逆針灸關(guān)元穴對去卵巢大鼠下丘腦功能的調(diào)節(jié)機(jī)制

逆針灸關(guān)元穴對去卵巢大鼠下丘腦功能的調(diào)節(jié)機(jī)制

腦癱是皮質(zhì)下的一個(gè)高級中樞神經(jīng)。在適應(yīng)和神經(jīng)營養(yǎng)方面，它重要于調(diào)節(jié)應(yīng)激態(tài)下身體的內(nèi)臟活動(dòng)、神經(jīng)、內(nèi)政部和免疫功能。逆針灸是針灸治未病的重要方法之一,即在機(jī)體無病、疾病發(fā)生之前或疾病發(fā)展輕淺之時(shí),預(yù)先采用針灸的方法,激發(fā)經(jīng)絡(luò)之氣,以增強(qiáng)機(jī)體的抗病與應(yīng)變能力,是保健延年、防止疾病發(fā)生或減輕隨后疾病損害程度的傳統(tǒng)方法。本實(shí)驗(yàn)通過觀察去卵巢大鼠下丘腦弓狀核、室旁核、視上核中熱休克蛋白70(HSP70)及HSP70mRNA的表達(dá)以及逆針灸對其干預(yù)作用,試圖從應(yīng)激角度探討逆針灸對更年期機(jī)體的調(diào)節(jié)機(jī)制。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物選用清潔級健康3.5月齡SD雌性大鼠30只,體質(zhì)量(240±20)g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號:SCXK(京)2002-0003]。按照隨機(jī)數(shù)字法分為5組,每組6只,即正常組、假手術(shù)組、去卵巢模型組、逆針組、逆灸組。1.2主要試劑和材料1)儀器:MIS-2000SP型3Y顯微圖像分析儀(美國);Leitz1410型石蠟切片機(jī)(德國)。2)主要試劑:HSP-70免疫組化試劑盒、一抗:中山試劑公司;HSP-70原位雜交探針和試劑盒:博士德試劑公司。3)材料:艾炷:直徑0.7cm,高度1cm,質(zhì)量約2g,“易艾灸”品牌,吳江市云龍醫(yī)療器械有限公司研制。毫針:環(huán)球牌直徑0.35mm,長25mm的不銹鋼針灸針,蘇州環(huán)球針灸醫(yī)療器械有限公司制造。1.3取穴關(guān)元穴:位于大鼠兩后肢根部連線的中點(diǎn)。參照林文注主編《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜定位。1.4關(guān)元穴留針2次逆灸組:灸前將以關(guān)元穴為中心直徑約2cm區(qū)域的鼠毛剪凈,暴露穴區(qū)皮膚,讓大鼠仰躺在手掌上,待其安靜,將艾炷點(diǎn)燃后,直接放置在穴位上,每次灸1壯,灸至艾炷燒完,約5min。灸后局部皮膚略紅,但不發(fā)泡。2次/周,共灸4周。逆針組:讓大鼠仰躺在手掌上,待其安靜,將針直刺大鼠關(guān)元穴約6mm后斜向上完全刺入,留針20min。2次/周,共針4周。留針過程中讓大鼠處于自然狀態(tài)。正常組、假手術(shù)組、去卵巢模型組與逆針組、逆灸組同步(每周2次,共4周),以手抓放大鼠。1.5造模、切除卵巢大鼠飼養(yǎng)1個(gè)月,針灸治療結(jié)束后,逆灸組、逆針組與去卵巢模型組同時(shí)開始造模,摘除雙側(cè)卵巢。假手術(shù)組僅切除卵巢周圍少量脂肪。造模1個(gè)月后取材。1.6免疫組化和原位雜交的測定下丘腦HSP70及HSP70mRNA分別采用免疫組化和原位雜交方法測定。采集圖像分析,N為陽性染色的細(xì)胞個(gè)數(shù),AHD為平均光密度,以總光密度值(ZHD)為觀察指標(biāo),ZHD=N×AHD。1.7均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差均數(shù)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示。組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),以P<0.05,P<0.01作為具有顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果2.1去卵巢模型對逆充逆藥大鼠hsp60mrna表達(dá)的影響與正常組比較,各組下丘腦弓狀核HSP70及HSP70mRNA表達(dá)均升高,除假手術(shù)組HSP70mRNA表達(dá)外,均具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01);與假手術(shù)組比較,去卵巢模型組、逆灸組、逆針組HSP70及HSP70mRNA表達(dá)均升高,其中去卵巢模型組和逆灸組HSP70mRNA表達(dá)具有顯著性差異(P<0.01,P<0.05);與去卵巢模型組比較,逆灸組、逆針組HSP70mRNA表達(dá)均顯著下降(P<0.01)。見表1。