溫敏性殼聚糖-甘油磷酸鈉-膠原水凝膠的制備及其與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的生物相容性

溫敏性殼聚糖-甘油磷酸鈉-膠原水凝膠的制備及其與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的生物相容性

組織工程包括將具有特定性能的三維生物支撐材料移植到具有特定性能的三維生物支撐中，進(jìn)行培養(yǎng)，并將其移植到受損組織中以修復(fù)受損組織。支架主要分為多孔支架（硬支撐）和可注射支（軟支撐）?？勺⑸渌z支架屬于軟支架，具有簡(jiǎn)單的原膠、隨機(jī)的塑料形狀、簡(jiǎn)單的操作和較少的傷口，引起了人們的注意。含殼聚糖的生物支架由于具有生物相容性良好、無(wú)免疫原性和可生物降解等優(yōu)良性能而被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)與臨床領(lǐng)域.研究表明,殼聚糖與β-甘油磷酸鈉(β-glycerophosphate,GP)可混合制成一種可注射性支架,殼聚糖與GP的混合溶液在室溫下為液態(tài),注射到體內(nèi)時(shí)會(huì)變?yōu)槟z.這種水凝膠由于GP的離子濃度過(guò)高其細(xì)胞相容性較差而使得其應(yīng)用受到限制.Cho等在水溶性殼聚糖上接枝異丙基丙烯酰胺制得的水溶性共聚物為不透明松散凝膠,但是異丙基丙烯酰胺的體內(nèi)降解性和生物相容性還需要進(jìn)一步探究.另一種水凝膠是聚(氧化乙烯-氧化丙烯-氧化乙烯)體系,但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示此聚合物有毒性且不能生物降解.因此上述材料均不能滿(mǎn)足生物相容性要求.膠原是一種天然蛋白質(zhì),為迄今為止最理想的細(xì)胞生長(zhǎng)基質(zhì),具有低免疫原性和特殊的生物相容性、生物可降解性,是最早被應(yīng)用的天然生物材料.膠原具有特異性的分子識(shí)別信號(hào),可促進(jìn)細(xì)胞的黏附和增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞分化并為細(xì)胞生長(zhǎng)提供支架.膠原在體內(nèi)降解為各種氨基酸,安全無(wú)毒、無(wú)致敏源、無(wú)刺激.同時(shí)膠原也具有體溫成膠的特性,但是其在體內(nèi)降解過(guò)快而且力學(xué)強(qiáng)度較低.本文嘗試將殼聚糖、β-甘油磷酸鈉與膠原混合后制備一種新型的溫敏性可注射水凝膠支架(C-GP-Co),并對(duì)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)在C-GP-Co水凝膠支架的生長(zhǎng)、增殖和分化進(jìn)行研究.1實(shí)驗(yàn)材料和方法1.1型膠原酶、殼聚糖的合成實(shí)驗(yàn)所用材料和儀器如下:鼠尾膠原(廣州創(chuàng)爾生物技術(shù)有限公司)、高糖DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)、胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)、β-甘油磷酸鈉及Ⅰ型膠原酶(Sigma)、殼聚糖(脫乙酰93%,濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司)、Live/DeadViability-Cytotoxicity試劑盒(Invitrogen);倒置熒光顯微鏡(IX71Olympus)、掃描電鏡(日立S2520)、數(shù)字彩色攝像系統(tǒng)(Sony3CCD)、圖像分析系統(tǒng)(Image-pro-plus)、滲透壓儀(Wescor)、pH計(jì)(Benchtop)、SRKLYOVACGT2-9冷凍干燥機(jī)(LABCONCO).1.2sdcs的純化脂肪組織由大連沙醫(yī)生美容整形醫(yī)院提供并經(jīng)患者同意.取400～600mg人皮下脂肪組織用D-Hanks緩沖液沖洗幾次,加入與脂肪組織等體積的膠原酶和胰蛋白酶混合液(膠原酶與胰蛋白酶的體積比為1∶1)于15mL離心管中,加蓋并在37℃下190r/min的搖床中振蕩消化20min,溶液分3層,下層為單個(gè)核細(xì)胞的酶溶液層,中間層為絮狀脂肪組織層,上層為黃色油狀脂肪細(xì)胞層.吸出最下層液體并移入含10%胎牛血清的高糖DMEM的離心管中終止消化.剩余的脂肪重復(fù)上述操作2～3次,將收集到的混合液置于離心管中,1500r/min下離心10min后棄上清,加入含15%胎牛血清的DMEM重懸后接種在培養(yǎng)瓶中,放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24h后首次換液,以后每3d換一次液,7d左右細(xì)胞達(dá)95%以上融合時(shí)傳代.