溫敏性殼聚糖-甘油磷酸鈉-膠原水凝膠的制備及其與脂肪間充質干細胞的生物相容性

溫敏性殼聚糖-甘油磷酸鈉-膠原水凝膠的制備及其與脂肪間充質干細胞的生物相容性

組織工程包括將具有特定性能的三維生物支撐材料移植到具有特定性能的三維生物支撐中，進行培養(yǎng)，并將其移植到受損組織中以修復受損組織。支架主要分為多孔支架（硬支撐）和可注射支（軟支撐）。可注射水凝膠支架屬于軟支架，具有簡單的原膠、隨機的塑料形狀、簡單的操作和較少的傷口，引起了人們的注意。含殼聚糖的生物支架由于具有生物相容性良好、無免疫原性和可生物降解等優(yōu)良性能而被廣泛應用于基礎生物醫(yī)學與臨床領域.研究表明,殼聚糖與β-甘油磷酸鈉(β-glycerophosphate,GP)可混合制成一種可注射性支架,殼聚糖與GP的混合溶液在室溫下為液態(tài),注射到體內時會變?yōu)槟z.這種水凝膠由于GP的離子濃度過高其細胞相容性較差而使得其應用受到限制.Cho等在水溶性殼聚糖上接枝異丙基丙烯酰胺制得的水溶性共聚物為不透明松散凝膠,但是異丙基丙烯酰胺的體內降解性和生物相容性還需要進一步探究.另一種水凝膠是聚(氧化乙烯-氧化丙烯-氧化乙烯)體系,但體內實驗顯示此聚合物有毒性且不能生物降解.因此上述材料均不能滿足生物相容性要求.膠原是一種天然蛋白質,為迄今為止最理想的細胞生長基質,具有低免疫原性和特殊的生物相容性、生物可降解性,是最早被應用的天然生物材料.膠原具有特異性的分子識別信號,可促進細胞的黏附和增殖,誘導細胞分化并為細胞生長提供支架.膠原在體內降解為各種氨基酸,安全無毒、無致敏源、無刺激.同時膠原也具有體溫成膠的特性,但是其在體內降解過快而且力學強度較低.本文嘗試將殼聚糖、β-甘油磷酸鈉與膠原混合后制備一種新型的溫敏性可注射水凝膠支架(C-GP-Co),并對脂肪間充質干細胞(ADSCs)在C-GP-Co水凝膠支架的生長、增殖和分化進行研究.1實驗材料和方法1.1型膠原酶、殼聚糖的合成實驗所用材料和儀器如下:鼠尾膠原(廣州創(chuàng)爾生物技術有限公司)、高糖DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)、胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)、β-甘油磷酸鈉及Ⅰ型膠原酶(Sigma)、殼聚糖(脫乙酰93%,濟南海得貝海洋生物工程有限公司)、Live/DeadViability-Cytotoxicity試劑盒(Invitrogen);倒置熒光顯微鏡(IX71Olympus)、掃描電鏡(日立S2520)、數(shù)字彩色攝像系統(tǒng)(Sony3CCD)、圖像分析系統(tǒng)(Image-pro-plus)、滲透壓儀(Wescor)、pH計(Benchtop)、SRKLYOVACGT2-9冷凍干燥機(LABCONCO).1.2sdcs的純化脂肪組織由大連沙醫(yī)生美容整形醫(yī)院提供并經(jīng)患者同意.取400～600mg人皮下脂肪組織用D-Hanks緩沖液沖洗幾次,加入與脂肪組織等體積的膠原酶和胰蛋白酶混合液(膠原酶與胰蛋白酶的體積比為1∶1)于15mL離心管中,加蓋并在37℃下190r/min的搖床中振蕩消化20min,溶液分3層,下層為單個核細胞的酶溶液層,中間層為絮狀脂肪組織層,上層為黃色油狀脂肪細胞層.吸出最下層液體并移入含10%胎牛血清的高糖DMEM的離心管中終止消化.