雙耳緣靜脈留置針誘導(dǎo)的靜脈炎模型的建立

雙耳緣靜脈留置針誘導(dǎo)的靜脈炎模型的建立

靜脈炎是指長期服用濃度高、刺激性強(qiáng)的藥物，或靜脈內(nèi)長期放置刺激性強(qiáng)的塑料導(dǎo)管，導(dǎo)致局部靜脈壁出現(xiàn)化學(xué)炎癥反應(yīng)。發(fā)病率為30%70%。這是臨床上靜脈輸液最常見的并發(fā)癥。不少學(xué)者對輸液性靜脈炎的防治機(jī)制進(jìn)行了研究,但對靜脈炎的形成機(jī)制報(bào)道尚少。本研究以連續(xù)5d20%甘露醇靜脈注射造成的靜脈炎為基礎(chǔ),建立靜脈損傷(Ⅲ級靜脈炎)動物模型,旨在探討靜脈損傷及形成機(jī)制,為進(jìn)一步研究防治方法及機(jī)制提供參考。1材料和方法1.1材料表面1.2方法2結(jié)果3理公中的理法表達(dá)變化ICAM-1是黏附分子免疫球蛋白超家族中的一個(gè)成員,主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的黏附。炎性因子TNF-α的釋放可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞間相關(guān)黏附因子ICAM-1的高表達(dá)。本研究表1顯示,正常兔耳組織中ICAM-1有少量表達(dá),模型組比正常對照組ICAM-1表達(dá)量顯著增加。Takeuchi等研究也發(fā)現(xiàn),ICAM-1這類分子可以使炎癥反應(yīng)從受創(chuàng)部位皮膚向未受創(chuàng)部位皮膚蔓延,從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的擴(kuò)散。綜上所述,本研究通過靜脈炎動物模型的建立,初步認(rèn)為靜脈炎發(fā)生的機(jī)制可能與炎性因子TNF-α、ICAM-1表達(dá)水平上調(diào)有關(guān)。但是,靜脈炎的形成是一個(gè)復(fù)雜的病理、生理過程,除TNF-α、ICAM-1指標(biāo)外,今后尚需進(jìn)一步探索和研究其他因素與靜脈炎發(fā)生之間的關(guān)系,為靜脈炎防治提供更多的理論依據(jù)。1.1.1syxk浙選用健康新西蘭大耳兔,由浙江省金華市藥品檢驗(yàn)所提供,許可證號:SYXK(浙)2010-0151,體質(zhì)量2.0~2.5kg,雌雄不限,兔耳無瘢痕、畸形或損傷。新購買動物先在動物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,單籠飼養(yǎng),飲食活動均正常,無其他系統(tǒng)疾病。1.1.2藥物、試劑和儀器20%甘露醇(華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司)、生理鹽水(安徽雙鶴藥業(yè)責(zé)任有限公司)、肝素鈉注射液(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司)、一次性靜脈留置針(美國BD公司)、3M透明敷貼(美國3M公司)、苯巴比妥鈉(上海新亞藥業(yè)有限公司)、TNF-α、ICAM-1多克隆抗體、試劑盒(武漢博士德有限公司)。1.2.1制作靜脈留置針按標(biāo)準(zhǔn)選取10只健康新西蘭同種家兔,隨機(jī)分為正常對照組和模型組。模型組5只參照路顏羽方法進(jìn)行建模,隨機(jī)編號,單籠飼養(yǎng),選用美國BD公司生產(chǎn)的Vialon材料24G靜脈留置針在兔雙耳緣靜脈穿刺置管,由專人統(tǒng)一操作,穿刺成功后,注射甘露醇10mL,15min注完,每日注射1次。注射完畢以25U/mL肝素鈉溶液正壓封管,妥善固定后保留。再次注射藥物時(shí),常規(guī)消毒肝素帽,將4.5號靜脈注射用頭皮針刺入肝素帽內(nèi),留置5d形成條索狀靜脈(Ⅲ級靜脈炎)后拔除留置針。正常對照組5只,不進(jìn)行靜脈留置針穿刺,但同樣進(jìn)行雙耳包扎,共5d。1.2.2靜脈炎的分級和分型按照美國靜脈輸液護(hù)士協(xié)會(INS)制定的標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合動物實(shí)驗(yàn)特點(diǎn),去除評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)疼痛的指標(biāo),將靜脈炎分為5個(gè)等級:0級,無癥狀;Ⅰ級,局部紅腫或水腫,靜脈無條索狀改變,未觸及硬結(jié);Ⅱ級,局部紅腫或水腫,靜脈有條索狀改變,未觸及硬結(jié);Ⅲ級,局部紅腫或水腫,靜脈有條索狀改變,可觸及硬結(jié);Ⅳ級,局部紅腫或水腫,靜脈有條索狀改變,可觸及硬結(jié)。