應(yīng)激抑郁大鼠腦內(nèi)ofc及其他腦區(qū)fos表達(dá)的變化

應(yīng)激抑郁大鼠腦內(nèi)ofc及其他腦區(qū)fos表達(dá)的變化

抑郁是一種嚴(yán)重的精神疾病，主要表現(xiàn)為抑郁。隨著現(xiàn)代社會(huì)生活節(jié)奏的加快、工作競爭激烈等各種社會(huì)應(yīng)激因素的加劇,應(yīng)激已成為誘發(fā)抑郁癥的重要因素之一。大腦眶額葉(orbitofrontalcortex,OFC)是與情緒密切相關(guān)的腦區(qū),切除猴子此區(qū)可使其出現(xiàn)明顯的情感變化,特別是會(huì)出現(xiàn)攻擊行為與倒錯(cuò)行為。臨床上,OFC的損傷常涉及動(dòng)機(jī)失衡及無法預(yù)測行為后果,從而導(dǎo)致人類異常的行為反應(yīng),典型的如行為強(qiáng)迫癥、老年抑郁癥。PezzoneMA等利用c-Fos技術(shù)發(fā)現(xiàn),Lewis大鼠厭惡性條件反射中藍(lán)斑核、孤束核、延髓腹外側(cè)、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)背側(cè)等腦干核團(tuán)及下丘腦室旁核、杏仁核、丘腦核團(tuán)、皮層感覺運(yùn)動(dòng)區(qū)等前腦核團(tuán)被激活。OFC參與調(diào)節(jié)情緒行為,在應(yīng)激性抑郁癥發(fā)生過程中,OFC區(qū)如何發(fā)揮作用需要進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)中采用c-Fos免疫組化技術(shù),研究強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)(FST)應(yīng)激后大鼠各個(gè)腦區(qū)尤其是OFC區(qū)域的活動(dòng)變化,進(jìn)一步確定OFC區(qū)域與應(yīng)激性抑郁癥發(fā)生的相關(guān)性,從而為探討抑郁癥發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。1材料和方法1.1大、小鼠腦損傷pahs健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠,購自陜西省中醫(yī)藥研究院,體重250g～280g,每籠4只,光(12h)、暗(12h)循環(huán),室溫22℃～24℃,自由采食飲水。適應(yīng)1周后開始試驗(yàn),隨機(jī)分為正常對(duì)照組,不做任何應(yīng)激處理;應(yīng)激組,強(qiáng)迫游泳應(yīng)激。強(qiáng)迫游泳應(yīng)激30min后,大鼠麻醉灌注取腦。兔抗c-Fos為SantaCruz生物工程有限公司產(chǎn)品,二抗(羊抗兔)、SABC及DAB為武漢博士德生物有限公司產(chǎn)品,戊巴比妥鈉為上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品。滅菌生理鹽水。1.2方法1.2.1大鼠在玻璃缸內(nèi)的生長按照PorsoltRD等強(qiáng)迫游泳方法進(jìn)行。將大鼠單獨(dú)放入直徑20cm,高40cm的圓柱形玻璃缸中,容器中水深30cm,水溫為25℃～26℃,置于安靜的觀察室。大鼠經(jīng)歷兩次游泳應(yīng)激:15min的預(yù)游,取出烘干放回原鼠籠中飼養(yǎng);24h后再進(jìn)行相同的游泳應(yīng)激。每次做完試驗(yàn)后洗凈玻璃缸、清理箱內(nèi)殘留物,盡量除掉上一只大鼠的氣味,以免影響下一只大鼠的行為。1.2.2免疫組化試驗(yàn)大鼠用烏拉坦麻醉,取腦做冰凍切片,切片厚10μm。試驗(yàn)組切片經(jīng)山羊血清封閉,滴加抗體,DAB顯色,蘇木素復(fù)染、藍(lán)化等。對(duì)照組用0.01molPBS代替一抗,其他步驟同上。1.2.3同一腦區(qū)的圖譜觀察和圖譜觀察參照文獻(xiàn),從每只鼠的切片中隨機(jī)各取至少10張,保證不同鼠要觀察的同一腦區(qū)在圖譜上基本位于相同位置。每張切片上同一部位在光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野(目鏡測微網(wǎng)格)統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù),算出每個(gè)網(wǎng)格的平均顆粒數(shù),作為每只鼠的陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)。1.2.4統(tǒng)計(jì)分析方法SPSS11.5生物學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件數(shù)據(jù)處理,所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Xˉˉˉ±SE(Xˉ±SE)表示,組間差異采用單因素方差分析(ONE-WAYANOVA)。