PCR與親子刑事鑒定

InventedbyK.Mullisinthe1980s

(NobelPrize)PolymeraseChainReaction,PCR聚合酶連鎖反應(yīng),PCR10/1/2023PCRallowsyoutoamplifyDNACanamplifyspecificgeneCanamplifyuptoabillion-fold!PartofthenucleotidesequencemustbeknownPCR:Purpose10/1/2023DNAtemplate(doublestranded)primers(singlestrandedDNA)DNApolymerasenucleotides(A,C,G,T)thermocyclerPCR:Requirements10/1/2023Thermocycler-controlledtemperature

-controlledrateoftemperaturechangePCR:Requirements10/1/2023Step1:SeparatethetwostrandsofDNAtemplateusuallyaround95CStep2:Cooltolettheprimersbindtothetemplatestrandsusuallyaround40to60CStep3:DNApolymeraseextendstheprimerstwonewcomplementaryDNAstrandssynthesized

usuallyaround72CPCR:3steps10/1/2023Taqpolymerase

Needheat-stableDNApolymerase:

Taqpolymerase

fromathermophilic(heat-loving)bacterianotinactivatedbyrepeatedheattreatmentsofPCRstep110/1/2023CyclesofPCR:10/1/2023◎Avoidcontamination◎Component dH2O 10XPCRbuffer dNTP senseprimer antisenseprimer TaqDNApolymerasePolymeraseChainReaction,PCR10/1/2023◎Negativecontrol/Positivecontrol/Exp.◎DetectPCRproducts EtBrstainedagarosegelelectrophoresis Southernblot◎Optimization enzyme dNTP Mg2+ Temp.ofannealing,extensionanddenaturation cycleno. primersPolymeraseChainReaction,PCR10/1/202310/1/202310/1/202310/1/2023Ifeachcycletakesabout5minutes,howmanycopiescanyoumakeinanhour?Answer:212PCR:Amplification10/1/2023MedicaldiagnosticsviralRNAorDNADNAfingerprintingForensics(legalscience)crimespaternitytestingEvolutionarystudiesHumanGenomeProjectPCR:Applications10/1/2023PCR:ApplicationsInfectiousdiseasesHepatitisvirus(HBV,HCV)Humanimmunodeficiencyvirus(HIV)10/1/2023PCR:Viraldetection10/1/2023DNA指紋親子/刑事鑑定10/1/2023前言自１９６０年代後期，蛋白質(zhì)的多型性已被用來(lái)偵測(cè)個(gè)體之間的遺傳差異。使用這些蛋白質(zhì)標(biāo)誌最主要的問(wèn)題是這些標(biāo)誌因其有限的變異性，故有使用上的極限。當(dāng)這些蛋白質(zhì)標(biāo)誌被用在法醫(yī)學(xué)上的判斷時(shí)，主要是用以排除某位疑犯的可能性，而非確認(rèn)其有犯罪。因?yàn)?，確認(rèn)二個(gè)檢體相異的機(jī)率遠(yuǎn)高於確認(rèn)二個(gè)檢體是來(lái)自同一個(gè)人的機(jī)率。10/1/2023衛(wèi)星DNA重複序列DNA微衛(wèi)星體迷你衛(wèi)星體巨衛(wèi)星體10/1/2023圖１１－１10/1/2023重複序列DNA二種主要重複序列DNA已被鑑定：１縱排重複序列的衛(wèi)星DNA約佔(zhàn)人類基因體的１０％２散佈性重複序列DNA約佔(zhàn)人類基因體的５～２０％衛(wèi)星DNA只存於真核生物，功能是在減數(shù)分裂時(shí)，染色體可經(jīng)由這些同源互補(bǔ)的序列，配對(duì)在一起以及造成DNA重組的位置。變數(shù)縱排重複序列依長(zhǎng)度分為：微衛(wèi)星體(microsatellite)、迷你衛(wèi)星體(minisatellites)、巨衛(wèi)星體(macrosatellite)。10/1/2023表１１－１10/1/2023微衛(wèi)星體微衛(wèi)星體是簡(jiǎn)單重複序列或短縱向重複片段(STR)，在個(gè)體間存在著極大重複次數(shù)的差異。FBI就是利用13組充分了解的短縱向重複片段來(lái)進(jìn)行DNA指紋圖譜鑑定?，F(xiàn)今短縱向重複片段檢測(cè)幾乎已包含在所有法醫(yī)學(xué)的檢測(cè)當(dāng)中。10/1/2023迷你衛(wèi)星體迷你衛(wèi)星基因座共計(jì)約數(shù)千個(gè)，每個(gè)基因座有一明顯的重複單位。這些序列被使用發(fā)現(xiàn)散佈在整個(gè)基因體的迷你衛(wèi)星體長(zhǎng)度多型性，用於產(chǎn)生DNA指紋。10/1/2023巨衛(wèi)星體這些DNA序列是非常大的，長(zhǎng)度約百萬(wàn)氮鹼基，其長(zhǎng)度使這些DNAs易被破壞或斷裂，因?yàn)榇缶植糠ㄡt(yī)學(xué)檢體之DNA都有斷裂的現(xiàn)象，因些巨衛(wèi)星體不能在法醫(yī)工作中使用。10/1/2023圖１１－２10/1/2023圖１１－３10/1/2023圖１１－４10/1/2023單一基因座微衛(wèi)星體之

