duì)草魚(yú)同工酶的研究結(jié)果相似.3.8泥和魚(yú)類的adh活性差異泥蚶的醇脫氫酶相對(duì)簡(jiǎn)單,只有兩條靠的非常近的區(qū)帶,各組織間沒(méi)有顯著差異,在活性上也只有足組織稍微低一點(diǎn).一般來(lái)講魚(yú)類的ADH是由一個(gè)基因位點(diǎn)編碼的二聚體,由兩個(gè)基因位點(diǎn)編碼的二聚體酶的情形也有報(bào)道.從本研究來(lái)看泥蚶的ADH酶譜與后者相類似.3.9泥消化腺消化腺泥蚶的淀粉酶只在消化腺中有所表達(dá),在其他各組織中均無(wú)表達(dá)活性,呈兩條白色帶,而未見(jiàn)粉紅、紅褐色等有色條帶.淀粉酶的這種分布與泥蚶消化腺所擔(dān)負(fù)的生理功能是相一致的.泥蚶是濾食性貝類,以各種藻類為生,因此消化腺中存在的高強(qiáng)度的淀粉酶也是其消化器官對(duì)食物中存在著的淀粉物質(zhì)的一種適應(yīng).3.10酶帶的檢測(cè)泥蚶的山梨醇脫氫酶比較簡(jiǎn)單,只存在1條酶帶.在5種組織中只有足不顯示任何有活性的區(qū)帶,而在其他組織中都有較強(qiáng)的酶帶.目前對(duì)于山梨醇脫氫酶的生理功能等方面的研究還不多,因此泥蚶的足組織為何無(wú)此酶活性還有待于進(jìn)一步研究.3.11酸性磷酸酶的測(cè)定泥蚶的酸性磷酸酶的表達(dá)與淀粉酶相似,只在消化腺中有明顯的條帶,而在其他組織中均不表達(dá).酸性磷酸酶是一種在酸性條件下水解各種磷酸酯的酶,動(dòng)物的消化腺是主管食物降解消化吸收的地方,因此消化腺中需要大量的酸性磷酸酶的存在,是對(duì)消化腺生理功能的適應(yīng).3.12琥珀酸脫氫酶scd，e.c.1.3.99.1泥蚶的琥珀酸脫氫酶在各組織中表達(dá)較一致,都為1條酶帶,而且遷移率相同,在表達(dá)活性上也沒(méi)有顯著差異.3.13水生動(dòng)物酶alp的酶學(xué)研究泥蚶的堿性磷酸酶相對(duì)較簡(jiǎn)單,只有1條酶帶,各組織之間無(wú)顯著差異,只在活性上略有不同.目前對(duì)于水生生物的ALP研究較少.有資料表明魚(yú)類和貝類的ALP可能是由兩個(gè)基因位點(diǎn)編碼的單聚體和二聚體酶.本研究只發(fā)現(xiàn)了1條酶帶,因此推測(cè)泥蚶的ALP是由一個(gè)基因位點(diǎn)編碼的單聚體或二聚體酶.4泥體內(nèi)的同工酶(1)從以上結(jié)果可以看出,在泥蚶的5種組織中已存在相當(dāng)豐富和完整的酶系統(tǒng),它們不僅以同工酶的形式參與代謝和調(diào)節(jié),而且在表型、分布和活性上均表現(xiàn)出高度的組織特異性.從檢測(cè)到的有穩(wěn)定基因表達(dá)的13種酶的種類來(lái)看,幾乎涵蓋了所有脊椎動(dòng)物體中所存在的常見(jiàn)的同工酶種類,所涉及的代謝途徑也與高等動(dòng)物的相類似.說(shuō)明泥蚶已具備了與高等動(dòng)物相類似的機(jī)體代謝方式.從這些酶的分布來(lái)看,許多酶都表現(xiàn)出了組織分布的“不均勻性”,這種不均勻性不僅與各組織的不同生理分工相一致,如淀粉酶只存在消化腺中.EST在消化腺中表達(dá)最強(qiáng),LDH在足中活性最高等,而且也與機(jī)體對(duì)自身基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控相聯(lián)系.(2)在所檢測(cè)的19種同工酶系統(tǒng)中,過(guò)氧化氫酶、甲酸脫氫酶、半乳糖脫氫酶、D-葡糖脫氫酶等4種酶未見(jiàn)表達(dá),其中過(guò)氧化氫酶是生物體內(nèi)重要的抗氧化防御性功能酶,與機(jī)體的免疫機(jī)能密切相關(guān),因而與SOD一起作為生物體的保護(hù)系統(tǒng)而被廣泛地研究.