剩余的脂肪重復上述操作2～3次,將收集到的混合液置于離心管中,1500r/min下離心10min后棄上清,加入含15%胎牛血清的DMEM重懸后接種在培養(yǎng)瓶中,放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24h后首次換液,以后每3d換一次液,7d左右細胞達95%以上融合時傳代.取4代以后純化的ADSCs備用.1.3熒光標記抗體檢測細胞流式細胞1000r/min下離心5min,用PBS緩沖溶液洗滌一次,收集ADSCs,制備105個/mL的單細胞懸液.取2支離心管,每管加入1mL細胞懸液,1000r/min離心10min后每管加入1.5mLPBS混勻,1000r/min再次離心5min,棄上清后分別加入熒光標記抗體CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-FICT、CD105-FICT和HLA-DR-PE,4℃下避光孵育30min,結果用流式細胞儀檢測并由Cell-Quest軟件分析(每個樣本至少分析10000個細胞).1.4誘導分辨率檢測abss取第6代細胞,以1.0×105個/mL的密度接種于24孔板置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng),待細胞貼壁后備用.1.4.1細胞形態(tài)觀察和染色在成脂誘導培養(yǎng)基(高糖DMEM+10%胎牛血清+0.5mmol/LIBMX+10μmol/L胰島素+1μmol/L地塞米松+1%青鏈霉素原液)培養(yǎng)下誘導分化2周,期間每2d換液一次,用相差顯微鏡觀察誘導后的細胞形態(tài)變化并進行油紅O染色.1.4.2細胞表型觀察和甲苯胺藍染色成軟骨誘導培養(yǎng)基(高糖DMEM+10%胎牛血清+6.25mg/L胰島素+10μg/LTGF-β1+50nmol/L抗壞血酸+1%青鏈霉素原液)誘導分化2周,用相差顯微鏡觀察誘導后的細胞形態(tài)并進行甲苯胺藍染色.1.4.3-甘油磷酸鈉+0.mol/甲基地塞米松細胞的alp染色取孔板中的6孔細胞,加入成骨誘導劑(DMEM+10%FBS+10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉+50μmol/L維生素C+100nmol/L地塞米松)培養(yǎng).細胞在誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)一周后取其中3孔進行ALP染色,其他3孔進行vonKossa染色.1.5殼聚糖-甘油磷酸鈉水凝膠的成膠時間將適量殼聚糖(平均相對分子質量為5000)粉末溶解于0.1mol/L的乙酸溶液制成體積分數(shù)2.2%的殼聚糖溶液,過濾除菌后置于冰浴中保存.β-甘油磷酸鈉粉末溶于三蒸水中配成質量分數(shù)50%溶液,過濾除菌.在冰浴下,按不同體積比將β-甘油磷酸鈉滴加到殼聚糖溶液中,充分攪拌,制成C-GP溶液.由于配制的殼聚糖-甘油磷酸鈉溶液中兩者的體積比不同,所得溶液的pH及成膠時間也是不同的.采用電子pH計測量不同體積比的殼聚糖-甘油磷酸鈉溶液的pH.取1mL殼聚糖-甘油磷酸鈉水凝膠體系加入小試管中,放入37℃氣浴中,每2min檢測(將小試管倒置)直至體系不流動時所經(jīng)歷的時間即為殼聚糖-甘油磷酸鈉水凝膠的成膠時間.1.6c-gp-co水凝膠的制備冰浴下向400μL膠原中加入480μL三蒸水,然后加到24μL0.1mol/LNaOH溶液中,最后加入100μL10×PBS后充分攪拌,制得2mg/mL的膠原溶液,冰浴保存.