變數(shù)縱排重複序列現(xiàn)今大多用聚合酶連鎖反應(yīng)(PCR)來(lái)分析變數(shù)縱排重複序列圖譜。為了要產(chǎn)生帶有一個(gè)多基因座探針的差異性圖譜，至少需四或五個(gè)單一基因座PCR引子被使用。10/1/2023圖１１－５10/1/2023圖１１－６10/1/2023表１１－１10/1/2023限制片段長(zhǎng)度多形性假設(shè)對(duì)偶基因?yàn)楫悤r(shí)，稱該基因?yàn)楫愋秃献?heterozygous)。有時(shí)變異會(huì)影響限制酶切割的部位，即原有的切割序列，因?yàn)樽儺惗?，或新的限制酶切割位置可能產(chǎn)生。因此基於序列上的不同而導(dǎo)致有不同的切割點(diǎn)，造成不同大小的限制酶切割片斷，即稱限制片段長(zhǎng)度多形性RFLPs(restrictionfragmentlengthpolymorphisms)。10/1/2023限制酶片段長(zhǎng)度多形性RFLPMethodofRFLPAnalysis1.DNAExtraction2.DigestionofDNAwitharestrictionendonuclease10/1/2023RFLP(續(xù))3.AgaroseGelElectrophoresis4.PreparationofaSouthernBlot10/1/20235.HybridizationwithaSingle-LocusProbe6.DetectionofRFLPsviaautoradiographyRFLP(續(xù))10/1/20237.Re-probesouthernblotwithadditionalprobesThesetofAutoradssoobtainedisknownasa"DNAProfile."RFLP(續(xù))10/1/2023圖１１－７10/1/2023圖１１－８10/1/2023圖１１－９10/1/2023聚合酶連鎖反應(yīng)PCR的極端靈敏度使交叉污染成為一個(gè)非常嚴(yán)重的問(wèn)題。極微小量的污染DNA，可能來(lái)自組織、液體、細(xì)菌和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。在某些條件下，法院收集樣品時(shí)易造成交叉污染。污染的附加條帶將會(huì)是可見且可能混淆、毀壞結(jié)果的。因此小心選擇適當(dāng)?shù)牟僮鳁l件及步驟、使用污染防治控制，將使報(bào)告書中的交叉污染被識(shí)別出來(lái)。10/1/2023圖１１－１０10/1/2023單一核苷酸多形性可應(yīng)用於：在族群中基因型的變異是如何對(duì)疾病表現(xiàn)型造成差異、生態(tài)研究的應(yīng)用、演化生物學(xué)、利用生物資訊學(xué)中資訊探索分析而發(fā)展的單一核苷酸多形性資料庫(kù)、藥物基因體學(xué)。10/1/2023粒線體DNA及Y染色體由粒線體DNA的資料顯示，所有不同的粒線體DNA序列在171,500年前都?xì)w屬於同一個(gè)原始女性，這個(gè)拼湊而成的♀被稱為「粒線體的夏娃」。代表男性的Ｙ染色體記錄了父系遺傳的演化史，如同「粒線體的夏娃」般，Ｙ染色體亞當(dāng)也可以追溯到35,000~90,000年前的某個(gè)原始人男性。10/1/2023PCR-RFLP10/1/2023PCR-RFLP之應(yīng)用10/1/2023親子鑑定RFLP10/1/2023ChildMolestationEvidenceInthiscasethedefendantwaschargedwithassaultinghisgirlfriend'syoungson.Theevidencewasasemenstainonthechild'sperson.Comparisonsweremadewith5differentRFLPprobes.Twoareshownbelow.Thedefendant'sreferenceprofilematchedtheevidenceforeachprobe.Thedefendantcouldnotbeexcludedasasourceoftheevidence,andeventuallyagreedtoapleabargain.10/1/2023Inthisstudy,10victimsofsexualassaultwhobecamepregnantshortlythereaftertookpartinacontrolledstudy(Hammondetal,JAMA273,1774,(1995).Priortotesting,theywereinterviewedaboutcontinuingthepregnancy.Allwomenhadaconsensualpartnerwhowasalsoapot