目前已在許多種動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)到了CAT活性的存在,包括一些重要的魚(yú)類和經(jīng)濟(jì)貝類,但本研究雖然檢測(cè)到了較強(qiáng)活性的SOD同工酶,但未見(jiàn)CAT同工酶的表達(dá),這是否說(shuō)明泥蚶體內(nèi)確實(shí)不存在這種酶系統(tǒng)或該酶的濃度低于檢出值,還是說(shuō)明所選的凝膠系統(tǒng)不合適,或是本身酶系統(tǒng)容易失活而未能檢出還有待于今后的研究,但從以往的研究來(lái)看,在幾種機(jī)體防御性同工酶中,動(dòng)物體缺少其中的一種或兩種同工酶的現(xiàn)象也是很正常的.至于D-葡糖脫氫酶、甲酸脫氫酶及半乳糖脫氫酶的研究目前在水生生物上報(bào)道較少,尤其在貝類上未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道.筆者們對(duì)這3種同工酶作了嘗試,但均未見(jiàn)酶的表達(dá)活性.另外,磷酸-6-葡萄糖脫氫酶和谷氨酸脫氫酶也是參與機(jī)體代謝的非常重要的兩種酶類,這兩種酶在魚(yú)類及其他高等動(dòng)物中普遍存在.其中磷酸-6-葡萄糖脫氫酶是糖代謝中磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶,而該途徑與生物體內(nèi)脂肪酸、固醇類物質(zhì)的合成及核酸代謝均有著密切的關(guān)系.谷氨酸脫氫酶是催化體內(nèi)氨基酸氧化脫氨基作用的酶之一,它的活性與蛋白質(zhì)合成與分解有著直接的關(guān)系,在泥蚶中這兩種酶表達(dá)的都很弱或不穩(wěn)定,這說(shuō)明泥蚶體內(nèi)這兩種同工酶所控制的代謝活動(dòng)的水平都較低.當(dāng)然也不排除另外一種可能,即在采集樣品的時(shí)侯泥蚶所處的生理狀態(tài)正好是這兩種酶所參與的代謝途徑處于水平較低的時(shí)候,當(dāng)然,要作出正確判斷還需結(jié)合不同發(fā)育時(shí)期泥蚶的同工酶表達(dá)資料.另外,ADH也是一種重要的酶類,它的生理作用是適應(yīng)厭氧酵解的需要.該酶的活性較大,在氧氣供應(yīng)不足的情況下,就不會(huì)造成因缺氧三羧酸循環(huán)受到阻礙,導(dǎo)致丙酮酸的過(guò)量積累而使動(dòng)物中毒死亡.在泥蚶中ADH的活性相當(dāng)高且很穩(wěn)定,它和LDH一起使得泥蚶能夠適應(yīng)低氧的泥棲生活.但這與對(duì)馬氏珠母貝、合浦珠母貝、大珠母貝及三角帆蚌的研究結(jié)果不一樣,這些貝類中ADH的活性很弱或根本無(wú)活性,這是否說(shuō)明泥蚶比它們更適應(yīng)水環(huán)境生活還有待于進(jìn)一步研究.(3)在同工酶表型和基因座位上,泥蚶與高等脊椎動(dòng)物有著相似的遺傳性狀,如前所述ADH,IDH等.但泥蚶作為在分類階元上較低等的貝類,其同工酶表型又表現(xiàn)出與之分類地位相一致的特征,LDH是一種適應(yīng)厭氧呼吸的一種酶類被廣泛用于生物的親緣關(guān)系、系統(tǒng)分類、進(jìn)化理論和種群遺傳分析等研究領(lǐng)域.在魚(yú)類、鳥(niǎo)類、哺乳類中LDH均由A,B,C3個(gè)基因編碼,其中A,B兩個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)物在多數(shù)組織中存在,而C位點(diǎn)表達(dá)具有組織特異性.因此在一般組織中就會(huì)形成典型的5條酶帶表型,而泥蚶的LDH則較簡(jiǎn)單,只顯示兩條酶帶,其中1條較強(qiáng),1條較弱,反應(yīng)出其較低等的一面.但同時(shí)LDH的這種表型在貝類中也是少見(jiàn)的,與喻子牛等對(duì)魁蚶及李廣麗等對(duì)馬氏珠母貝和合浦珠母貝的研究結(jié)果不同,也不同于邵健忠等對(duì)三角帆蚌的研究,即LDH只有1條酶帶,由一個(gè)位點(diǎn)LDH-A控制,從而表現(xiàn)出其較特殊的一面.邵健忠等認(rèn)為L(zhǎng)DH只有到了魚(yú)類這個(gè)階段才出現(xiàn)了B基因,在軟體動(dòng)物中還未出現(xiàn),本研究中泥蚶的LDH出現(xiàn)了兩條帶,對(duì)應(yīng)