取4代以后純化的ADSCs備用.1.3熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)細(xì)胞流式細(xì)胞1000r/min下離心5min,用PBS緩沖溶液洗滌一次,收集ADSCs,制備105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液.取2支離心管,每管加入1mL細(xì)胞懸液,1000r/min離心10min后每管加入1.5mLPBS混勻,1000r/min再次離心5min,棄上清后分別加入熒光標(biāo)記抗體CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-FICT、CD105-FICT和HLA-DR-PE,4℃下避光孵育30min,結(jié)果用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并由Cell-Quest軟件分析(每個(gè)樣本至少分析10000個(gè)細(xì)胞).1.4誘導(dǎo)分辨率檢測(cè)abss取第6代細(xì)胞,以1.0×105個(gè)/mL的密度接種于24孔板置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后備用.1.4.1細(xì)胞形態(tài)觀察和染色在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(高糖DMEM+10%胎牛血清+0.5mmol/LIBMX+10μmol/L胰島素+1μmol/L地塞米松+1%青鏈霉素原液)培養(yǎng)下誘導(dǎo)分化2周,期間每2d換液一次,用相差顯微鏡觀察誘導(dǎo)后的細(xì)胞形態(tài)變化并進(jìn)行油紅O染色.1.4.2細(xì)胞表型觀察和甲苯胺藍(lán)染色成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(高糖DMEM+10%胎牛血清+6.25mg/L胰島素+10μg/LTGF-β1+50nmol/L抗壞血酸+1%青鏈霉素原液)誘導(dǎo)分化2周,用相差顯微鏡觀察誘導(dǎo)后的細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色.1.4.3-甘油磷酸鈉+0.mol/甲基地塞米松細(xì)胞的alp染色取孔板中的6孔細(xì)胞,加入成骨誘導(dǎo)劑(DMEM+10%FBS+10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉+50μmol/L維生素C+100nmol/L地塞米松)培養(yǎng).細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一周后取其中3孔進(jìn)行ALP染色,其他3孔進(jìn)行vonKossa染色.1.5殼聚糖-甘油磷酸鈉水凝膠的成膠時(shí)間將適量殼聚糖(平均相對(duì)分子質(zhì)量為5000)粉末溶解于0.1mol/L的乙酸溶液制成體積分?jǐn)?shù)2.2%的殼聚糖溶液,過(guò)濾除菌后置于冰浴中保存.β-甘油磷酸鈉粉末溶于三蒸水中配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%溶液,過(guò)濾除菌.在冰浴下,按不同體積比將β-甘油磷酸鈉滴加到殼聚糖溶液中,充分?jǐn)嚢?制成C-GP溶液.由于配制的殼聚糖-甘油磷酸鈉溶液中兩者的體積比不同,所得溶液的pH及成膠時(shí)間也是不同的.采用電子pH計(jì)測(cè)量不同體積比的殼聚糖-甘油磷酸鈉溶液的pH.取1mL殼聚糖-甘油磷酸鈉水凝膠體系加入小試管中,放入37℃氣浴中,每2min檢測(cè)(將小試管倒置)直至體系不流動(dòng)時(shí)所經(jīng)歷的時(shí)間即為殼聚糖-甘油磷酸鈉水凝膠的成膠時(shí)間.1.6c-gp-co水凝膠的制備冰浴下向400μL膠原中加入480μL三蒸水,然后加到24μL0.1mol/LNaOH溶液中,最后加入100μL10×PBS后充分?jǐn)嚢?制得2mg/mL的膠原溶液,冰浴保存.將上述配制好的C-GP溶液與膠原溶液分別以3∶7、5∶5和7∶3的體積比混合制取可注射C-GP-Co水凝膠.以每孔120μL的量將C-GP和C-GP-Co水凝膠接種在96孔板中,37℃下成膠15min后放入-80℃冰箱中預(yù)凍2h后置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥48h,真空噴金后用掃描電鏡拍攝掃描照片(加速電壓為40kV).1.7細(xì)胞生長(zhǎng)特性的測(cè)定分別將10μL/孔的C-GP-Co和C-GP水凝膠加于96孔板中,兩種水凝膠各使用21孔,在37℃培養(yǎng)箱中成膠.