聚多巴胺納米銀修飾鈦表面的制備及表征

聚多巴胺納米銀修飾鈦表面的制備及表征

作為骨齒科硬組織的替代品，鈦及其合金作為骨齒科硬組織的替代品，在體內被細菌感染的原因之一是移植失敗。納米銀因其極大的比表面積,較強的滲透性等特點成為抗菌材料的研究熱點。然而,鑒于納米銀潛在的細胞毒性,提高納米銀修飾鈦表面的細胞相容性和成骨活性具有重要意義。類生物組織膜的構建可以使材料避開免疫排斥反應和巨噬細胞的攻擊,提高材料的生物相容性,此外,表面的活性識別位點可供細胞和分子產生特異性響應。Qu等通過溶膠–凝膠法在鈦表面制得含納米銀的類骨羥基磷灰石涂層,Giglio等通過電聚合將水凝膠仿生涂層引入鈦表面,然后浸入到納米銀的懸浮液中得到納米銀/水凝膠復合涂層,兩者結果均證明復合涂層具有較高的抗菌率的同時具有良好的生物活性。目前,仿貽貝粘連蛋白的聚多巴胺(PDA)因其具有極強的粘附性,能夠在各種基質上自聚成膜,提高材料表面親水性和生物相容性等特點而廣泛用于生物材料表面修飾。Xu等還證實聚多巴胺能夠顯著增強活性陶瓷的生物活性,有利于成骨細胞的增殖、分化和基因表達。此外,聚多巴胺具有一定的還原性,能夠實現材料表面的無電金屬化,如Ball等將聚多巴胺改性后的聚苯乙烯培養(yǎng)皿浸入硝酸銀溶液中,表面得到納米銀層,證實其具有良好的抗菌性能。本研究利用多巴胺自聚合在鈦表面構建出仿生聚多巴胺層,測試了聚多巴胺層的體外生物活性;利用聚多巴胺的金屬離子絡合作用和還原能力,在鈦表面制備出聚多巴胺/納米銀復合膜層,并對其進行體外抗菌性能和細胞相容性研究,旨在得到兼具良好生物活性和抗菌性能的鈦基植入材料。1實驗方法1.1聚多肽修飾鈦ti-pda的制備醫(yī)用純鈦片用HNO3/HF溶液預處理后浸入60℃piranha溶液(VH2SO4:VH2O2=7:3)中反應30min(將制得的鈦樣品命名為pTi),后將其浸入到pH為8.5,濃度為2g/L的鹽酸多巴胺溶液中振蕩反應24h,用去離子水超聲10min,烘干,得到聚多巴胺修飾鈦(Ti-PDA),以HNO3/HF酸處理鈦(Ti)為實驗對照樣。為了檢驗聚多巴胺修飾鈦樣品的體外生物活性,采用日本Kukob等的配方配制模擬體液,37℃條件下將聚多巴胺修飾前后的鈦樣品恒溫振蕩礦化5d,每天換液,干燥備用。1.2聚多肽/納米銀的修飾鈦將實驗1.1中制得的Ti-PDA樣品浸入到20mmol/L的硝酸銀溶液中反應1h,后用去離子水反復清洗,氮氣吹干,得到聚多巴胺/納米銀修飾鈦樣品(Ti-PDA-Ag)。為了檢驗納米銀修飾鈦表面銀離子的釋放,將1cm2大小的Ti-PDA-Ag樣品浸入到去離子水中,37℃恒溫振蕩一定時間(6h、12h、1d、2d、3d、5d)后,更換去離子水,通過石墨爐原子吸收光譜儀(Z-5000,Hitachi,Japan)測定更換液中的Ag+濃度,平行3次測量。1.3成分3、3采用荷蘭FEI公司NovaNanoSEM430掃描電鏡觀察樣品表面的微觀形貌;通過德國Zeiss公司的DIGIDROP型接觸角測定儀測試樣品表面親水性測量溫度為25℃,平行測量5次;采用德國Bruker公司Vector33型傅里葉變換衰減全反射紅外光譜儀分析礦化后樣品表面的沉積物,分辨率為4cm-1;采用美國Thermo公司ESCALAB250型光電子能譜儀分析樣品表面化學組成,以單色AlKα射線(15kV150W,hν=1486.6eV)進行測定,用C1s結合能(284.8eV)為標準進行能量校正;樣品表面的拉曼光譜通過法國HJY公司的LabRAMAramis型顯微激光拉曼光譜儀(λ=532nm)進行分析。1.4細菌觀察和掃描電鏡以金黃色葡萄球菌(ATCC25923)為試驗株檢驗鈦表面的抗菌性能,操作如下:將uf0661cm的鈦樣品置于48孔培養(yǎng)皿中,用無菌移液管移取1mL金黃色葡萄球菌菌懸液(106CFU/mL)于樣品表面,在37℃生化培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24h后,利用倒平板法計算菌落總數,以Ti為對照組,殺菌率(R%)按下式進行計算:樣品表面細菌粘附實驗操作如下:按照上述步驟將共培養(yǎng)6h的樣品浸泡到無菌PBS溶液(pH=7.4)中洗去未粘附的細菌,戊二醛固定,PBS清洗后用梯度濃度的乙醇脫水,CO2臨界點干燥后噴金置于掃描電鏡(NovaNanoSEM430,FEI,Netherlands)下觀察。