2.2去卵巢模型對hsp60mrna表達(dá)的影響與正常組比較,下丘腦室旁核HSP70及HSP70mRNA表達(dá)均升高,除假手術(shù)組及逆針組HSP70外,各組均具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01);與假手術(shù)組比較,去卵巢模型組、逆灸組、逆針組HSP70及HSP70mRNA表達(dá)均升高,其中去卵巢模型組和逆針組HSP70mRNA表達(dá)具有顯著性差異(P<0.01,P<0.05);與去卵巢模型組比較,逆灸組、逆針組HSP70及HSP70mRNA表達(dá)呈下降趨勢(P>0.05)。見表2。2.3去卵巢模型對血清hsp80mrna表達(dá)的影響與正常組比較,下丘腦視上核HSP70及HSP70mRNA表達(dá)均升高,除假手術(shù)組外,各組均具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01);與假手術(shù)組比較,去卵巢模型組、逆灸組、逆針組HSP70及HSP70mRNA表達(dá)均升高,其中去卵巢模型組HSP70表達(dá)具有顯著性差異(P<0.01);與去卵巢模型組比較,逆灸組、逆針組HSP70及HSP70mRNA表達(dá)呈下降趨勢(P>0.05)。見表3。3逆藥回復(fù)突變hsp60基因表達(dá)的多態(tài)性下丘腦包含有弓狀核、室旁核、視上核等多個(gè)神經(jīng)核團(tuán),是性腺軸、神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)以及應(yīng)激的高級中樞,對于調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)臟活動(dòng)、內(nèi)分泌和情緒行為之間的平衡具有重要作用。其弓狀核是神經(jīng)肽Y和β-內(nèi)啡肽能神經(jīng)元的主要分布部位,室旁核、視上核內(nèi)含有多種神經(jīng)活性物質(zhì),如加壓素、催產(chǎn)素、腦啡肽等,并且三者間存在神經(jīng)纖維投射,共同參與維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),在調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌、水鹽平衡、心血管活動(dòng)調(diào)節(jié)、分娩、泌乳和植物神經(jīng)功能中發(fā)揮重要作用。HSP70是反映細(xì)胞生理狀態(tài)和應(yīng)激能力的重要標(biāo)志,適量增加HSP70的表達(dá)對隨后機(jī)體抵御傷害性應(yīng)激原的刺激和組織器官的修復(fù)具有重要作用。在疾病因素或傷害性刺激作用于機(jī)體之前,預(yù)先給予小劑量的適宜刺激,調(diào)動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性應(yīng)激機(jī)制,誘導(dǎo)HSP70及其基因的適量表達(dá),對于減輕隨后病理性應(yīng)激造成的損害程度,維持機(jī)體自身穩(wěn)定性,產(chǎn)生抗病保護(hù)作用具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)選用去卵巢更年期模型,造模技術(shù)成熟,判定標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一,在造模之前一段時(shí)間介入逆針灸關(guān)元穴,觀察其對去卵巢大鼠下丘腦弓狀核、室旁核和視上核等不同核團(tuán)HSP70及基因表達(dá)的干預(yù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組比較,假手術(shù)組、去卵巢模型組、逆灸組、逆針組下丘腦弓狀核、室旁核、視上核HSP70及HSP70mRNA表達(dá)均升高,提示手術(shù)作為一種外源性應(yīng)激原刺激機(jī)體,機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),HSP70及HSP70mRNA相應(yīng)升高;與假手術(shù)組比較,去卵巢模型組、逆灸組、逆針組3組升高幅度更為明顯,這與3組去卵巢引起雌激素的驟然下降,導(dǎo)致內(nèi)源性內(nèi)分泌系統(tǒng)的紊亂密切相關(guān);與去卵巢模型組比較,逆灸組、逆針組弓狀核HSP70mRNA、室旁核、視上核HSP70及HSP70mRNA表達(dá)呈下降趨勢,其中逆灸組、逆針組弓狀核HSP70mRNA顯著下降(P<0.01),提示在去卵巢之前經(jīng)過逆灸、逆針處理,預(yù)先在相應(yīng)的腧穴上給予適宜的針灸刺激,使機(jī)體產(chǎn)生適度的應(yīng)激,啟動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制,對潛隱性的功能紊亂