代謝組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

代謝組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

21世紀(jì)，對生命的復(fù)雜性和完整性的研究已成為生命科學(xué)的發(fā)展趨勢。中醫(yī)藥理論作為傳統(tǒng)文化的瑰寶,是立足于人的整體,以司外揣內(nèi)、整體辨證的思維方式,從整體、功能、動態(tài)的角度認(rèn)識疾病而形成的復(fù)雜理論體系,其應(yīng)用價值已被中醫(yī)學(xué)的臨床實踐充分證明。近年隨著系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展,中醫(yī)藥復(fù)雜理論體系的科學(xué)價值和豐富內(nèi)涵亦不斷被人們認(rèn)識和揭示。但是,目前仍缺乏合適的現(xiàn)代科學(xué)表達(dá)體系來全面深入闡釋中醫(yī)藥這一復(fù)雜的理論體系。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后新近發(fā)展起來的一門學(xué)科,是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。作為后基因時代一種全新的組學(xué)技術(shù),代謝組學(xué)強(qiáng)調(diào)把人體作為一個完整的系統(tǒng)來研究,通過測定人體各種體液內(nèi)代謝物的組成變化來認(rèn)識和反映人體代謝網(wǎng)絡(luò)在疾病和藥物作用下的變化規(guī)律。在方法學(xué)上具有融整體、動態(tài)、綜合、分析于一體的特點,對于揭示復(fù)雜性疾病的機(jī)制和藥物的代謝模式具有獨特的優(yōu)勢。應(yīng)用代謝組學(xué)來認(rèn)識疾病過程,與中醫(yī)的整體觀、系統(tǒng)觀和辨證論治思維方式不謀而合,從而給中醫(yī)藥復(fù)雜理論體系的研究提供了新的思路和研究平臺。代謝組學(xué)的基本原理代謝組學(xué)是研究生物體系受外部刺激所產(chǎn)生的所有代謝產(chǎn)物變化的科學(xué),所關(guān)注的是代謝循環(huán)中分子量1000以下的小分子代謝物的變化,包括糖、脂質(zhì)、氨基酸、維生素等,反映的是外界刺激或是遺傳修飾下細(xì)胞或組織的代謝應(yīng)答變化。其概念最早來源于代謝輪廓分析,經(jīng)過不斷發(fā)展,Fiehn,Allen,Nielsen和Oiver,Villas-Boas等確定了代謝組學(xué)的4個層次:第1個層次為代謝物靶標(biāo)分析(metabolitetargetanalysis),目標(biāo)是定量分析一個靶蛋白的底物和/或產(chǎn)物;第2個層次為代謝輪廓分析(metabolicprofilinganalysis),采用針對性的分析技術(shù),對特定代謝過程中的結(jié)構(gòu)或性質(zhì)相關(guān)的預(yù)設(shè)代謝物系列進(jìn)行定量測定;第3個層次為代謝指紋分析(metabolicfingerprintinganalysis),不分離鑒定具體單一組成,定性并半定量分析細(xì)胞外、細(xì)胞內(nèi)全部代謝物(如表型的快速鑒定);第4個層次為代謝組學(xué)(metabonomics),定性和定量分析一個生物系統(tǒng)全部代謝物。完整的代謝組學(xué)分析的流程包括樣品的制備、數(shù)據(jù)的采集和數(shù)據(jù)的分析及解釋。其樣品主要是尿液、血漿或血清、唾液,以及細(xì)胞和組織的提取液。樣品的制備包括樣品的提取、預(yù)處理和化合物的分離。樣品通常用水或有機(jī)溶劑甲醇、乙腈等提取。分析之前,樣品常先用固相微萃取、固相萃取或親和色譜等預(yù)處理。核磁共振(NMR)、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等是最常用的分析方法。