基于熒光原位雜交技術的海洋細菌分離鑒定

基于熒光原位雜交技術的海洋細菌分離鑒定

由于微生物過程的重要作用，對樣品中微生物的檢測和鑒定已成為控制和優(yōu)化自然環(huán)境污染的重要依據(jù)。然而，在自然環(huán)境中，很難形成具有優(yōu)勢的微生物。細菌多樣性給傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術帶來了很大困難，最終的微生物往往偏離原樣品，導致識別和鑒定錯誤。此外，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法需要時間和工作，樣品中只有一部分微生物。例如，在海水中，培養(yǎng)的微生物僅占總數(shù)的0.001%0.1%，而在淡水和底泥中，僅占總數(shù)的0.25%。此外，還有一些細菌很長很難分離。因此，傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法受到了嚴重限制。為了解決這個問題，越來越多的研究人員開始使用生物技術在環(huán)境樣品中分析微生物。生物技術不僅可以節(jié)省傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的時間，而且可以充分反映樣品中存在的微生物的組成，并能有效、快速地接收環(huán)境樣品的微生物信息。隨著時間的推移,分子生物學技術越來越成熟,特異性越來越強,如今已能檢測特定微生物群落的動態(tài)變化和活性.分子生物學技術所得的研究成果正開始改變?nèi)藗儗ξ⑸锸澜绲挠^點.至今,開發(fā)用于研究微生物群落的分子生物學技術主要是基于對核糖體RNA分子的小分子亞單元及基因的檢測和分析(對于原核生物是16SrRNA和rDNA分子),也有以特定的功能基因作為分子指標的,如對好氧氨氧化菌進行檢測的amoA基因,對反硝化菌進行檢測的nirS和nirK基因等.1酶技術的總結(jié)1.1寡核苷酸探針fishFISH技術的主要原理為:將寡核苷酸探針用熒光染料標記,再使之與固定在載玻片上的微生物樣品雜交;將未雜交的熒光探針洗去后,用共聚焦激光掃描顯微鏡或普通熒光顯微鏡進行觀察和攝像.早在十幾年前,FISH就開始被用于微生物的檢測,并成為了微生物學的一個突破.用這一方法可以避免細菌的培養(yǎng),清楚并方便地觀察到樣品中細菌的細胞數(shù)量和空間位置,而且可以通過不同的寡核苷酸探針同時對不同類群的細菌在細胞水平上進行原位的定性定量分析和空間位置識別.寡核苷酸探針是一段長度為15～30個堿基的基因片斷,它容易滲透到目標細胞或組織中.通常在寡核苷酸探針的5′端通過共價鍵與簡單熒光染料分子鏈接.常用的熒光體有:熒光素(fluorescein)、四甲基若丹明(tetramethylrhodamine)等,但更多的研究者使用羰花青(如Cy3或Cy5),因為羰花青大大提高了FISH的靈敏度.FISH常用的分子指標是rRNA,通常將它作為FISH檢測的靶序列.大部分FISH探針的靶序列為16SrRNA,也有將23SrRNA或16S和23S基因間隔區(qū)作為靶序列的.對每個分類水平,根據(jù)rRNA目標區(qū)域可設計寡核苷酸探針,進行種屬特異性的鑒定.如今Internet上的公用數(shù)據(jù)庫包括了絕大部分培養(yǎng)微生物的16SrRNA序列和許多直接從環(huán)境中得到的微生物DNA序列.典型的FISH實驗過程一般包括4個步驟:樣品的固定、雜交、未雜交探針的清洗以及標記細胞的觀察.FISH技術已在環(huán)境樣品微生物分析中得到了較廣泛的應用,如高效生物除磷(EBPR)反應器污泥中微生物群落的測定、anammox菌多樣性研究、anammox菌的rDNA操縱子大片段16S23S間區(qū)和23SrRNA特性研究、微生物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒插入體研究(克隆?FISH)、FISH與微量自動射線照相術研究活性污泥中微生物對基質(zhì)的吸收特性等.1.2pcr擴增檢測生物高分子的表達PCR技術是1985年美國Cetus公司的Mullis和Saiki等發(fā)明的一種基于在生物體外對特殊氨基酸進行擴增的引物延伸反應.它解決了環(huán)境樣品中提取的DNA量通常過低而不能很好分析的難題,是分子生物學研究的重大突破之一.