將第9代人吸脂來(lái)源的脂肪干細(xì)胞制成密度為8×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,接種于上述42個(gè)孔中,最后接種21孔無(wú)水凝膠作對(duì)照組.63個(gè)孔中每孔加入細(xì)胞懸液100μL,移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d(每3d換一次液),并隨時(shí)用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況.第2d起,用CCK-8試劑盒每天每組取3孔細(xì)胞用酶標(biāo)儀測(cè)其吸光度.將50μL/孔的C-GP-Co水凝膠、C-GP水凝膠加入24孔板,放入37℃培養(yǎng)箱中成膠.將第9代人吸脂來(lái)源的脂肪干細(xì)胞制成8×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液以650μL/孔的量接種于上述孔板.第3d和第7d時(shí)用Live/DeadViability-Cytotoxicity試劑盒染色以觀察水凝膠中細(xì)胞的死亡狀況.1.8培養(yǎng)基的滲透率測(cè)定分別將30μLC-GP-Co水凝膠溶液和C-GP水凝膠溶液加入96孔板,37℃下成膠1h后加入100μL培養(yǎng)基過(guò)夜.用滲透壓儀測(cè)定C-GP-Co水凝膠和C-GP水凝膠中培養(yǎng)基的滲透壓并與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的滲透壓對(duì)照.1.9數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)均平行3次,統(tǒng)計(jì)結(jié)果用Origin7.5軟件處理,用t-檢驗(yàn)確定顯著性水平,并用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示.2結(jié)果與討論2.1細(xì)胞誘導(dǎo)和免疫在倒置相差顯微鏡下觀察,脂肪單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中細(xì)胞多數(shù)為圓形.原代ADSCs培養(yǎng)24h后有少數(shù)單個(gè)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),呈多角形、圓形或長(zhǎng)梭形散布于瓶底.培養(yǎng)至第7d時(shí),少數(shù)細(xì)胞為圓形或多角形,大多數(shù)貼壁細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,見(jiàn)圖1(a)～(c).脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力鑒定:①成骨誘導(dǎo).細(xì)胞誘導(dǎo)1周后,形態(tài)由長(zhǎng)梭狀向扁圓形轉(zhuǎn)變,深淺不一的黑色區(qū)域?yàn)楸籄LP染色的成骨細(xì)胞,見(jiàn)圖1(d).②成軟骨誘導(dǎo).成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)后,單個(gè)細(xì)胞形態(tài)并無(wú)明顯變化.隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng),在細(xì)胞密度較大處細(xì)胞呈顆粒狀.2周后,甲苯胺藍(lán)染色時(shí)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)被染為藍(lán)色,如圖1(e)所示(圖中深色部分).③成脂誘導(dǎo).成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變?yōu)椴灰?guī)則圓形,細(xì)胞體積增大且大小不一.誘導(dǎo)后4d時(shí)可在細(xì)胞內(nèi)觀察到小脂滴,隨后小脂滴逐漸增多并匯合成大脂滴.誘導(dǎo)培養(yǎng)2周時(shí),細(xì)胞分化達(dá)到高峰.油紅O染色結(jié)果見(jiàn)圖1(f).實(shí)驗(yàn)選擇特異性表面抗原CD34、CD44、CD45、CD105以及HLA-DR進(jìn)行了免疫表型檢測(cè).結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究分離培養(yǎng)的細(xì)胞均表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)志分子CD44、CD105,而不表達(dá)造血細(xì)胞的表面標(biāo)志分子CD34、CD45和HLA-DR.