隨著電噴霧等軟電離技術(shù)的出現(xiàn),質(zhì)譜聯(lián)用亦越來越多地應(yīng)用于代謝組學(xué)的研究中,如氣-質(zhì)聯(lián)用(GC-MS,GC-QTOF-MS-MS)、液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS,UPLC-MS,UPLC-MS-MS)、電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)和等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)等聯(lián)用技術(shù)。但無論采用哪種分析技術(shù),代謝組學(xué)都要處理海量的原始數(shù)據(jù)信息,通過統(tǒng)計學(xué)處理,充分抽提數(shù)據(jù)中的潛在信息,解讀數(shù)據(jù)中蘊藏的生物學(xué)意義,這是代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵內(nèi)容。目前用于代謝組學(xué)研究中的數(shù)據(jù)處理方法主要有主成分分析(principalcomponentsanalysis,PCA)、非線形映射(nonlinearmapping,NLM)、簇類分析(hierarchicalclusteranalysis,HCA)等非監(jiān)督(un-supervised)方法和SIMCA(softindependentmodelingofclassanalogy)、PLS-DA(PLSdiscriminantanalysis)、ANN(artificialneuralnetwork)等有監(jiān)督(supervised)方法。代謝組學(xué)與中醫(yī)藏象學(xué)中醫(yī)藏象學(xué)是研究內(nèi)在的生命本質(zhì)與外在現(xiàn)象的關(guān)系,揭示臟腑與形體諸竅、自然環(huán)境關(guān)系的學(xué)說?！安亍笔遣赜隗w內(nèi)的臟腑,外不可見;“象”是形見于外的生理病理現(xiàn)象,是可見的表現(xiàn),可預(yù)測的征兆。不同臟腑表現(xiàn)出來的生理現(xiàn)象是機(jī)體在不同環(huán)境下的代謝結(jié)果的集中體現(xiàn)。換言之,藏象就是通過外在可見形象研究內(nèi)在不可見事物的方法。而代謝組學(xué)正是通過對體內(nèi)代謝產(chǎn)物和代謝網(wǎng)路的變化,推斷機(jī)體受到各種外界因素影響后的最終結(jié)果。如Brindle等僅用幾滴血液對36例嚴(yán)重心血管疾病患者和30例心血管動脈硬化患者進(jìn)行了代謝組學(xué)分析,結(jié)合各種生物信息學(xué)技術(shù)實現(xiàn)了對心血管疾病及其嚴(yán)重程度的判別,得到了高于90%的靈敏度及專一性。因此,藏象通過外在可見形象研究內(nèi)在不可見事物的思維方法,與代謝組學(xué)由內(nèi)源性代謝產(chǎn)物反映人體在疾病和藥物作用下變化規(guī)律的研究思路有著相似之處。將代謝組學(xué)的研究方法應(yīng)用于中醫(yī)藏象理論,有助于詮釋中醫(yī)藥理論科學(xué)內(nèi)涵,促進(jìn)中醫(yī)藥理論揭示人體生命活動的變化規(guī)律。目前已有利用代謝組學(xué)研究“脾在液為涎”等中醫(yī)藏象學(xué)說的相關(guān)課題正在開展。本課題組利用代謝組學(xué)技術(shù),正在展開“肺與大腸相表里”理論的研究。筆者應(yīng)用炎癥性腸病(大腸濕熱)大鼠模型,通過NMR、LC-MS/MS代謝組學(xué)技術(shù),分析模型組與正常組大鼠尿中小分子代謝物,并通過PCA多變量統(tǒng)計分析,觀察到大腸濕熱動物模型尿液中醋酸、肌酸、半胱氨酸、乳酸、?；撬?、二甲胺、丁酸、乙酸、甲胺、三甲胺水平以及氨基酸含量,與正常動物相比存在明顯差異,從而初步揭示了肺與大腸相聯(lián)系的生物學(xué)基礎(chǔ)。