一種新型ha-gdl交聯體系制備的海藻酸鈣水凝膠的性能研究

一種新型ha-gdl交聯體系制備的海藻酸鈣水凝膠的性能研究

水凝膠是軟骨組織工程中常用的細胞釋放載體和支撐材料。與普通海綿支架相比，水凝膠聚合物網絡中充滿了大量的水，使整材料具有液體性質，這與體組織的許多組織非常相似。柔軟、濕潤、柔軟的表面和組織的親和力顯著降低了材料對周圍組織的刺激。水凝膠支撐機構在組織工程中用于細胞包裹的理想支撐體必須具備以下特點：（1）良好的生物適應性；（2）良好的傳質性；（3）適宜的生物降解性。海藻酸鈉(SA)是一種由(1,4)-β-D-甘露糖醛酸(M)和(1,4)-α-L-古羅糖醛酸(G)兩種結構單元不規(guī)則連接而成的線型天然高分子.當其與Ca2+接觸時,可通過GG結構單元中的羧基氧、羥基氧和環(huán)間氧與Ca2+配位而瞬時凝膠化形成具有“雞蛋盒”結構的海藻酸鈣水凝膠,成膠條件溫和,并且具有良好的生物相容性,因此在組織修復材料、藥物控釋、細胞免疫隔離等組織工程領域越來越受到人們的關注.通常是可以將海藻酸溶液滴加到CaCl2溶液中得到海藻酸水凝膠,它常以凝膠珠的形式用在藥物控釋和細胞包裹等方面.而這一凝膠體系最大的缺點在于凝膠速率不可控,很難得到機械性能強、結構均一、形狀復雜的三維結構.目前很多研究者采用CaCO3-葡萄糖酸內酯(CaCO3-GDL)體系,通過CaCO3與GDL的反應緩慢釋放Ca2+,可以得到凝膠速率可控的三維海藻酸鈣水凝膠.但CaCO3與GDL反應過程中CO2的生成會導致凝膠中存在氣泡,進而影響凝膠的力學性能及結構.本工作采用具有良好生物相容性的羥基磷灰石(HA)作為鈣源,開發(fā)了一種新型的HA-GDL體系制備海藻酸鈣水凝膠,系統(tǒng)比較了HA-GDL和CaCO3-GDL兩種體系制得的水凝膠在凝膠形貌、力學性能、凝膠化時間以及溶脹收縮等方面的性能,并將海藻酸鈣凝膠與軟骨細胞復合體外構建組織工程化軟骨,初步考察了該體系用于構建組織工程軟骨的潛能.1材料和方法1.1海藻酸鈉溶液的配制在一定濃度的海藻酸鈉(Fluka)溶液中加入一定量的粒徑均為40～50μm的CaCO3(成都科龍)或HA(實驗室自制),攪拌均勻后加入新鮮溶解的GDL(Sigma)溶液,迅速混勻后鑄入模具,室溫下充分放置使凝膠化24h.其中GDL與CaCO3和HA的配比分別為n(GDL):n(HA)=14:1,n(GDL):n(CaCO3)=2:1,使HA和CaCO3完全溶解并維持體系pH值為中性.通過調節(jié)海藻酸鈉溶液的濃度CSA和鈣離子與羧基的摩爾比f,分別制備了CSA=2%、2.5%、3%;f=0.27、0.36、0.54的一系列水凝膠.1.2材料表面形貌與溶脹率采用試管傾斜法測定37℃下樣品的凝膠化時間,每隔30s傾斜盛裝有3mL凝膠樣品的試管,直至樣品停止流動,記錄所需時間.將凝膠化24h的樣品冷凍干燥后,通過掃描電子顯微鏡(SEM,JSM-5900OL,Jeol,Japan)觀察其表面形貌.采用電子萬能材料試驗機(Instron556x)測試了凝膠的壓縮強度和壓縮模量,試樣為φ36mm×15mm的圓柱形,加載速度為2mm/min,每組試樣平行測五次.將凝膠化24h的試樣按0.1g/mL加入MilliQ浸泡,通過測定其質量隨時間變化規(guī)律考察了各組凝膠在水中的溶脹率.溶脹率計算公式如下:其中S為溶脹率,w為材料吸水后的質量,w0為凝膠的初始質量.1.3小鼠軟骨細胞在凝膠內的形態(tài)觀察取新生新西蘭兔(四川大學實驗動物中心提供),處死,無菌條件下提取關節(jié)軟骨細胞,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng),傳代,收集第3代軟骨細胞用于實驗.