本研究以滿足Ⅲ級靜脈炎標(biāo)準(zhǔn)為造模成功。1.2.3模型2:比例大,長度低模型組3只建模成功,拔除留置針后,正常對照組5只和模型組3只實(shí)驗(yàn)兔均采用苯巴比妥鈉腹腔麻醉后取材。正常對照組:取耳緣靜脈中段兩側(cè)各寬0.5cm、長約3.0cm的矩形標(biāo)本,從矩形兩端分別截取兩段0.5cm標(biāo)本。模型組:以穿刺血管為中線兩側(cè)各寬0.5cm,以穿刺點(diǎn)為標(biāo)記,選取遠(yuǎn)心端0.5cm、近心端2.5cm共長約3.0cm的矩形標(biāo)本,截取穿刺點(diǎn)至近心端0.5cm處、留置針套管末端至遠(yuǎn)心端0.5cm處的兩段標(biāo)本。取材后立即放入10%中性甲醛固定液中固定,送病理科。24h后常規(guī)乙醇脫水,石蠟包埋,每個(gè)標(biāo)本連續(xù)切片,厚度2~5μm,并分別檢測腫瘤壞死因子(TNF-α)、細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)表達(dá)情況及常規(guī)蘇木精-伊紅染色光鏡下觀察病理變化。1.2.4觀察指標(biāo)1.2.4.血管周圍期濾菌ue0d借助光鏡觀察血管壁完整性、炎性細(xì)胞浸潤程度,具體參照趙曉燕等、崔愛榮等、Grüne等對炎癥反應(yīng)的判斷標(biāo)準(zhǔn),分為4個(gè)等級:無炎癥反應(yīng)(-),僅見血管周圍結(jié)締組織充血水腫;輕度炎癥(+),血管周圍結(jié)締組織見淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤,血管壁及血管腔未見炎性細(xì)胞;中度炎癥(ue0d1),血管周圍結(jié)締組織及血管壁各層有淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及少許中性粒細(xì)胞浸潤;重度炎癥(ue0d2),血管周圍結(jié)締組織、血管壁各層及血管腔可見彌漫性淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤,血管腔內(nèi)可見較多的滲出物及壞死的細(xì)胞碎片。1.2.4.tnf-,icam-1檢測采用免疫組織化學(xué)S-P法檢測,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行(TNF-α一抗、ICAM-1一抗均1∶100稀釋),染色玻片于顯微鏡下觀察和照相,TNF-α、ICAM-1均以細(xì)胞核染成棕黃色作為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。每張切片選取5個(gè)高倍視野(×200),每個(gè)視野總細(xì)胞數(shù)不少于500個(gè),計(jì)數(shù)視野中包括炎性細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的陽性細(xì)胞總數(shù),計(jì)算每個(gè)視野中的平均陽性細(xì)胞數(shù),再計(jì)算每組平均每個(gè)高倍視野中的陽性細(xì)胞數(shù)。1.2.5閱讀邀請2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生獨(dú)立對切片進(jìn)行評價(jià),該病理科醫(yī)生事先不知道切片的分組情況,充分避免偏倚的發(fā)生。1.2.6統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料采用ue0af±s表示,組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。2.1彈性好，好于彈性正常對照組10條兔耳緣靜脈清晰,血管軟,彈性好。模型組6條靜脈滿足Ⅲ級靜脈炎造模標(biāo)準(zhǔn),兔耳局部皮膚發(fā)紅、腫脹,血管變硬,彈性下降,沿血管走向出現(xiàn)條索樣改變。