說(shuō)明了本研究中分離培養(yǎng)的ADSCs經(jīng)傳代培養(yǎng)后仍能保持其干細(xì)胞表型,見(jiàn)圖2(a)～(f).2.2殼聚糖與-甘油磷酸鈉成膠溶液ph的變化殼聚糖與β-甘油磷酸鈉溶液不同體積比混合得到的C-GP溶液的pH及水凝膠成膠時(shí)間見(jiàn)表1.由表可以看出,隨著β-甘油磷酸鈉比例的增加,成膠時(shí)間減少的同時(shí)體系pH升高,此結(jié)果與Chenite等的報(bào)道基本一致.本研究還發(fā)現(xiàn),若將磷酸氫二鈉的溶液加入殼聚糖溶液中,在pH大于6.3時(shí),有白色沉淀出現(xiàn)且可在室溫成膠,分析其具體作用機(jī)理:殼聚糖鏈被β-甘油磷酸鈉的多醇基團(tuán)分開(kāi)從而加快了其分子周?chē)畾拥男纬?殼聚糖鏈的保護(hù)性水合作用形成使得低溫中性環(huán)境下殼聚糖鏈不能締合.但隨溫度升高,殼聚糖鏈間的疏水作用和氫鍵作用逐漸增強(qiáng),溶液中開(kāi)始出現(xiàn)物理交聯(lián)區(qū),凝膠得以發(fā)生.從表1中可以看出,殼聚糖與β-甘油磷酸鈉混合溶液pH為7.16,體積比為5∶1時(shí),成膠時(shí)間為10min,而且此時(shí)膠原的引入基本不影響成膠時(shí)間及水凝膠的pH,因此下述實(shí)驗(yàn)所需的殼聚糖與β-甘油磷酸鈉水溶液均采用該比例.2.3殼聚糖--甘油磷酸鈉-膠原的含量對(duì)其降解c-gp-co水凝膠的影響將上述C-GP溶液與膠原溶液分別以7∶3、5∶5和3∶7的體積比混合,成膠時(shí)間分別為12、12和14min.所得溶液置于37℃下成膠(室溫下為液體狀),見(jiàn)圖3(a)、(b)(圖中水凝膠C-GP溶液與膠原溶液體積比為5∶5).考慮到膠原溶液占總體積的比例與水凝膠的降解速率成正比,以下實(shí)驗(yàn)C-GP-Co水凝膠均采用1∶1的體積比配制,即殼聚糖-β-甘油磷酸鈉-膠原體積比為5∶1∶6.掃描電鏡觀察C-GP和C-GP-Co水凝膠內(nèi)部均為海綿狀多孔結(jié)構(gòu),見(jiàn)圖3(c)、(d).但C-GP-Co水凝膠內(nèi)部的孔道更加致密均勻、連貫,直徑范圍為100～200μm,而C-GP水凝膠的孔道不規(guī)則、松散,直徑更大.分析其原因:隨溫度升高,殼聚糖分子表現(xiàn)為疏水并聚合成更大的分子從溶液中析出,導(dǎo)致殼聚糖分子在溶液體系中的分散度降低,從而形成了更大的空隙.由于膠原不參與殼聚糖分子聚合,膠原的加入可以有效填補(bǔ)殼聚糖聚合留下的空隙,使形成的水凝膠內(nèi)部孔道更小且致密.另外,本研究還發(fā)現(xiàn),加入膠原后C-GP水凝膠強(qiáng)度有所加強(qiáng),這也是C-GP和C-GP-Co水凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致的結(jié)果.2.4c-gp-co水凝膠中活細(xì)胞的增殖情況本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了C-GP水凝膠提取培養(yǎng)基、C-GP-Co水凝膠提取培養(yǎng)基及標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的滲透壓,結(jié)果見(jiàn)圖4.β-甘油磷酸鈉為可溶性鹽,故有大量離子解離并溶解到周?chē)芤褐?所以C-GP水凝膠提取培養(yǎng)基的滲透壓最高,對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)最不利,超過(guò)370mmol/kg.膠原本身不解離離子,所以C-GP-Co水凝膠提取培養(yǎng)基的滲透壓次之,標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的滲透壓最低.雖然C-GP-Co水凝膠中的滲透壓高于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基,但仍在細(xì)胞可耐受的滲透壓范圍內(nèi)(240～370mmol/kg).第7d時(shí)用倒置熒光顯微鏡觀察3組細(xì)胞均呈長(zhǎng)梭狀生長(zhǎng),見(jiàn)圖5(a)～(c).C-GP-Co水凝膠組比C-GP水凝膠組的細(xì)胞形態(tài)好,數(shù)目多.實(shí)驗(yàn)組由于含有甘油磷酸鈉溶液而對(duì)細(xì)胞有一定的毒性,所以對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)最好,數(shù)量最多.