不同碳源好氧顆粒污泥的微生物種群及微生物形態(tài)分析

不同碳源好氧顆粒污泥的微生物種群及微生物形態(tài)分析

好氧污泥（ags）作為一種自固定的微生物收集體，具有良好的沉淀性能、高污泥量和抗沖擊負荷等顯著優(yōu)點。由于ags的結構特征和溶解氧的傳質限制，硝化菌、反硝化菌和聚磷菌可在ags中形成相互交織、共同生長的微生態(tài)系統(tǒng)，為單個月內高效的單級sdr實現(xiàn)同步脫氮和去除磷的提供方便[1.4]。胞外多聚物(extracellularpolymericsubstances,EPS)是微生物聚集體(如活性污泥絮凝體、生物膜、顆粒污泥等)的重要組成部分,主要包括多糖、蛋白質、核酸、脂類和腐殖酸等成分.研究者使用特異性熒光染色劑、三位熒光光譜、SDS、釕紅染色-TEM等技術對EPS的組成、分布及其與AGS的形成、穩(wěn)定性的關系進行了探討.但是結合熒光原位雜交技術(fluorescenceinsituhybridization,FISH)和多重熒光染色技術系統(tǒng)全面共同研究EPS和功能菌群對常低溫同步脫氮除磷AGS的形成和穩(wěn)定維持的影響鮮見報道.本試驗以處理實際生活污水實現(xiàn)常低溫穩(wěn)定同步脫氮除磷的AGS為研究對象,利用FISH技術研究AGS中全菌、氨氧化菌、聚磷菌的相對數(shù)量、空間分布及其與AGS同步脫氮除磷的關系;同時采用多重熒光染色技術研究AGS胞外蛋白、α-吡喃葡萄糖、α-甘露糖和β-D-吡喃葡萄糖、脂類;凋亡(活菌、死菌)的相對數(shù)量和空間分布;并結合SEM共同探討同步脫氮除磷AGS形成和穩(wěn)定維持的機制以及生化反應機制.1材料和方法1.1ags的建立和運行試驗所用污泥來源于北京市方莊污水處理廠排放的剩余污泥;試驗用水為北京工業(yè)大學家屬區(qū)排放的實際生活污水,其水質平均值COD為191.37mg/L,PO43--P為6.14mg/L,NH4+-N為58.32mg/L,pH為7.4.在直徑D=180mm,有效高度H=550mm,有效容積為12L的2個SBR反應器(命名為A、B)內培養(yǎng)AGS,曝氣量為0.16m3/h,初始MLSS為2600mg/L左右,反應器共運行254d,第1~165d為夏秋季,水溫為18~27℃,第166~254d為冬季,水溫最低可達9~13℃.由于原水有機物含量過低,從第42d向A中添加丙酸鈉+乙酸鈉,B中添加葡萄糖,設計COD∶N∶P均約為360∶60∶6.反應器的運行方式為進水(2min),厭氧(238min),曝氣(470min),沉淀(1~5min),排水(2min),采用時間程序控制器自動控制各反應段的開關.AGS形成并穩(wěn)定之后,粒徑分布在0.3~1.0mm的范圍內.系統(tǒng)以厭氧/好氧的簡單運行方式能夠實現(xiàn)穩(wěn)定的同步脫氮除磷效果,常溫4個月以及低溫效果恢復之后分別穩(wěn)定運行56d、42d內,出水NH4+-N、TIN和PO43--P均能達到GB18918-2002一級排放標準.本試驗取用AGS樣本為低溫穩(wěn)定運行時期的A、B2個反應器的AGS.1.2熒光原位雜交將A、B中培養(yǎng)獲得的AGS用現(xiàn)配的4%多聚甲醛溶液在4℃固定6~12h,保存在-20℃的PBS+乙醇(1∶1)溶液中;再用蔗糖溶液、OCT包埋劑對樣品分別進行脫水和包埋,之后用冷凍切片機(LeicaCM1850,德國)對樣品進行切片(切片厚度一般為10~20μm);將切片粘在明膠包被過的載玻片上,空氣中干燥后先后浸泡于50%、80%和98%的乙醇溶液中脫水3min.