將上述配制好的C-GP溶液與膠原溶液分別以3∶7、5∶5和7∶3的體積比混合制取可注射C-GP-Co水凝膠.以每孔120μL的量將C-GP和C-GP-Co水凝膠接種在96孔板中,37℃下成膠15min后放入-80℃冰箱中預凍2h后置于冷凍干燥機內干燥48h,真空噴金后用掃描電鏡拍攝掃描照片(加速電壓為40kV).1.7細胞生長特性的測定分別將10μL/孔的C-GP-Co和C-GP水凝膠加于96孔板中,兩種水凝膠各使用21孔,在37℃培養(yǎng)箱中成膠.將第9代人吸脂來源的脂肪干細胞制成密度為8×104個/mL的細胞懸液,接種于上述42個孔中,最后接種21孔無水凝膠作對照組.63個孔中每孔加入細胞懸液100μL,移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d(每3d換一次液),并隨時用倒置熒光顯微鏡觀察細胞生長狀況.第2d起,用CCK-8試劑盒每天每組取3孔細胞用酶標儀測其吸光度.將50μL/孔的C-GP-Co水凝膠、C-GP水凝膠加入24孔板,放入37℃培養(yǎng)箱中成膠.將第9代人吸脂來源的脂肪干細胞制成8×104個/mL的細胞懸液以650μL/孔的量接種于上述孔板.第3d和第7d時用Live/DeadViability-Cytotoxicity試劑盒染色以觀察水凝膠中細胞的死亡狀況.1.8培養(yǎng)基的滲透率測定分別將30μLC-GP-Co水凝膠溶液和C-GP水凝膠溶液加入96孔板,37℃下成膠1h后加入100μL培養(yǎng)基過夜.用滲透壓儀測定C-GP-Co水凝膠和C-GP水凝膠中培養(yǎng)基的滲透壓并與標準培養(yǎng)基的滲透壓對照.1.9數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析實驗均平行3次,統(tǒng)計結果用Origin7.5軟件處理,用t-檢驗確定顯著性水平,并用“平均值±標準偏差”表示.2結果與討論2.1細胞誘導和免疫在倒置相差顯微鏡下觀察,脂肪單個核細胞的培養(yǎng)瓶中細胞多數(shù)為圓形.原代ADSCs培養(yǎng)24h后有少數(shù)單個細胞貼壁生長,呈多角形、圓形或長梭形散布于瓶底.培養(yǎng)至第7d時,少數(shù)細胞為圓形或多角形,大多數(shù)貼壁細胞呈長梭形,見圖1(a)～(c).脂肪干細胞誘導分化能力鑒定:①成骨誘導.細胞誘導1周后,形態(tài)由長梭狀向扁圓形轉變,深淺不一的黑色區(qū)域為被ALP染色的成骨細胞,見圖1(d).②成軟骨誘導.成軟骨誘導培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)后,單個細胞形態(tài)并無明顯變化.隨誘導時間延長,在細胞密度較大處細胞呈顆粒狀.2周后,甲苯胺藍染色時軟骨細胞外基質被染為藍色,如圖1(e)所示(圖中深色部分).③成脂誘導.成脂誘導培養(yǎng)后細胞由長梭形變?yōu)椴灰?guī)則圓形,細胞體積增大且大小不一.誘導后4d時可在細胞內觀察到小脂滴,隨后小脂滴逐漸增多并匯合成大脂滴.誘導培養(yǎng)2周時,細胞分化達到高峰.油紅O染色結果見圖1(f).實驗選擇特異性表面抗原CD34、CD44、CD45、CD105以及HLA-DR進行了免疫表型檢測.