見血封喉種子中強(qiáng)心苷類化學(xué)成分研究

見血封喉種子中強(qiáng)心苷類化學(xué)成分研究

銀杏葉是世界上最有毒的木本植物之一。見血封喉屬植物全世界約有4種3變種,主要分布于東南亞;我國(guó)僅產(chǎn)1種,即見血封喉,分布于海南、云南、廣東和廣西等地,已被列為國(guó)家三級(jí)珍稀保護(hù)植物。其味苦、性溫,乳汁入藥用于泄瀉、催吐、強(qiáng)心,還可用作麻醉劑;種子入藥解熱止瀉,用于治療痢疾。其乳汁和種子中的主要成分為強(qiáng)心苷,根皮富含黃酮類化合物,樹葉中含有降倍半萜、黃酮類化合物,莖干中含有木脂素。近年來本課題組從見血封喉乳汁中分離得到一系列新的強(qiáng)心苷類化合物,并發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。目前國(guó)內(nèi)尚未報(bào)道見血封喉種子的化學(xué)成分及其細(xì)胞毒活性的研究,本文對(duì)海南產(chǎn)見血封喉種子的乙醇提取物進(jìn)行了化學(xué)成分研究,報(bào)道其分離方法和結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果。1材料和方法1.1種子和標(biāo)本采集見血封喉(Antiaristoxicaria(Pers.)Lesch.)種子于2009年5月采自海南省陵水縣,經(jīng)中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所王祝年副研究員鑒定,憑證標(biāo)本(AN2000905)存放于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。1.2儀器、試藥與儀器北京泰克X-5型顯微熔點(diǎn)儀(溫度未校正);APIQSTARPulsar質(zhì)譜儀;BruckerAV-400型超導(dǎo)核磁儀(TMS為內(nèi)標(biāo));RudolphAutopolⅢ旋光儀;CO2培養(yǎng)箱(SheldonManufacturingInc.);超凈工作臺(tái)(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);MK3酶標(biāo)儀(上海雷勃分析有限公司)。柱層析硅膠(200～300目)和薄層層析硅膠(青島海洋化工廠),SephadexLH-20(Merck公司)。四甲基偶氮唑鹽(MTT)、RPMI1640培養(yǎng)基和平衡鹽溶液PBS(北京欣經(jīng)科公司);絲裂霉素C(KyowaHakkoKogyoCo.Ltd.),DMSO為分析純。1.3c組的洗脫和重復(fù)合成的合成見血封喉種子曬干后加工成粗粉(25.9kg),用95%乙醇浸提3次,每次50L;減壓濃縮至無乙醇味后得粗浸膏,粗浸膏分散于水中成為懸濁液,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到石油醚部分(181.5g)、乙酸乙酯部分(39.5g)和正丁醇部分(169.0g)。乙酸乙酯部分(39.5g)經(jīng)減壓硅膠柱層析,以氯仿-甲醇(100:1～0:1)梯度洗脫,得到10個(gè)組分(Fr.1～Fr.10)。Fr.5(3.7g)經(jīng)硅膠柱層析,以石油醚-丙酮(4:1～0:1)梯度洗脫,再經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析,以氯仿-甲醇(30:1)洗脫得到化合物1(17.1mg)和4(42.8mg);Fr.6(2.7g)經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析,以氯仿-甲醇(20:1)洗脫得到化合物6(36.6mg);Fr.8(4.4g)經(jīng)硅膠柱層析,以氯仿-甲醇(20:1)洗脫得到12個(gè)流分(Fr.8.1～Fr.8.12);Fr.8.7(925.2mg)經(jīng)硅膠柱層析,以氯仿-甲醇(15:1～8:1)洗脫得到化合物3(14.0mg);Fr.8.8(1.1g)經(jīng)硅膠柱層析,以氯仿-甲醇(15:1)洗脫得到化合物7(10.4mg),Fr.8.9(47.5mg)依次經(jīng)硅膠柱層析(氯仿-甲醇20:1)和SephadexLH-20(氯仿-甲醇1:1)得到化合物5(97.1mg),Fr.9(1.1g)經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析(氯仿-甲醇10:1)得到化合物2(26.3mg)(圖1)。