同時,筆者將基于LC-MS方法的代謝組學(xué)技術(shù)平臺應(yīng)用于對慢性阻塞性肺病(痰熱阻肺)動物模型的研究中,發(fā)現(xiàn)正常組和模型組之間肺、大腸中的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物也有明顯改變,兩組能進(jìn)行有效區(qū)分。因此,通過代謝組學(xué)技術(shù),從生理、病理狀態(tài)下內(nèi)源性物質(zhì)的比較上,部分揭示了中醫(yī)“肺”與“大腸”作為綜合系統(tǒng)病理相關(guān)性的物質(zhì)基礎(chǔ)。代謝組學(xué)研究中醫(yī)認(rèn)為,證是對機(jī)體在疾病發(fā)展過程中的某階段病因、病理、病機(jī)、病位的概括。它是中醫(yī)對疾病某一階段的特定病理生理過程的認(rèn)識,是在機(jī)體內(nèi)因和環(huán)境外因綜合作用下機(jī)體的整體狀態(tài),并隨著病程的發(fā)展而發(fā)生相應(yīng)變化。中醫(yī)證是一個多因素參與的、多層次的、具有整體性的復(fù)雜系統(tǒng),面對的是復(fù)雜生命現(xiàn)象的功能層面、整體層面、動態(tài)層面,具有典型的開放性、層次性、涌現(xiàn)性和高維性特征。從系統(tǒng)生物學(xué)的角度認(rèn)識中醫(yī)的證可能是包括基因、蛋白在內(nèi)的人體生化調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)變化后所處的一種特異性的、在一定時間內(nèi)相對穩(wěn)定的生理狀態(tài),即一種特征性生理表型。該特征性表型很可能通過其分泌到血液或尿液中的內(nèi)源性成分(蛋白和小分子代謝物)的表達(dá)譜的改變而客觀地反映出來。因此,用現(xiàn)代分析技術(shù)捕捉到這些細(xì)微的變化,獲得偏離出正常范圍的特征性代謝表達(dá)圖譜,可能正是中醫(yī)證的物質(zhì)基礎(chǔ)以多維多息圖譜的形式在代謝物水平上的反映。目前國內(nèi)學(xué)者已通過代謝組學(xué)技術(shù)研究了部分中醫(yī)證候的代謝表達(dá)譜變化。如陸益紅等開展了基于GC/MS、GC-TOF/MS高血壓辨證分型的代謝組學(xué)研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其代謝譜能有效區(qū)分痰濕壅盛、肝陽上亢及陰虛陽亢3種證型。朱萱萱等開展了基于GC-TOF/MS冠心病辨證分型的血清代謝組學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)代謝譜能有效區(qū)分疾病組和健康對照組,且男性患者中氣虛血瘀型和痰阻心脈型可明顯區(qū)分;女性患者中氣虛血瘀型、痰阻心脈型和氣陰兩虛型可明顯區(qū)分。王廣基等運用代謝組學(xué)方法研究不同中醫(yī)證型冠心病間的血漿代謝物變化規(guī)律,發(fā)現(xiàn)痰阻心脈和氣陰兩虛2種證型間多個內(nèi)源性代謝物的含量存在明顯差異,并可能與能量代謝、氨基酸代謝和核苷酸代謝異常相關(guān)。從而證明了代謝組學(xué)研究手段在揭示中醫(yī)臨床證本質(zhì)研究中的可行性。羅和古等利用1HNMR技術(shù),初步發(fā)現(xiàn)肝郁脾虛證模型大鼠的生物標(biāo)志物為醋酸酯、乳酸、酪氨酸、LDL。徐舒等運用1HNMR技術(shù)發(fā)現(xiàn)“肝郁證”大鼠模型,與對照組相比,血漿中葡萄糖(Glucose)和肌酸(Creatine)的含量明顯偏高,而3-羥基丁酸(3-hydroxybutyricacid)、谷氨酰胺(glutamine)、磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine)、磷酸膽堿(cholinephosphate)和不飽和脂肪酸(unsaturatedfattyacid)的含量明顯偏低,以上差異小分子物質(zhì)構(gòu)成“肝郁證”的代謝標(biāo)志物群,成為肝郁證代謝水平的物質(zhì)基礎(chǔ),有助于闡釋肝郁證的本質(zhì)。