1.5材料體外表面形態(tài)觀察將Ti、pTi、Ti-PDA和Ti-PDA-Ag四組樣品分別置于48孔培養(yǎng)板中,移取500μL小鼠MC3T3-E1(ATCCCRL-2593)細胞懸液以2×104cells/mL濃度接種到48孔板中,置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)12h,按照實驗1.4中方法固定、脫水、干燥,置于電鏡下觀察材料表面細胞的粘附。四組樣品按照上述步驟培養(yǎng)1d、3d、5d和7d后,吸棄舊培養(yǎng)基,PBS清洗后每孔加入300μL新鮮培養(yǎng)基和30μL溴化-3-(4,5-2甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑(MTT)溶液,孵育3h后輕輕吹打混勻,用酶標儀(MultiskanFC,ThermoScientific,America)在490nm波長下測定OD值,以樣品Ti作為對照樣。采用SPSS15.0統(tǒng)計學軟件對四組樣品的吸光度值進行處理。2結果與討論2.1聚多巴胺的表征研究表明,羥基化表面因其可以與聚多巴胺中的鄰苯二酚基團發(fā)生脫水形成雙齒類配位體,增強聚多巴胺在表面的粘附。本研究通過piranha溶液處理酸洗鈦表面,一方面活化鈦表面使其富含羥基,另一方面使鈦表面納米結構化,增強聚多巴胺層的結合力。圖1是聚多巴胺接枝前后鈦表面的微觀形貌和水的接觸角對比分析。HNO3/HF酸處理后鈦表面為亞微米臺階形貌,臺階邊緣高度約為0.2~1μm,表面均勻分布HF刻蝕形成的納米突起;piranha氧化處理后(圖1(b)),材料表面形成以納米針結構為特征的不規(guī)則網絡形貌;多巴胺發(fā)生自聚合后,在納米網結構的鈦表面構建出均勻顆粒狀的仿生PDA膜層。Zhang等已證實多巴胺在堿性條件下先經過一系列復雜的環(huán)化、氧化作用和分子內重排反應,形成聚多巴胺的納米顆粒,溶液中的聚多巴胺納米顆粒吸附在材料表面,形成聚多巴胺單分子層。由此可以推斷,Ti-PDA表面的納米顆粒為聚多巴胺。固體材料表面的親水性與其表面形貌和成分密切相關,由圖1(d)可知,piranha溶液處理后,鈦表面的水接觸角由未處理樣的(97.5°±3.0°)減小到(13.3°±4.4°),這是因為piranha氧化液可在鈦表面形成一層富含Ti–OH基團的非晶態(tài)TiO2,導致親水性和表面自由能顯著增加;聚多巴胺修飾后,鈦表面水接觸角為(66.9°±2.9°),一方面證實了聚多巴胺因含有大量的酚羥基和含氮基團而具有親水性,另一方面水接觸角的變化間接證實聚多巴胺層均勻覆蓋在納米結構化鈦表面。目前多巴胺自聚合形成的聚多巴胺薄膜的精細結構尚不清楚,但普遍認為其分子末端含豐富的酚羥基和醌基,能夠在礦化液環(huán)境中吸附Ca2+形成不可逆的有機金屬絡合物,其進一步吸附溶液中的PO43-,使羥基磷灰石牢固沉積在聚多巴胺薄膜表面,體現良好的生物活性。Ryu等利用超聲和剝離實驗證實,聚多巴胺仿生沉積的羥基磷灰石涂層具有較強的結合力。圖2是酸處理鈦、納米結構化鈦及聚多巴胺自組裝鈦表面礦化5d后的電鏡照片和紅外結果。由圖可知,相較Ti,pTi和Ti-PDA表面均有白色沉淀物沉積,且pTi表面為不規(guī)則的絮狀團聚物,沒有特定形貌,Ca/P為1.1,可能為磷灰石的初期形核物;Ti-PDA樣品表面的沉積物呈半球狀,且表面為片狀形貌,為典型的類骨磷灰石形貌,Ca/P為1.4,接近人體骨中的比值。圖2(d)為pTi和Ti-PDA樣品礦化5d后的紅外圖譜。其中574cm-1和602cm-1附近是PO43-的P-O鍵的彎曲振動引起的吸收峰;1032cm-1附近的吸收譜歸屬于PO43-;626cm-1、1620cm-1和3350cm-1附近的吸收峰是OH-的特征譜帶,這些特征譜帶進一步證實了礦化后得到的產物為羥基磷灰石(HA),且1032cm-1附近的吸收峰較寬,沒有分裂為多個峰,說明沉積的是無定型HA。