采用CCK-8法測(cè)得細(xì)胞增殖情況,C-GP-Co水凝膠組吸光度隨時(shí)間增長(zhǎng)而增高,且明顯比C-GP水凝膠組吸光度高;對(duì)照組的吸光度最高并保持增長(zhǎng);C-GP水凝膠組吸光度隨時(shí)間增長(zhǎng)稍有降低.這說(shuō)明C-GP-Co水凝膠組細(xì)胞能夠不斷增殖,并且增殖情況明顯好于C-GP水凝膠組,C-GP水凝膠組細(xì)胞數(shù)量隨著時(shí)間延長(zhǎng)而有所降低,對(duì)照組細(xì)胞增殖情況最好,見(jiàn)圖6(a).對(duì)8個(gè)隨機(jī)的顯微鏡視野內(nèi)兩種水凝膠中活細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行人工計(jì)數(shù)分析,結(jié)果見(jiàn)圖6(b).第3d、第7d時(shí)C-GP-Co水凝膠中活細(xì)胞的數(shù)量無(wú)明顯變化,但均高于C-GP水凝膠中活細(xì)胞數(shù)量,而C-GP水凝膠中活細(xì)胞數(shù)量略有降低,統(tǒng)計(jì)結(jié)果與CCK-8法檢測(cè)結(jié)果保持一致.兩種水凝膠中脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的Live/DeadViability-Cytotoxicity試劑盒檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7.第3d時(shí)C-GP-Co水凝膠中生長(zhǎng)的細(xì)胞呈長(zhǎng)梭狀,形態(tài)良好,只有少數(shù)細(xì)胞調(diào)亡;而C-GP水凝膠中只有少數(shù)細(xì)胞呈伸展?fàn)顟B(tài),死亡細(xì)胞也比較少,原因是染色時(shí)部分死亡細(xì)胞被緩沖溶液沖洗掉.第7d時(shí),C-GP-Co水凝膠中死亡細(xì)胞數(shù)量稍有增多,但活細(xì)胞數(shù)量與之相比更多并呈伸展?fàn)顟B(tài),而C-GP水凝膠中的活細(xì)胞有減少的趨勢(shì),細(xì)胞狀態(tài)差,死亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多.由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,由于C-GP水凝膠中含有較高的離子濃度,對(duì)細(xì)胞造成了一定的毒性作用,同時(shí)由于殼聚糖對(duì)細(xì)胞的親合力比膠原差,C-GP水凝膠細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和活率均小于C-GP-Co水凝膠.而膠原作為組織工程支架材料,雖強(qiáng)度較差、降解速度較快且不能與細(xì)胞的生長(zhǎng)速度保持一致,但是具有很好的細(xì)胞親合力,可促進(jìn)細(xì)胞的黏附和增殖.通過(guò)將C-GP水凝膠與膠原混合制成C-GP-Co水凝膠,能夠使材料對(duì)ADSCs的親合性增強(qiáng).另外殼聚糖帶正電荷,膠原帶相反電荷,故兩者可通過(guò)靜電作用使膠原的降解速度降低.2.5克氏原螯蝦中的脂肪細(xì)胞的活性工程組織的體外構(gòu)建需要種子細(xì)胞與支架復(fù)合后構(gòu)建成為新組織,前述結(jié)果表明ADSCs在C-GP-Co水凝膠表面能夠很好地生長(zhǎng)增殖,但還需要ADSCs在水凝膠內(nèi)部生長(zhǎng)增殖后仍能保持分化潛能.在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)14d后,倒置顯微鏡及油紅O染色照片見(jiàn)圖8(a)、(b),誘導(dǎo)5d后即可在顯微鏡視野下觀察到長(zhǎng)梭狀干細(xì)胞中出現(xiàn)小的圓形脂滴,隨時(shí)間延長(zhǎng),脂滴變得越來(lái)越多.油紅O染色后,細(xì)胞內(nèi)有大量紅色脂滴出現(xiàn),表現(xiàn)出脂肪細(xì)胞的特征,這說(shuō)明C-GP-Co水凝膠表面生長(zhǎng)的脂肪干細(xì)胞已被誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞,ADSCs在C-GP-Co水凝膠上培養(yǎng)后仍有分化能力.圖中所見(jiàn)圓形脂肪細(xì)胞均較小且活性較強(qiáng):從第5d脂滴開(kāi)始出現(xiàn)到第14d觀察結(jié)束時(shí)沒(méi)有出現(xiàn)脂滴破裂或細(xì)胞死亡情況,而從人體內(nèi)直接分離出的成體脂肪細(xì)胞體積大、活性差,培養(yǎng)7d左右時(shí)脂滴破裂,細(xì)胞死亡.2.6c-gp-co水凝膠內(nèi)部的電鏡觀察由于C-GP-Co水凝膠中含有細(xì)胞親合性很好的膠原,可見(jiàn)大量ADSCs呈伸展?fàn)钕嗷ミB接在一起,并且ADSCs