按照標準雜交程序進行熒光原位雜交,所用探針(大連TaKaRa)見表1,熒光染料位置均在5′端,一次探針用量為10μL.雜交完畢后使用熒光顯微鏡(OLYMPUSBX52)或激光共聚焦顯微鏡(OLYMPUS,FV1000)對樣品進行觀察拍照,每個污泥樣品隨機拍攝20~25張照片,用ImageProPlus6.0(MediaCyberneticsInc.)進行定量分析.EUBmix由EUB338、EUB338-Ⅱ、EUB338-Ⅲ按體積比1∶1∶1混合組成.PAOmix為PAO462、PAO651和PAO846按照體積比1∶1∶1混合而成.EUBmix針對全菌;NSO190和NSO1225針對氨氧化菌、PAOmix針對聚磷菌.1.3相關理化性質研究首先用甲醛+氫氧化鈉法對2個反應器中AGS的EPS進行提取,并使用苯酚-硫酸法、考馬斯亮藍法、二苯胺比色法分別對EPS中的多糖、蛋白質以及核酸進行化學定量分析,詳見參考文獻.1.3.1胞膜熒光染料為了對AGS中的活細菌和死細菌進行相對定量和空間分布定位,使用Hoechst33342和PI進行雙重熒光染色.Hoechst33342是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料,對細胞的毒性較低,可以用來染活細胞.PI則是一種常用的細胞核熒光染色劑.它不能透過完整的細胞膜,但能透過凋亡中晚期的細胞和死細胞的膜而將細胞核染紅,與未結合的PI相比,強度增強20~30倍.將好氧周期末端的AGS用1×PBS清洗3遍后,先加入Hoechst33342染色30min,用1×PBS清洗3次后加入PI染色1h,再用1×PBS清洗,-20℃保存.Hoechst33342、PI購自Sigma-Aldrich(上海)貿易有限公司.1.3.2ags凋亡和eps多重染色對AGS的EPS如蛋白質、多糖、脂類等進行熒光染色.FITC是氨基標記熒光染料,本試驗中用FITC來指示胞外蛋白質;ConA則用于α-吡喃葡萄糖和α-甘露糖殘基的染色;Calcofluorwhite用于β-D-吡喃葡萄糖基的染色;Nilered則用于脂類及疏水基團的染色.AGS凋亡和EPS多重染色所用染料其激發(fā)發(fā)射波長、用量和使用濃度見表2.將好氧周期末的AGS用1×PBS清洗3遍后,先加入10μLFITC樣品染色1h,后加入ConA染色30min,再加入Calcofluorwhite染色30min,最后加入Nilered染色10min,每次染色后均要用1×PBS清洗3遍.染色完畢后,-20℃保存.AGS細胞凋亡和EPS多重熒光染色的樣品均用冷凍切片機切片(厚度為20~40μm),再使用激光共聚焦顯微鏡(OLYMPUSFV1000)進行觀察.FITC和ConA購自MolecularProbes公司;Calcofluorwhite和Nilered購自SigmaAldrich(上海)貿易有限公司.1.4模擬離子檢測在好氧周期末取出一定量AGS,清洗后用2.5%新鮮的戊二醛4℃固定2~4h,PBS(0.1mol/L,pH=6.8)清洗3次,1%鋨酸浸泡4~6h,PBS清洗3次,30%、50%、70%、85%、95%乙醇梯度脫水各1次,100%乙醇脫水2次,每次15~20min,乙酸異戊酯置換2次,每次20min,臨界點干燥,離子濺射金,用FEIQUANTA200觀察.2結果與討論2.1ags的生物富集強化功能A、B反應器常低溫同步脫氮除磷AGS的FISH定量分析結果表明,A中AOB占總菌群數(shù)的12.32%(標準偏差SD=1.89%,樣本數(shù)n=7),PAO占總菌群數(shù)的42.56%(標準偏差SD=6.94%,n=7);B中AOB占總菌群數(shù)的14.10%(標準偏差SD=2.05%,n=6),PAO占總菌群數(shù)38.90%(標準偏差SD=4.21%,n=6),2個反應器結果相似.