劉樹民等以2,4-二硝基苯酚誘導(dǎo)的熱病證候模型為切入點,借助代謝組學(xué)平臺,通過對對照組及模型組大鼠尿液的代謝指紋數(shù)據(jù)及模型組不同時間段尿液的代謝組進(jìn)行分析,結(jié)果表明2,4-二硝基苯酚誘導(dǎo)的動物模型符合中醫(yī)臨床的熱病證候表征。簡維雄等運用GC-MS法對心血瘀阻證大鼠血漿的代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)改變的乳酸(lactate)、丙氨酸(lactamine)、纈氨酸(valine)、琥珀酸(succinicacid)、蘋果酸(malicacid)、硬脂酸(stearicacid)、花生四烯酸(arachidonicacid)、果糖(fructose)等8種代謝物與反映“血瘀”病理的血液流變學(xué)指標(biāo)的改變具有一致性,有可能作為心血瘀阻證代謝性生物標(biāo)志物。由此說明,基于代謝組學(xué)技術(shù)在揭示中醫(yī)證本質(zhì)上有著廣泛的應(yīng)用前景。代謝組學(xué)研究方中藥復(fù)方是中醫(yī)臨床用藥的主要形式,它是以中醫(yī)辨證論治、藏象學(xué)說、陰陽五行學(xué)說為指導(dǎo),按照君臣佐使的組方原則,選用恰當(dāng)?shù)乃幬锒颗湮槎?。中藥?fù)方因藥味多,成分復(fù)雜、成分間協(xié)同作用及炮制、煎煮過程中發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)等因素的影響,使得復(fù)方藥效和作用機(jī)制具有復(fù)雜的非線性特征,表現(xiàn)出多成分、多層次、多靶點、多代謝途徑的特點。它不僅體現(xiàn)了傳統(tǒng)醫(yī)藥對人體復(fù)雜系統(tǒng)的認(rèn)識,其本身也是一個復(fù)雜化學(xué)成分系統(tǒng)。代謝組學(xué)作為研究人體復(fù)雜系統(tǒng)的方法,它所具有的非破壞性、整體性、動態(tài)性、非靶向等特點,使其適合研究中藥復(fù)方引起的內(nèi)源性代謝物的變化,通過檢測獲得體液的“代謝指紋圖譜”和分析引起代謝譜變化的原因,可以整體評價中藥復(fù)方對機(jī)體的生物效應(yīng)藥效和毒理作用,從而闡釋中藥復(fù)方的作用靶點、配伍機(jī)制,發(fā)現(xiàn)效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ),指臨床個體化治療應(yīng)用。因此,中藥復(fù)方在代謝組學(xué)的研究方法下將可能得到充分的展示和“挖掘”。王喜軍通過代謝組學(xué)方法研究健康人群口服六味地黃丸后代謝網(wǎng)絡(luò)的改變,發(fā)現(xiàn)六味地黃丸調(diào)節(jié)有關(guān)的主要代謝途徑包括三羧酸循環(huán)、腸道生物群、唾液酸生物合成,從一個新的角度闡明了六味地黃丸的傳統(tǒng)作用機(jī)制,并從生物體代謝角度首次揭示了六味地黃丸的某些潛在作用機(jī)制。蔣寧等基于NMR的血清代謝組學(xué)研究技術(shù),發(fā)現(xiàn)六味地黃丸及八味地黃丸能對有速老齡化小鼠模型(SAMP8)有干預(yù)調(diào)節(jié)作用,對葡萄糖、膽堿和脂類等生物標(biāo)記物群有改善作用,提示二者可改善SAMP8小鼠的能量代謝障礙及學(xué)習(xí)記憶能力。BaogangXi等通過代謝組學(xué)方法,觀察正常的大鼠和灌胃給予六味地黃丸的角叉菜膠所致炎性模型大鼠的尿液代謝譜的變化,結(jié)果顯示六味地黃丸可以修復(fù)被炎癥破壞的代謝網(wǎng)絡(luò),而具有明顯的抗炎作用。賈偉課題組針對左金丸的抗癌作用及人參皂苷對應(yīng)激模型的干預(yù)作用進(jìn)行了整體藥效作用的代謝組學(xué)評價。