1.4生長(zhǎng)抑制率測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中ml-1的檢測(cè)采用MTT法。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照組(DMSO溶劑)、陽性對(duì)照組(絲裂霉素C)和6個(gè)不同濃度(0.1、0.3、0.9、2.7、8.1和24.3μgmL-1)的待測(cè)樣品,IC50值<0.1μgmL-1的待測(cè)樣品繼續(xù)往下稀釋,再設(shè)6個(gè)不同濃度(0.0003、0.001、0.004、0.011、0.033和0.100μgmL-1),每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,用RPMI1640完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸浮液,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),按50000個(gè)mL-1接種90μL于96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板,置于5%CO2、濕度90%以上、37℃溫箱中培養(yǎng)。在K562細(xì)胞中直接加入待測(cè)樣品10μL,而SMMC-7721和SGC-7901培養(yǎng)24h后加入待測(cè)樣品10μL,繼續(xù)培養(yǎng)72h后取出,置于顯微鏡下觀察每孔細(xì)胞形態(tài)。然后每孔加入5mgmL-1的MTT溶液(溶于平衡鹽溶液PBS)15μL,37℃反應(yīng)4h后,吸棄上清液,再向各孔加入100μLDMSO,充分溶解,將細(xì)胞培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀上,用490nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光度(A),計(jì)算生長(zhǎng)抑制率:生長(zhǎng)抑制率(%)]=[1-(用藥組平均A值/陰性對(duì)照組平均A值)]×100%。以樣品濃度為橫坐標(biāo),以抑制率為縱坐標(biāo),根據(jù)濃度梯度利用origin軟件擬合出抑制率的曲線圖。當(dāng)抑制率為50%時(shí)的樣品濃度即是細(xì)胞毒活性的IC50值,樣品活性結(jié)果即以半數(shù)抑制濃度(IC50)表示。1.5化合物3藥物成分鑒定杠柳苷元(Periplogenin,1)白色粉末,C23H34O5(390);[α]26DD26+27(c0.7,Acetone);1HNMR(400MHz,Acetone-d6):δ5.87(1H,s,H-22),5.01(1H,dd,J=18.2,1.7Hz,H-21a),4.85(1H,dd,J=18.5,1.7Hz,H-21b),4.12(1H,brs,H-3),0.92(3H,s,H-19),0.90(3H,s,H-18);13C-NMR(100MHz,Acetone-d6)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致,故鑒定為杠柳苷元。見血封喉阿洛糖苷(Antialloside,2)白色粉末,C29H42O11(566);[α]26DD26+4.2(c0.9,MeOH);1HNMR(400MHz,CD3OD):δ10.02(1H,s,H-19),5.90(1H,s,H-22),4.94(1H,dd,J=18.2,1.6Hz,H-21a),4.91(1H,dd,J=18.5,1.6Hz,H-21b),4.69(1H,d,J=8.1Hz,H-1′),4.15(1H,brs,H-3),4.00(1H,t,J=2.9Hz,H-3′),3.71(1H,m,H-5′),3.29(1H,dd,J=8.0,3.0Hz,H-2′),3.16(1H,dd,J=9.2,2.8Hz,H-4′),1.23(3H,d,J=6.2Hz,H-6′),0.76(3H,s,H-18);13CNMR(100MHz,CD3OD)數(shù)據(jù)歸屬見表1?；衔?是由Antiarigenin苷元和6-deoxy-β-D-allose(6-去氧-β-D-阿洛糖)組成,故鑒定為見血封喉阿洛糖苷。