絮狀污泥中AOB所占比例約為2.4%~8.4%[12~14],PAO所占比例約為4%~18%.與此不同的是,Kim等以SBAR處理人工配水培養(yǎng)短程AGS,其AOB所占比例高達64%;Zeng等的研究表明其除磷AGS中PAO所占比例為41%,DNPAO所占比例為38%,與本研究的結果相當.AGS中AOB和PAO的數(shù)量均遠高于絮狀污泥,這也從微生物角度說明為何本研究中AGS可以在常低溫、COD∶N∶P為360∶60∶6的情況下實現(xiàn)優(yōu)良的同步脫氮除磷效果.同時也說明AGS具有優(yōu)良的生物富集強化功能.2個反應器常低溫同步脫氮除磷AGS中EUB、AOB和PAO的空間分布結果類似,以A反應器AGS的FISH結果為例(見圖1),可以看到AGS中的AOB和PAO有各自明顯的層狀分布特征:AOB主要分布在AGS的最外側,在一些大孔隙的周圍也有;右下側的AOB深入顆粒的距離約在80~150μm之間,而右上方由于附近有大的孔洞,AOB最深可達330μm;總體上AOB深入顆粒內部的距離從幾十μm到300μm不等;這與AOB專性好氧菌的特點有關.而PAO主要在AOB內側向顆粒內部生長,基本布滿顆粒內部;顆粒右上方PAO和AOB有部分重合,在此區(qū)域的PAO是好氧PAO,內部的PAO是可以執(zhí)行反硝化功能的DNPAO.AOB和PAO的分布特征與不同菌種的不同生存特性以及運行條件相關.在一個厭氧/好氧反應周期中的好氧段,總氮不斷持續(xù)下降,說明系統(tǒng)在好氧條件下反硝化作用明顯;一般情況下,反硝化作用的必要條件為缺氧環(huán)境,而反應前2h液相主體DO濃度為2~4mg/L,反應后5.5hDO濃度可高達5~7mg/L,因此AGS內部可能存在缺/厭氧區(qū).由于AGS的培養(yǎng)條件不同,研究者應用微氧電極探查到DO擴散的深度亦有所區(qū)別,大多數(shù)研究者均發(fā)現(xiàn)AGS內部存在缺氧區(qū):Kishida等發(fā)現(xiàn)當液態(tài)主體的DO濃度為5.5mg/L時,AGS被DO的穿透深度為100μm;Yilmaz等發(fā)現(xiàn)液相主體的DO濃度高達5~6mg/L時,DO只穿透300~400μm;Lemaire等發(fā)現(xiàn)DO穿透AGS的深度在好氧段的初期和末期基本都是250μm;Chiu等發(fā)現(xiàn)即使液相主體的DO濃度為飽和,以醋酸和酚為底物培養(yǎng)的AGS、大多數(shù)DO消耗在AGS的表層125μm.但是劉邵陽發(fā)現(xiàn)AGS內部沒有缺氧區(qū);Moy等研究發(fā)現(xiàn)即使AGS的直徑>2mm,其內部也沒有缺氧區(qū).與以上研究對比表明,本研究的AGS內部可能存在一定深度的缺/厭氧區(qū)以實現(xiàn)好氧條件下同時脫氮除磷.AOB是絕對好氧的自養(yǎng)菌,分布在AGS的最外側;PAO是兼性異養(yǎng)菌,分布在AGS的內部.AOB的數(shù)量遠小于PAO的數(shù)量,因此硝化是限速步驟(尤其在低溫、低COD∶N∶P條件下),脫氮慢于除磷,除磷2h基本完成,而脫氮需要約7.5h.除磷速度較快的另一個原因是好氧吸磷和反硝化除磷共同作用的結果,處于相對外層的PAO可以進行好氧吸磷,內層的PAO可以進行反硝化除磷;按照Hu等的方法亦證明能以氧和硝酸氮作為電子受體的PAO占總PAO的74.32%;因此AGS中的PAO可以完成好氧吸磷和反硝化吸磷.甚至可以認為,由于溶解氧較高,而聚磷菌本身對溶解氧的要求相對較低,因此才出現(xiàn)本試驗中的AGS中的聚磷菌比其他研究中的要更靠近顆粒內部的結果.