這些研究工作表明,代謝組學(xué)作為一種系統(tǒng)性的、整體性的研究方法,能夠較全面地揭示中藥及其復(fù)方治療疾病過程中生物體系內(nèi)所發(fā)生的一系列生物化學(xué)變化,將這些變化與傳統(tǒng)手段的測定結(jié)果相聯(lián)系,能夠評價藥效作用和發(fā)現(xiàn)藥物作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。般資料及分析方法體質(zhì)是指人體生命過程中,在先天稟賦和后天獲得的基礎(chǔ)上所形成的綜合的、相對穩(wěn)定的特殊狀態(tài),這種特殊狀態(tài)往往決定著其對某種致病因子的易感性及其所產(chǎn)生病變類型的傾向性。體質(zhì)受“先天”條件以及“后天”因素的影響,環(huán)境因素如飲食狀況、氣候變化以及情緒等心理和社會因素均會影響人體體質(zhì)。通過代謝組學(xué)研究表明,體內(nèi)外各種因素的變化,會對人體的代謝產(chǎn)物產(chǎn)生潛移默化的影響。如Lenz等收集了給予標(biāo)準(zhǔn)飲食的12名健康男性與相隔14d的血漿和尿液進(jìn)行NMR代謝組學(xué)技術(shù)檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿的差異很小,但在尿液中存在很大的個體差異,同時發(fā)現(xiàn)所有受試者代謝譜存在晝夜變化規(guī)律。他們還比較了不同國家之間人群的代謝譜的差異情況,研究結(jié)果表明:內(nèi)源性尿代謝譜受到文化、飲食的嚴(yán)重影響。因此,借助代謝組學(xué)可以為研究個體體質(zhì)狀況提供更全面的科學(xué)依據(jù)。此外,體質(zhì)與人體的心理狀況密切相關(guān),這也是中醫(yī)“形神合一”思想在中醫(yī)體質(zhì)理論中的具體體現(xiàn)。薛黎明等已開展了基于NMR分析對抑郁患者和正常人的尿樣代謝組學(xué)研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),抑郁組和正常組的數(shù)據(jù)能得到有效區(qū)分。中醫(yī)體質(zhì)學(xué)認(rèn)為,體質(zhì)的特征伴隨著生命活動的全過程,該過程具有循著某種體質(zhì)類型固有發(fā)展的演變規(guī)律以及緩慢衍化的趨勢。這就使得體質(zhì)具有可預(yù)測性。因此,根據(jù)人體體質(zhì)狀況,見微知著,及早預(yù)防,“既病防變”這是中醫(yī)“治未病”的內(nèi)容之一。代謝組學(xué)能通過觀察內(nèi)源性代謝物的種類和數(shù)量變化,尋找到相對應(yīng)的生物學(xué)標(biāo)志物簇(biomarkerclusters),結(jié)合從“未病”到“已病”這一病理衍變進(jìn)程進(jìn)行相關(guān)研究,獲得“欲病”時代謝物異常的確切依據(jù),在疾病發(fā)病之前即可采取有效的預(yù)防措施。因此,借助代謝組學(xué)研究個體體質(zhì)狀況為“不治已病治未病”提供了科學(xué)依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn),偏頭痛患者在先兆期和發(fā)病期都會出現(xiàn)5-HT、前列腺素、神經(jīng)肽等一系列內(nèi)源性物質(zhì)的異常。因此,代謝組學(xué)可以通過對這一系列的內(nèi)源性物質(zhì)的監(jiān)控達(dá)到預(yù)防疾病的目的。當(dāng)前代謝組學(xué)研究的局限性從哪里來?在中醫(yī)藥復(fù)雜理論體系中醫(yī)學(xué)是生命科學(xué)的一個重要組成部分,整體觀、動態(tài)觀、辨證觀是中醫(yī)理論的特色。中醫(yī)學(xué)研究的核心問題是要通過中醫(yī)藥理論和現(xiàn)代科技相結(jié)合,研究揭示中藥(擾動體系)與機(jī)體(應(yīng)答體系)兩個復(fù)雜系統(tǒng)之間相互作用的規(guī)律。代謝組學(xué)是把人體作為一個完整的系統(tǒng),研究人體代謝網(wǎng)絡(luò)在疾病和藥物作用下的變化規(guī)律,由于代謝組學(xué)與中醫(yī)基本理論和診療思