2.2炎性細(xì)胞浸漬,無炎癥反應(yīng)正常對照組血管內(nèi)皮連續(xù)光滑,血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,血管壁完整,周圍無炎性細(xì)胞浸潤,無炎癥反應(yīng)(-)(見圖1a)。模型組表現(xiàn)為血管壁結(jié)構(gòu)模糊,內(nèi)皮細(xì)胞斷裂、脫失,成纖維細(xì)胞增生,血管腔內(nèi)大量炎性滲出物,有血栓形成,血管周圍炎性細(xì)胞浸潤,為中度炎癥或者重度炎癥(見圖1b)。2.3局部靜脈tnf和icam-1的出現(xiàn)2.3.1tnf-蛋白表達(dá)TNF-α陽性細(xì)胞主要為血管內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等,免疫組化著色部位為細(xì)胞核,DAB顯色呈棕黃色。正常對照組TNF-α蛋白低表達(dá)(見圖2a),模型組TNF-α蛋白表達(dá)增加(見圖2b)。兩組陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較見表1(每只兔子留取4塊標(biāo)本,最終取標(biāo)本時(shí)對照組5只兔子,即20條靜脈;模型組因2只造模失敗,棄去,留取標(biāo)本為3只兔子即12條靜脈)。2.3.2小鼠骨髓正常組性免疫指標(biāo)dab蛋白表達(dá)ICAM-1陽性細(xì)胞主要為血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等,免疫組化著色部位為細(xì)胞核,DAB顯色呈棕黃色。正常對照組ICAM-1蛋白低表達(dá)(圖3a),模型組ICAM-1蛋白表達(dá)明顯增加(圖3b)。兩組陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較見表1。3.1%甘露醇是血管內(nèi)皮功能的樞紐本研究模擬臨床輸液,先進(jìn)行靜脈留置再輸入甘露醇溶液,連續(xù)5d即可出現(xiàn)條索狀靜脈,肉眼觀察和蘇木精-伊紅染色顯示中到重度的炎癥反應(yīng),而對照組無病變,說明藥物和穿刺針刺激可共同導(dǎo)致靜脈炎。首先,這可能與靜脈留置針對血管的機(jī)械刺激直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞有關(guān)。Subha等報(bào)道留置針阻塞血管加上局部包扎和制動,使血流變慢,內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,甚至整個(gè)細(xì)胞失去正常結(jié)構(gòu),從而增加膠原纖維的暴露。留置針在血管內(nèi)可改變血流方向,同時(shí)注藥時(shí)對血液產(chǎn)生沖擊,形成渦流與湍流,直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞與紅細(xì)胞,后者釋放二磷酸腺苷(ADP)可介導(dǎo)血小板活化,導(dǎo)致局部血栓形成。其次,20%甘露醇是一種高滲溶液,以微粒形式存在于溶液中,大量微粒在短時(shí)間進(jìn)入靜脈引起血栓,造成局部堵塞和供血不足,組織缺氧而產(chǎn)生水腫和炎癥。同時(shí),輸入甘露醇時(shí)血漿滲透壓升高,致使組織液滲透壓隨之升高,血管內(nèi)皮細(xì)胞脫水,進(jìn)而局部血小板聚集,并釋放前列腺素E1、前列腺素E2,靜脈壁通透性增強(qiáng),白細(xì)胞浸潤并產(chǎn)生炎癥改變,同時(shí)釋放組胺,使靜脈收縮、變硬。Malek等研究發(fā)現(xiàn),甘露醇對血管內(nèi)皮細(xì)胞也可產(chǎn)生直接有害的影響,激活炎性介質(zhì)和絲分裂素-活化蛋白激酶,直接引發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。由此可見,本研究是由靜脈留置針機(jī)械刺激和藥物刺激雙重作用導(dǎo)致的靜脈炎,其靜脈血管損傷的關(guān)鍵原因是血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,引起的重要變化是炎癥反應(yīng)和血栓形成。3.2家兔耳組織tnf-表達(dá)變化TNF-α主要是由單核巨噬細(xì)胞所分泌的一種細(xì)胞因子,在各種生理病理情況下如細(xì)菌感染、腫瘤可大量產(chǎn)生,是一種功能強(qiáng)大的炎性介質(zhì)。本研究表1