結果發(fā)現(xiàn)本研究分離培養(yǎng)的細胞均表達間充質細胞的表面標志分子CD44、CD105,而不表達造血細胞的表面標志分子CD34、CD45和HLA-DR.說明了本研究中分離培養(yǎng)的ADSCs經(jīng)傳代培養(yǎng)后仍能保持其干細胞表型,見圖2(a)～(f).2.2殼聚糖與-甘油磷酸鈉成膠溶液ph的變化殼聚糖與β-甘油磷酸鈉溶液不同體積比混合得到的C-GP溶液的pH及水凝膠成膠時間見表1.由表可以看出,隨著β-甘油磷酸鈉比例的增加,成膠時間減少的同時體系pH升高,此結果與Chenite等的報道基本一致.本研究還發(fā)現(xiàn),若將磷酸氫二鈉的溶液加入殼聚糖溶液中,在pH大于6.3時,有白色沉淀出現(xiàn)且可在室溫成膠,分析其具體作用機理:殼聚糖鏈被β-甘油磷酸鈉的多醇基團分開從而加快了其分子周圍水殼層的形成,殼聚糖鏈的保護性水合作用形成使得低溫中性環(huán)境下殼聚糖鏈不能締合.但隨溫度升高,殼聚糖鏈間的疏水作用和氫鍵作用逐漸增強,溶液中開始出現(xiàn)物理交聯(lián)區(qū),凝膠得以發(fā)生.從表1中可以看出,殼聚糖與β-甘油磷酸鈉混合溶液pH為7.16,體積比為5∶1時,成膠時間為10min,而且此時膠原的引入基本不影響成膠時間及水凝膠的pH,因此下述實驗所需的殼聚糖與β-甘油磷酸鈉水溶液均采用該比例.2.3殼聚糖--甘油磷酸鈉-膠原的含量對其降解c-gp-co水凝膠的影響將上述C-GP溶液與膠原溶液分別以7∶3、5∶5和3∶7的體積比混合,成膠時間分別為12、12和14min.所得溶液置于37℃下成膠(室溫下為液體狀),見圖3(a)、(b)(圖中水凝膠C-GP溶液與膠原溶液體積比為5∶5).考慮到膠原溶液占總體積的比例與水凝膠的降解速率成正比,以下實驗C-GP-Co水凝膠均采用1∶1的體積比配制,即殼聚糖-β-甘油磷酸鈉-膠原體積比為5∶1∶6.掃描電鏡觀察C-GP和C-GP-Co水凝膠內部均為海綿狀多孔結構,見圖3(c)、(d).但C-GP-Co水凝膠內部的孔道更加致密均勻、連貫,直徑范圍為100～200μm,而C-GP水凝膠的孔道不規(guī)則、松散,直徑更大.分析其原因:隨溫度升高,殼聚糖分子表現(xiàn)為疏水并聚合成更大的分子從溶液中析出,導致殼聚糖分子在溶液體系中的分散度降低,從而形成了更大的空隙.由于膠原不參與殼聚糖分子聚合,膠原的加入可以有效填補殼聚糖聚合留下的空隙,使形成的水凝膠內部孔道更小且致密.另外,本研究還發(fā)現(xiàn),加入膠原后C-GP水凝膠強度有所加強,這也是C-GP和C-GP-Co水凝膠內部結構不同導致的結果.2.4c-gp-co水凝膠中活細胞的增殖情況本實驗測定了C-GP水凝膠提取培養(yǎng)基、C-GP-Co水凝膠提取培養(yǎng)基及標準培養(yǎng)基的滲透壓,結果見圖4.β-甘油磷酸鈉為可溶性鹽,故有大量離子解離并溶解到周圍溶液中,所以C-GP水凝膠提取培養(yǎng)基的滲透壓最高,對細胞的生長最不利,超過370mmol/kg.膠原本身不解離離子,所以C-GP-Co水凝膠提取培養(yǎng)基的滲透壓次之,標準培養(yǎng)基的滲透壓最低.雖然C-GP-Co水凝膠中的滲透壓高于標準培養(yǎng)基,但仍在細胞可耐受的滲透壓范圍內(240～370mmol/kg).第7d時用倒置熒光顯微鏡觀察3組細胞均呈長梭狀生長,見圖5(a)～(c).C-GP-Co水凝膠組比C-GP水凝膠組的細胞形態(tài)好,數(shù)目多.