本研究AOB的分布特征與其他研究者[24~26]類似,PAO的分布與deKreuk等和Kishida等試驗中PAO既分布在AGS外部,又分布在內部的特點并不完全相同,相同之處是AGS內部的PAO均具有反硝化除磷功能.2.2ags的及其生物活性成分分布情況A、B反應器的AGS細菌凋亡染色結果類似(圖2、圖3),藍色的活細菌數(shù)量較紅色的死細菌數(shù)量稍少,兩者在AGS斷面上的分布都比較均勻,活細菌更多分布在AGS的邊緣以及孔隙周圍;死細菌和活細菌相伴存在,活細菌通常包圍著死細菌.B反應器活細菌數(shù)量比A反應器稍多.EPS的多重熒光染色(圖4、圖5)顯示出與細菌一起構成顆粒的各種EPS的分布情況,A反應器的EPS染色的結果表明:蛋白質(綠色,FITC)含量高于其他幾種物質,且均勻分布在AGS的斷面上,即使在AGS的內部數(shù)量仍然較多,可以認為蛋白質是A反應器中AGS的EPS主要組成部分;α-吡喃葡萄糖、α-甘露糖(紅色,ConA)和脂類(黃色,NileRed)都較均勻地分布在AGS內外,兩者的分布范圍和數(shù)量均差別不大,說明這2類物質生成和分布情況較為類似;β-D-吡喃葡萄糖(藍色,calcofluorwhite)則較為明顯地包布在蛋白質、脂類和α-吡喃葡萄糖、α-甘露糖的外圍.B反應器的EPS多重染色(圖5)呈現(xiàn)出與A反應器不同的特點.其中蛋白質含量高于其他幾種有機物,分布均勻,即使在顆粒的內部仍然有較為明顯的顏色和亮度,可以說明在A、B反應器中蛋白質均是AGS的EPS的主要組成部分;β-D-吡喃葡萄糖仍然明顯包布在蛋白質、脂類和α-吡喃葡萄糖、α-甘露糖的外圍;而在A反應器中區(qū)別不明顯的α-吡喃葡萄糖、α-甘露糖和脂類在B反應器的AGS上呈現(xiàn)了不同的分布情況,α-吡喃葡萄糖、α-甘露糖更多的分布在顆粒的外層,而脂類的數(shù)量相對較少,推測這與B反應器的添加的附加碳源為葡萄糖有一定的關系.使用甲醛+氫氧化鈉法對A、B反應器中的AGS進行EPS提取,并且對多糖、蛋白質、脂類以及核酸進行測量后得到:A反應器中(VSS)的蛋白質平均值為243.67mg/g,多糖平均值為49.35mg/g,核酸平均值為1.24mg/g;B中蛋白質平均值為254.52mg/g,多糖平均值為71.83mg/g,核酸平均值為1.57mg/g.2個反應器AGS的EPS蛋白質含量沒有明顯區(qū)別,而B反應器中EPS多糖則明顯高于A反應器中AGS所含胞外多糖的量,認為與B反應器添加葡萄糖作為外加碳源相關.McSwain等發(fā)現(xiàn)活細菌主要分布在AGS的外側;Adav等的研究發(fā)現(xiàn)處理含酚廢水的AGS,內部主要是死細菌,而活細菌主要分布在顆粒的外側與本研究結果相似;而Chen等發(fā)現(xiàn)處理含酚廢水的AGS,無論死細菌還是活細菌均分布在顆粒的外側;處理醋酸鈉廢水的AGS,死細菌和活細菌都分布均勻,本研究與此不同.添加不同碳源的反應器(A、B)中AGS的EPS均呈現(xiàn)出蛋白質多,分布均勻的情況.McSwain等對多種AGS的EPS成分進行分析后認為蛋白質成分占EPS總量50%以上,且分布在AGS的內核處,是保持AGS穩(wěn)定性的重要原因;Zhang等也認為胞外蛋白質是維持AGS穩(wěn)定的主要原因;Chen等發(fā)現(xiàn)處理含酚廢水的AGS中胞外蛋白質位于其內核處,而處理乙酸鈉廢水的AGS中的胞外蛋白質在AGS內均勻分布.