將細胞懸液按1×106/mL密度分別接種于凝膠前溶液中,溶液固化成凝膠后加入α-MEM培養(yǎng)基,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)7、14、28d.通過FDA/PI染色觀察軟骨細胞在凝膠內的形態(tài)和分布.將樣品以10%甲醛固定24h后,常規(guī)石蠟包埋,超薄切片,HE染色,在光鏡下觀察凝膠內的細胞形態(tài).2結果與討論2.1凝膠化速率的提高如表1所示,隨著CSA和f的增大,兩體系的凝膠化時間均呈降低的趨勢,這是由于海藻酸濃度的增大和鈣含量的提高使得海藻酸分子鏈與鈣離子的鰲合更加容易,縮短了反應時間.與傳統(tǒng)的CaCO3-GDL體系相比,相同凝膠條件下HA-GDL體系具有較快的凝膠化速率,尤其是在海藻酸鈉的濃度和鈣含量較低的情況下差異更加明顯,這可能是由于HA中PO43-基團也會與海藻酸分子鏈中羧基形成氫鍵,加快了凝膠網絡結構的形成.2.2海藻酸纖維的結構從兩種體系凍干凝膠的SEM照片(圖1)中可以看出,海藻酸呈現出交聯程度極強、納米線性交錯的網絡狀結構,與文獻中報道的“蛋盒結構”相吻合,纖維直徑大概在10～30nm之間,線性分子鏈層層纏繞,各結點清晰可見.2.3凝膠的力學性質軟骨組織工程材料的力學性能對于材料的實際應用有著重要的意義,具有良好力學性能的凝膠材料可以保證手術以及組織再生的過程中凝膠保持其原有形狀,支撐細胞的生長.從濕態(tài)凝膠25%形變處的壓縮強度(圖2(a))和壓縮模量(圖2(b))可以看出,隨著CSA和f的增大,兩種體系凝膠的壓縮模量和壓縮強度均有所提高,這是由于海藻酸濃度的增大使得大分子之間的間距減小,海藻酸分子鏈與鈣離子的鰲合更加容易,凝膠網絡填充更加緊密,而鈣含量的增大相當于交聯點增多,同樣使凝膠網絡更加致密.相同條件下,HA-GDL體系制得的凝膠具有更強的力學性能,CSA=2.5%,f=0.36時CaCO3組和HA組凝膠的壓縮模量分別為0.684和1.17MPa,25%形變處的壓縮強度分別為0.0758和0.100MPa.這可能是由于CaCO3溶解過程中CO2的生成導致凝膠中氣泡的存在影響了CaCO3-GDL體系凝膠結構的均一性,同時HA中PO43-與海藻酸分子鏈中RCOOH形成氫鍵,與CaCO3-GDL體系相比,分子間的相互作用更強、凝膠網絡更致密,因而力學強度更好.2.4海藻酸鈉溶脹率對材料吸水能力的影響當生物體內的游離分子擴散到高分子材料內部破壞了原材料內部分子之間的作用力,使得分子間的距離加大,材料發(fā)生溶脹現象.溶脹的結果不僅僅是材料的體積增大,而且會伴隨材料力學性能、顏色以及表面積的變化,最終導致材料綜合性能的變化,因此溶脹率是考察水凝膠材料使用的關鍵因素之一.由圖3可以看出當鈣含量較低(f=0.27)時,由于凝膠內部分子間的作用力較弱,水分子進入凝膠內部較為容易,此時海藻酸鈉的吸水能力成為影響溶脹率的主要因素,由于海藻酸鈉是水溶性高分子,因此溶脹率隨CSA的增加而增大;當鈣含量較高(f=0.36,0.54)時,凝膠分子間的作用較強,網絡結構致密,水分子不易進入內部,此時凝膠結構決定溶脹率的大小,因此海藻酸鈉濃度越高,凝膠結構越致密,溶脹率越低.而相同凝膠條件下,CaCO3-GDL體系中由于氣泡的存在以及稍弱的力學性能使得水分子更容易進入,因而比HA-GDL體系表現出更高的溶脹率.2.5細胞生長情況將軟骨細胞按1×106/mL密度接種于凝膠內部,體外培養(yǎng)7、14、28d的細胞生長情況如圖4所示,可以看出,軟骨細胞在兩種體系凝膠中分布均勻,軟骨細胞形態(tài)均保持良好,隨著培養(yǎng)時間的延長,細胞不斷增殖,逐漸成簇生長,長勢良好,說明兩種凝膠體系均具有良好的細胞相容性.3-3gl體系凝膠采用生物相容性良好的羥基磷灰石替代CaCO3開發(fā)了一種新型的HA-GDL體系制備海藻酸鈣水凝膠.與CaCO