實驗組由于含有甘油磷酸鈉溶液而對細胞有一定的毒性,所以對照組的細胞形態(tài)最好,數(shù)量最多.采用CCK-8法測得細胞增殖情況,C-GP-Co水凝膠組吸光度隨時間增長而增高,且明顯比C-GP水凝膠組吸光度高;對照組的吸光度最高并保持增長;C-GP水凝膠組吸光度隨時間增長稍有降低.這說明C-GP-Co水凝膠組細胞能夠不斷增殖,并且增殖情況明顯好于C-GP水凝膠組,C-GP水凝膠組細胞數(shù)量隨著時間延長而有所降低,對照組細胞增殖情況最好,見圖6(a).對8個隨機的顯微鏡視野內兩種水凝膠中活細胞數(shù)量進行人工計數(shù)分析,結果見圖6(b).第3d、第7d時C-GP-Co水凝膠中活細胞的數(shù)量無明顯變化,但均高于C-GP水凝膠中活細胞數(shù)量,而C-GP水凝膠中活細胞數(shù)量略有降低,統(tǒng)計結果與CCK-8法檢測結果保持一致.兩種水凝膠中脂肪間充質干細胞的Live/DeadViability-Cytotoxicity試劑盒檢測結果見圖7.第3d時C-GP-Co水凝膠中生長的細胞呈長梭狀,形態(tài)良好,只有少數(shù)細胞調亡;而C-GP水凝膠中只有少數(shù)細胞呈伸展狀態(tài),死亡細胞也比較少,原因是染色時部分死亡細胞被緩沖溶液沖洗掉.第7d時,C-GP-Co水凝膠中死亡細胞數(shù)量稍有增多,但活細胞數(shù)量與之相比更多并呈伸展狀態(tài),而C-GP水凝膠中的活細胞有減少的趨勢,細胞狀態(tài)差,死亡細胞數(shù)量明顯增多.由以上實驗結果可以看出,由于C-GP水凝膠中含有較高的離子濃度,對細胞造成了一定的毒性作用,同時由于殼聚糖對細胞的親合力比膠原差,C-GP水凝膠細胞的生長狀態(tài)和活率均小于C-GP-Co水凝膠.而膠原作為組織工程支架材料,雖強度較差、降解速度較快且不能與細胞的生長速度保持一致,但是具有很好的細胞親合力,可促進細胞的黏附和增殖.通過將C-GP水凝膠與膠原混合制成C-GP-Co水凝膠,能夠使材料對ADSCs的親合性增強.另外殼聚糖帶正電荷,膠原帶相反電荷,故兩者可通過靜電作用使膠原的降解速度降低.2.5克氏原螯蝦中的脂肪細胞的活性工程組織的體外構建需要種子細胞與支架復合后構建成為新組織,前述結果表明ADSCs在C-GP-Co水凝膠表面能夠很好地生長增殖,但還需要ADSCs在水凝膠內部生長增殖后仍能保持分化潛能.在成脂誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)14d后,倒置顯微鏡及油紅O染色照片見圖8(a)、(b),誘導5d后即可在顯微鏡視野下觀察到長梭狀干細胞中出現(xiàn)小的圓形脂滴,隨時間延長,脂滴變得越來越多.油紅O染色后,細胞內有大量紅色脂滴出現(xiàn),表現(xiàn)出脂肪細胞的特征,這說明C-GP-Co水凝膠表面生長的脂肪干細胞已被誘導分化為脂肪細胞,ADSCs在C-GP-Co水凝膠上培養(yǎng)后仍有分化能力.圖中所見圓形脂肪細胞均較小且活性較強:從第5d脂滴開始出現(xiàn)到第14d觀察結束時沒有出現(xiàn)脂滴破裂或細胞死亡情況,而從人體內直接分離出的成體脂肪細胞體積大、活性差,培養(yǎng)7d左右時脂滴破裂,細胞死亡.2.6c-gp-co水凝膠內部的電鏡觀察由于C-GP-Co水凝膠中含有細胞親合性很好的膠原,可見大量ADSCs呈伸展狀相互連接在一起,并且ADSCs