因此,本試驗研究結果可以認為無論以何種碳源培養(yǎng)AGS,分布最廣泛的EPS均為蛋白質.A反應器中以乙酸鈉和丙酸鈉作為附加碳源培養(yǎng)的AGS中α-吡喃葡萄糖和α-甘露糖成分分布較為均勻.B反應器中以葡萄糖作為附加碳源的AGS則呈現(xiàn)出α-吡喃葡萄糖和α-甘露糖存在于顆粒外部的特點,與McSwain等、Chen等和Adav等的試驗結果相似.Chen等和Adav等研究發(fā)現(xiàn)脂類主要分布在AGS的外側,與本研究結果不同.A、B反應器中AGS的β-D-吡喃葡萄糖均大量存在于相對外層位置,AGS內部較少,Chen等發(fā)現(xiàn)處理含酚廢水的AGS,β-D-吡喃葡萄糖在顆粒的內核處;處理醋酸鈉廢水的AGS,β-D-吡喃葡萄糖均勻分布.Adav等對添加了不同的水解酶的AGS進行了EPS染色,結果認為β-D-吡喃葡萄糖對于構建AGS有著非常重要的作用.對比中外研究并結合本試驗研究結果,可以發(fā)現(xiàn),AGS所含的EPS呈現(xiàn)出與碳源相關的特點.AGS中分布最廣泛且數(shù)量最多的EPS是蛋白質;而脂類物質也呈均勻分布狀態(tài),并沒受到碳源等不同條件的影響,但數(shù)量最少;B反應器的多糖高于A反應器中的,且不同的多糖(α-吡喃葡萄糖、α-甘露糖和β-D-吡喃葡萄糖)呈現(xiàn)出不同的分布特點,因此認為EPS中多糖對AGS的形成、穩(wěn)定維持具有直接的聯(lián)系.結合SEM圖(圖6)中2個反應器的球菌和桿菌數(shù)量的差異,認為不同的碳源對AGS的菌種、形成特點、EPS會造成不同的影響,但根據(jù)FISH分析以及2個反應器出水效果結果可以認為不同的菌種以及有機物,主要是多糖的不同對于AGS本身的去除能力沒有明顯影響,但是2個反應器中AGS在同樣的運行條件下,污泥濃度卻始終有所區(qū)別,不同反應器對抗低溫的能力以及恢復也存在差異,因此認為在同樣的簡單運行模式下丙酸鈉+乙酸鈉的外加碳源模式更有利于AGS的培養(yǎng)和馴化,污泥生長較快,去除速度以及對抗外部條件改變的能力也就越強.本實驗結果與文獻不同的原因可能源自顆粒的不同(底物、培養(yǎng)條件等),因此顆粒內部結構亦有重大差異.2.3ags的組織組成主要由細菌和菌圖6為2個反應器AGS的SEM圖.2個反應器雖然添加了不同的碳源,但仍然是以生活污水為主要底物,在這種條件下,除了進行污水處理的細菌之外,存在相當多的原后生動物,如鐘蟲、累枝蟲和纖毛蟲等,這說明在這種進水中有毒有害的物質較少,大量的原后生動物位于AGS的表層,與大量細菌以及產生的EPS共同構成了AGS.A反應器中AGS的表面細菌以桿菌為主,結合非常緊密,致使整個顆粒結構緊湊.B反應器的AGS表面主要細菌包括大量球菌.桿菌和球菌的不同分布特點與進水碳源類型相關,葡萄糖有利于球菌的生長而乙酸丙酸類物質則有利于桿菌的生長,不同的菌種也會產生不同的EPS.而2種顆粒表面同時存在大量的孔洞,認為這樣的結構有利于養(yǎng)分和氧氣進入AGS內部,對AGS的整體活性提供外部條件.Weber等認為纖毛蟲在顆粒形成過程中起到非常重要的作用.本試驗中培養(yǎng)的AGS外部同樣存在大量的纖毛蟲等原后生動物,外部由纖毛蟲和細菌組成較松散的結構,內部則是由細菌和EPS組成緊致的結構,這說明纖毛蟲對AGS的結構和形態(tài)起到一定的作用,但是從FISH、EPS和SEM圖中可以明顯看到細菌仍然是形成AGS形態(tài)的最重要因素,EPS起到重要的“膠水”作用,將不同的細菌連接在一起,共同構成了AGS.同樣從由FISH結果可知(圖1),細胞主要聚集在顆粒外圍及空隙周圍,以簇狀生存,但是沒有在顆粒內形成連續(xù)的一層.顆粒外層比較疏松,內部比較致密,內外不同;顆粒內有較多的空隙,有利于底物的進入.本試驗在生活污水添加一定量碳源條件下