基于ssr標(biāo)記的超高系梨品種遺傳多樣性分析

基于ssr標(biāo)記的超高系梨品種遺傳多樣性分析

優(yōu)良品種是指以優(yōu)良品種pyuspyrifona“nintka”為材料，人工雜交和芽變?yōu)樘卣鞯囊幌盗袦?zhǔn)分梨品種。這些品種具有風(fēng)味濃、石細(xì)胞少、肉質(zhì)嫩、口感好、果實(shí)大、含糖高、耐儲運(yùn)等諸多優(yōu)點(diǎn),是當(dāng)前生產(chǎn)上重要的栽培品種,同時也是重要的育種材料。隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整,對優(yōu)良梨品種的苗木需求正呈不斷上升的趨勢。進(jìn)行品種鑒定,保證品種的真實(shí)性和純度,維護(hù)生產(chǎn)者與育種者的利益顯得日益重要。傳統(tǒng)上一般采用形態(tài)性狀進(jìn)行品種鑒定,周期長,可靠性較低,且梨為多年生木本植物,生命周期長,品種間在非果期的形態(tài)差異較小,利用傳統(tǒng)的形態(tài)等方法無法鑒別各個品種。對新高系梨品種鑒定和親緣關(guān)系方面研究的缺乏,限制了對它們的正確評價和合理利用。近年來迅速發(fā)展的DNA標(biāo)記技術(shù)為優(yōu)良品種的引進(jìn),品種間快速客觀的鑒定和假偽苗木的早期識別提供了有效的手段。SSR(simplesequencerepeat,簡單序列重復(fù))標(biāo)記,通常又稱為微衛(wèi)星,具有高多態(tài)性、共顯性、標(biāo)記帶型簡單以及覆蓋整個基因組等特點(diǎn)。在梨品種鑒定和親緣關(guān)系等研究領(lǐng)域得到了有效應(yīng)用。利用SSR標(biāo)記,韓宏偉等鑒定了主要梨栽培品種,張東等對29個砂梨品種(主要為紅皮型)做了鑒定,并對其親緣關(guān)系進(jìn)行了分析,曹玉芬等對梨41個栽培品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析。然而,應(yīng)用SSR技術(shù)對新高系梨品種鑒定和親緣關(guān)系的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究利用SSR標(biāo)記技術(shù)對新高系梨進(jìn)行鑒定,并揭示它們間的親緣關(guān)系,為這些資源的合理保存和利用提供理論支持。1材料和方法1.1新鮮落葉松的制備本試驗(yàn)所用材料(表1)采自中南林業(yè)科技大學(xué)株洲校區(qū)校內(nèi)教學(xué)試驗(yàn)基地梨品種園和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所(遼寧興城)梨資源圃。新鮮嫩葉材料用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇清洗表面,用無菌去離子水沖洗干凈,再用潔凈濾紙吸干,剪去大葉脈,-70℃超低溫冰箱保存待用。其中華豐梨Pyruspyrifolia‘Huafeng’原初定名為晚大新高梨,2007年國家林業(yè)局進(jìn)行了品種審定定名;華高梨Pyruspyrifolia‘Huagao’原初定名為早蜜新高梨,2007年經(jīng)國家林業(yè)局品種審定委員會審定定名。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1提取和純度dea1.2.2pcr擴(kuò)增taq聚合酶PCR(polymerasechainreaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增在PE-9600型PCR儀上進(jìn)行。梨SSR擴(kuò)增條件經(jīng)優(yōu)化確定為:20μL反應(yīng)體系體含10ng基因組DNA,10×buffer2.0μL,MgCl21.50mmol·L-1,dNTP0.25mmol·L-1,正反向引物各5.0μmol·L-1,Taq聚合酶為16.67nkat。參照相關(guān)文獻(xiàn)確定擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性2min;94℃1min,退火溫度55℃1min,72℃延伸2min,35個循環(huán)。最后72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物在60.0g·kg-1非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離,用改良銀染法染色。1.2.3引用的sr方法1.2.4ssr-pcr方法將重復(fù)性好且清晰的條帶進(jìn)行記錄(有無條帶分別記為1和0),然后根據(jù)Nei和Li(1979)的方法計(jì)Dice相似系數(shù),建立相似矩陣?yán)镁垲惙治鲕浖﨨TSYSPC22.10(Rohlf,1994)軟件,用UPGMA(unweightedpairgroupmethodusingarithmeticaverages,算術(shù)平均數(shù)的非加權(quán)成組配對法)生成系統(tǒng)樹。2結(jié)果分析2.1引物擴(kuò)增的穩(wěn)定性基于12對SSR引物的擴(kuò)增,最后篩選出3對擴(kuò)增圖譜清晰的引物KA4b,NH013a和CH02D11。3對引物對9份材料共擴(kuò)增出22條帶,其中22條具有多態(tài)性,平均多態(tài)性百分率為100%(表3);每對引物擴(kuò)增的條帶數(shù)從4條到9條不等,平均為7.3條。說明所用微衛(wèi)星標(biāo)記在新高梨遺傳資源中具有較高的多態(tài)性,適合對其遺傳多樣性結(jié)構(gòu)和水平進(jìn)行檢測。圖1和圖2分別是引物KA4b和NH013a對9份梨材料的擴(kuò)增結(jié)果。2.2引發(fā)問題的最高系梨品種及分子身份證的篩選根據(jù)Dice相似系數(shù),采用UPGMA法進(jìn)行聚類,得到新高系梨品種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系樹(圖3)。9個新高梨品種的相似系數(shù)為0.47~0.91。9個新高梨品種均能區(qū)分開,在相似系數(shù)為0.701處可以分為3個類群,從圖3中可以看出,在所有的供試材料中,第Ⅰ類群為‘天皇’;第Ⅱ類群為‘鮮黃’;第3類群包括‘新高’‘黃金’‘大果水晶’‘華豐’‘早生黃金’‘華高’和‘金秋’;在第Ⅲ類群中,以0.822水平值又分為2個亞群,第Ⅰ亞群包括‘新高’‘黃金’‘大果水晶’和‘華豐’,其中‘新高’和‘黃金’,‘大果水晶’和‘華豐’的材料來源最相似,相似系數(shù)最大;第Ⅱ亞群包括‘早生黃金’‘華高’和‘金秋’。從結(jié)果看,‘鮮黃’與其他新高梨類型的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn),原因可能是受其父本‘晚三吉’的影響較大;‘天皇’與其他的類型也很難聚為一類。在生產(chǎn)實(shí)踐中,‘天皇’表現(xiàn)為花大果大,果實(shí)比其他8個品種更大,其平均單果質(zhì)量為900g,最大可達(dá)2000g,大約為其他品種的2倍,需要進(jìn)一步的研究分析。本研究用SSR標(biāo)記法能將9個新高系梨品種區(qū)分鑒定出來,對于選用準(zhǔn)確而有效的方法來鑒定新高系梨品種和研究其親緣關(guān)系,具有很重要的意義。上述結(jié)果為準(zhǔn)確保存和合理利用這些新高系梨品種提供了理論依據(jù)。梨基因