從紅外圖譜中還可以看出產物中基本不含其他雜質離子,但是在873cm-1和1400~1500cm-1出現CO32-特征譜帶,且1400~1500cm-1分裂成兩個吸收峰,它區(qū)別于碳酸鹽的單峰,是CO32-進入磷灰石結構的重要標志,說明本研究礦化形成的HA中的部分PO43-被CO32-取代。已有研究證實,自然骨中磷灰石呈針狀納米晶體結構,含以碳酸根為主的無機離子,因此仿自然骨的含碳酸根的羥基磷灰石的沉積體現了聚多巴胺修飾鈦表面良好的成骨活性。2.2聚料/納米銀復合膜層的生物活性納米銀含量、形狀及尺寸等對材料的抗菌性能有著重要的影響,Castanon等證明,較小粒徑的納米銀具有更強的殺菌能力,其原因是小粒徑的納米銀比表面積更大,更容易穿透細菌的細胞壁。圖3(a)為Ti-PDA-Ag表面的SEM照片及利用ImageJ圖像軟件統(tǒng)計的該表面納米銀顆粒的粒徑結果。研究結果表明,納米銀呈球形顆粒狀,尺寸均勻,平均粒徑為(16.4±2.6)nm。圖3(b)的XPS顯示,XPS寬譜中400eV左右出現一個較強的N1s峰,歸屬于PDA,XPS定量結果計算其表面O/C比值為0.32與PDA結構理論值0.25較為接近,說明PDA成功自聚合在納米結構化鈦表面。結合能約為370eV處有兩個很強的Ag3d峰,分別對應Ag03d5/2(368.0eV)和Ag03d3/2(374.0eV),說明納米銀沉積在Ti-PDA表面,且以銀單質形式存在,證明聚多巴胺層具有一定的還原性。XPS定量結果顯示銀元素所占的原子百分比含量為0.37%,說明鈦表面仍富含大量的酚羥基和醌基等活性基團,且Saidin等證實,聚多巴胺固定納米銀顆粒之后(銀元素所占原子百分比為0.2%),仍能較好地誘導羥基磷灰石在其表面沉積,因此可以推測,本研究得到聚多巴胺/納米銀復合膜層將具有較好的生物活性。納米銀顆粒具有表面增強拉曼散射(SERS)特性,且納米銀粒子的大小、形狀等對材料表面SERS影響顯著。由拉曼光譜(圖3(c))可知,聚多巴胺修飾鈦表面在1300~1600cm-1出現一個寬峰,峰強較弱,來源于聚多巴胺結構中苯環(huán)的伸縮振動(1325cm-1)和變形振動(1590cm-1)。Ti-PDA-Ag表面1300~1600cm-1范圍內出現較多精細強峰,且峰強度為Ti-PDA樣品峰強度的10倍以上,說明納米銀負載在Ti-PDA樣品表面。聚多巴胺輔助還原得到的納米銀與聚多巴胺中的酚羥基和醌基等存在較強的金屬螯合作用,具有較強結合力,因此本研究不考慮銀離子釋放過程中納米銀的脫落。圖3(d)為Ti-PDA-Ag樣品Ag+累積釋放量與浸泡時間的關系圖,結果表明,釋放初期(2d),銀離子釋放顯著,后趨于穩(wěn)定;由原子吸收光譜測定出Ti-PDA-Ag樣品在13%的HNO3溶液浸泡16h后,其表面的總載銀量為(7.1±0.9)uf06dg/cm2,說明釋放5d后溶出的銀約占總載銀量質量分數的14%,可以預見,納米銀修飾的鈦表面具有持久的抗菌性能。2.3納米銀的抗菌作用機理已有研究表明,聚多巴胺結構中存在的苯酚類物質能夠抑制有害細菌的繁殖與生長,但其抗菌作用遠遠達不到常規(guī)的抗菌要求。圖4為不同樣品的殺菌率結果照片,研究結果表明,納米結構化和聚多巴胺修飾鈦表面對金黃色葡萄球菌沒有明顯的抗菌作用,由公式(1)計算得到的殺菌率分別為2.4%和12.3%;聚多巴胺/納米銀修飾鈦表面具有較強的殺菌作用,抑菌率達到99.9%。目前普遍認為納米銀之所以具有抗菌作用一方面是因為其釋放銀離子,其抗菌機理與銀離子類似;另一方面納米粒子本身能夠引起細胞膜的完整性或滲透屏障的破壞,導致胞內物質流失,從而殺滅細菌。納米銀具有長效抗菌作用則源于其釋放的銀離子在殺滅細菌后,可以從死亡的細菌體中游離出來,再與其他菌群接觸,周而復始進行殺菌過程。細菌在種植體表面的粘附是種植體周圍炎發(fā)生發(fā)展的起始,破壞細菌在種植體表面的粘附可以有效地減少細菌在種植體表面的聚集,從而增加種植體的成功率。電鏡結果(圖5)顯示,Ti、pTi和Ti-PDA樣品表面粘附的細菌數量無明顯差異,三者樣品表面部分細菌聚集成團,容易形成生物膜,細菌在生物膜的