2預(yù)游應(yīng)激后鼠不動(dòng)時(shí)間的變化行為學(xué)結(jié)果,FST預(yù)游時(shí)大鼠不動(dòng)時(shí)間平均值為157,FST正式測試時(shí)不動(dòng)時(shí)間均值為183,預(yù)游應(yīng)激后增加了鼠的不動(dòng)時(shí)間。免疫組化結(jié)果,與非應(yīng)激組比較,應(yīng)激組大鼠眶額葉、海馬、下丘腦室旁核、杏仁內(nèi)側(cè)核、梨形皮質(zhì)、扣帶皮層等多個(gè)腦區(qū)均有c-Fos高表達(dá)(P<0.01),表明這些區(qū)域在應(yīng)激條件下被激活,參與了應(yīng)激性抑郁的發(fā)生(表1和圖1)。3應(yīng)激對(duì)大鼠c-fos表達(dá)的影響應(yīng)激(stress)是生物在生存過程中受到各種各樣的刺激后產(chǎn)生的非特異性適應(yīng)性反應(yīng),短暫適度的應(yīng)激能使機(jī)體分泌足量的激素,釋放更多的能量,其免疫功能會(huì)得到部分提升,但如果應(yīng)激強(qiáng)度過強(qiáng)、時(shí)間過長,機(jī)體的免疫功能就會(huì)受到抑制,不利于疾病的防御。前額葉(prefrontalcortex,PFC)尤其是OFC區(qū)是應(yīng)激反應(yīng)的通路之一。OFC的損傷可提高動(dòng)物產(chǎn)生攻擊行為的敏感性,降低它們的欲望,使其社會(huì)性行為消退。OFC異常還會(huì)導(dǎo)致大鼠氣味跟蹤能力的減弱。臨床上,重型抑郁癥患者OFC皮層厚度和神經(jīng)元體積減少。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠先經(jīng)歷15min的預(yù)游,24h后再次將其置于相同的應(yīng)激條件下,大鼠的不動(dòng)時(shí)間相對(duì)增加,表明動(dòng)物在經(jīng)受FST應(yīng)激后,對(duì)心理及生理均產(chǎn)生了一定影響,行為上表現(xiàn)出消極的狀態(tài),因此本試驗(yàn)中采用此方法制造動(dòng)物抑郁模型具有可行性。c-Fos作為即刻早期基因(immediateearlygene,IEG)家族的一員,具有快速表達(dá)、快速降解的特點(diǎn),且無論是心理、生理還是病理的刺激,只要達(dá)到一定的強(qiáng)度,持續(xù)一定的時(shí)間就能夠誘導(dǎo)c-Fos表達(dá)。正常情況下大多數(shù)細(xì)胞均有低水平的c-Fos基因表達(dá),急性應(yīng)激后中樞內(nèi)Fos蛋白迅速表達(dá),應(yīng)激后30min開始升高。由于c-Fos對(duì)外界刺激的反應(yīng)極為敏感,因此在試驗(yàn)中為減少人為干擾,大鼠均處于相同的安靜環(huán)境下,結(jié)果發(fā)現(xiàn)c-Fos免疫陽性細(xì)胞胞核為棕褐色,核仁不著色。由于c-Fos表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)量取決于刺激強(qiáng)度,可能本試驗(yàn)采用的強(qiáng)迫游泳是一種大強(qiáng)度的應(yīng)激,在應(yīng)激后眶皮質(zhì)、下丘腦室旁核、丘腦室旁核、梨形皮質(zhì)、扣帶皮質(zhì)、杏仁內(nèi)側(cè)核、導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、紋狀體、杏仁海馬區(qū)、海馬等腦區(qū)都表現(xiàn)出c-Fos高表達(dá),與非應(yīng)激組有顯著性差異。有研究表明急性束縛應(yīng)激使得前額葉c-FosmRNA升高5倍～6倍,急性熱應(yīng)激后大鼠下丘腦室旁核、丘腦、杏仁核c-Fos表達(dá)增加,腦橋臂旁核c-Fos蛋白表達(dá)增加。足底電擊急性應(yīng)激后c-Fos蛋白在海馬和前腦皮層高表達(dá),并伴隨有小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的改變,心理應(yīng)激可使大鼠c-Fos蛋白表達(dá)異常。束縛-浸水應(yīng)激后丘腦室旁核、腺垂體中的c-Fos陽性細(xì)胞數(shù)也顯著增多。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)眶皮質(zhì)、下丘腦室旁核、丘腦室旁核、梨形皮質(zhì)、扣帶皮質(zhì)、杏仁內(nèi)側(cè)核、導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、紋狀體、杏仁海馬區(qū)、海馬等腦區(qū)在經(jīng)歷應(yīng)激后均被激活,暗示它們是應(yīng)激敏感區(qū)域,參與了應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體自我保護(hù)的調(diào)節(jié),而在所有被激活的腦區(qū)中,OFC區(qū)活動(dòng)變化最有意義,OFC皮質(zhì)