見血封喉去氧阿洛糖苷(Antiogoside,3)白色粉末,C29H44O10(553);[α]26DD26-3.1(c1.1,MeOH);1HNMR(400MHz,CD3OD):δ5.91(1H,s,H-22),4.96(1H,dd,J=18.2,1.6Hz,H-21a),4.93(1H,dd,J=18.5,1.6Hz,H-21b),4.70(1H,d,J=8.0Hz,H-1′),4.15(1H,brs,H-3),4.02(1H,t,J=2.9Hz,H-3′),3.72(1H,m,H-5′),3.29(1H,dd,J=8.0,3.1Hz,H-2′),3.16(1H,dd,J=9.5,2.8Hz,H-4′),1.23(3H,d,J=6.0Hz,H-6′),0.94(3H,s,H-19),0.79(3H,s,H-18);13CNMR(100MHz,CD3OD)數(shù)據(jù)歸屬見表1。由苷元Antiogenin和單糖6-deoxy-β-D-allose(6-去氧-β-D-阿洛糖)組成,故鑒定為見血封喉去氧阿洛糖苷。毒毛旋花子苷元(Strophanthidin,4)白色固體,C23H32O6(404);[α]26DD26+43.1(c0.8,MeOH);1HNMR(400MHz,CD3-OD):δ10.03(1H,s,H-19),5.87(1H,s,H-22),5.00(1H,dd,J=18.4,1.8Hz,H-21a),4.88(1H,dd,J=18.4,1.8Hz,H-21b),4.11(1H,brs,H-3),0.82(3H,s,H-18);13CNMR(100MHz,CD3OD)數(shù)據(jù)歸屬見表1,波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致,故鑒定為毒毛旋花子苷元。毒毛旋花子阿洛糖苷(Strophalloside,5)白色粉末,C29H42O10(550),[α]26DD26+5.2(c1.1,MeOH);1HNMR(400MHz,CD3OD):δ10.06(1H,s,H-19),5.91(1H,s,H-22),5.04(1H,dd,J=18.4,1.8Hz,H-21a),4.92(1H,dd,J=18.4,1.8Hz,H-21b),4.71(1H,d,J=8.0Hz,H-1′),4.16(1H,brs,H-3),4.02(1H,t,J=2.9Hz,H-3′),3.73(1H,m,H-5′),3.30(1H,dd,J=8.0,3.0Hz,H-2′),3.17(1H,dd,J=9.2,2.8Hz,H-4′),2.85(1H,m,H-17),1.24(3H,d,J=6.2Hz,H-6′),0.86(3H,s,H-18);13CNMR(100MHz,CD3OD)數(shù)據(jù)歸屬見表1,苷元為Strophanthidin,單糖為6-deoxy-β-D-allose(6-去氧-β-D-阿洛糖),故鑒定為毒毛旋花子阿洛糖苷。毒毛旋花子爪哇糖苷(Strophanthojavoside,6)白色粉末,C30H44O10(564);[α]26DD26+1.2(c1.0,MeOH);1HNMR(400MHz,CD3OD):δ10.06(1H,s,H-19),5.90(1H,s,H-22),5.01(1H,dd,J=18.2,1.8Hz,H-21a),4.94(1H,dd,J=18.5.1.8Hz,H-21b),4.76(1H,d,J=7.9Hz,H-1′),4.26(1H,t,J=2.6Hz,H-3′),4.16(1H,brs,H-3),3.74(1H,m,H-5′),3.35(3H,s,OCH3-2′),3.17(1H,dd,J=9.2,2.8Hz,H-4′),3.04(1H,td,J=7.9,2.6Hz,H-2′),1.23(3H,d,J=6.2Hz,H-6′),0.88(3H,s,H-18);13CNMR(100MHz,CD3OD)數(shù)據(jù)歸屬見表1,苷元為strophanthidin,單糖為6-deoxy-2-O-methyl-β-D-allose(6-去氧-2-O-甲基-β-D-阿洛糖),故鑒定為毒毛旋花子爪哇糖苷。去葡萄糖桂竹香毒苷(Desglucocheirotoxin,7)白色粉末,C29H42O10(550);[α]26DD26+1.3(c1.0,Acetone);1HNMR(400MHz,Acetone-d6):δ10.07(1H,s,H-19),5.86(1H,s,H-22),4.99(1H,dd,J=18.1,1.7Hz,H-21a),4.84(1H,dd,J=18.1,1.7Hz,H-21b),4.67(1H,d,J=7.9Hz,H-1′),4.45(1H,brs,H-3),4.14(1H,t,J=2.9Hz,H-3′),4.04(1H,t,J=3.2Hz,H-4′),3.66(1H,m,H-5′),3.30(1H,dd,J=7.9,3.0Hz,H-2′),1.19(3H,s,H-18),1.07(3H,t,J=6.0Hz,H-6′);13CNMR(100MHz,Acet