它和FISH一樣,也是一種無需微生物培養(yǎng)、簡單、快速、靈敏的細菌檢測技術.PCR反應中,多聚酶是一種催化DNA或RNA形成和修復的生物高分子,常用的多聚酶是從嗜熱細菌Thermusaquaticus分離的TaqDNA聚合酶,該酶在95℃時也不會變性,在65℃下可催化聚合反應.PCR反應過程中,向前和向后的引物(引物一般是約為20個核苷長的寡核苷酸)分別與待擴增的DNA模板(稱為靶序列)的正鏈和負鏈的兩端互補,將引物片斷與待擴增的DNA片斷混合并加熱變性,然后退火,此時引物片斷就和相應的DNA模板互補雜交,加入的底物dNTPs和DNA聚合酶進行DNA擴增.這是PCR反應一般程序(圖1)中的一個循環(huán).經(jīng)過若干循環(huán)后,DNA的數(shù)量為(1+X)n(X為反應平均效率,n為循環(huán)次數(shù)).可見,PCR的擴增效率是相當高的,它可以使一小段DNA(通常少于3000個堿基對)擴增100萬倍,從而方便了微生物的鑒定.經(jīng)典PCR一般分為擴增和檢測兩個階段,常用溴乙啶染色后的凝膠電泳作為定性檢測手段,用熒光標記技術作為定量分析手段.從PCR技術發(fā)明至今,該技術已不斷得到改進.除經(jīng)典PCR以外,還開發(fā)出了反轉(zhuǎn)錄PCR、反向PCR、錨定PCR、多重PCR、PCR芯片等.隨著電子技術的發(fā)展,這一技術必將有更好的前景.文獻總結(jié)了PCR及相關技術的應用情況.1.3分子克隆技術環(huán)境樣品微生物分析的一個較突出的問題是得不到足夠的目標物質(zhì)進行分析.譬如10L生長到最大濃度的E.Coli培養(yǎng)菌只包含7mgDNA多聚酶I,許多其他蛋白質(zhì)的量則更少.此外,微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì),能被純化的部分幾乎不到一半,真核細菌的蛋白質(zhì)則更難得到,分子克隆技術的發(fā)展和應用克服了這一不足.分子克隆的主要技術要點是:將目標DNA片斷插入一段自復制的DNA分子(克隆載體)中,而后目標DNA片斷就和載體復制在一起,將這個攜帶著目標DNA片斷的載體在宿主細胞(如E.Coli或酵母菌)中克隆后就可產(chǎn)生大量的被插入的目標DNA片斷.1.4taqna多聚酶常用的DNA測序方法是自動熒光DNA測序.先將DNA的4個堿基用不同顏色的染料著色,再將這些染料加在4個脫氧核苷的終端,從而使所有的DNA片斷以染料標記的終端結(jié)束.這些DNA片斷接著在聚丙烯酰胺凝膠上被分離,而熒光則被激光激發(fā)后得到探測.DNA測序與PCR類似,采用高溫使DNA雙鏈變性,引物被退火后得到延伸.這一方法的優(yōu)點在于它可以進行多輪測序反應而不需要加入新的酶,就像PCR反應一樣,而且,只要使用標準質(zhì)粒mini-preps就能夠得到足夠的用于測序反應的DNA.TaqDNA多聚酶也是DNA測序反應中常用的酶,它能使染料標記的DNA終端分布更加均勻,具有較高的測序準確度.DNA測序中使用的模板主要是克隆載體和PCR擴增DNA兩種,前者主要包括單鏈抗菌素載體、雙鏈質(zhì)粒載體、Phagemid載體(含有單鏈抗菌素復制源的雙鏈質(zhì)粒)等;后者主要包括單鏈PCR擴增產(chǎn)物和雙鏈PCR擴增產(chǎn)物.當模板是PCR擴增DNA時,必須保證過量的引物在測序前得到清除,否則會影響測序結(jié)果.引物的去除可通過很多方法實現(xiàn),如從瓊脂電泳切膠回收法,酚—氯仿—乙醇法以及商品化的微柱純化法等.DNA測序后一個重要的步驟就是序列的分析,只有經(jīng)過準確和合理的序列分析才能最終鑒定目標微生物.目前,可以進行DNA序列分析的工具很多,最常用的有以下幾種:a.序列數(shù)據(jù)的獲得.可以通過Entrez(由美國國家生物技術信息中心開發(fā)),SRS(由歐洲生物信息學院開發(fā)),DBGET/LinkDB(由日本Kyoto大學和東京大學人類基因組中心開發(fā))等網(wǎng)絡數(shù)據(jù)資源得到有關的序列信息.b.數(shù)據(jù)庫查詢和序列的排列(alignment).數(shù)據(jù)庫查詢的軟件或網(wǎng)絡資源較多,一般常用BLAST進行查詢.對目標序列進行查詢的同時也能對序列進行初步的排列,為后面的系統(tǒng)發(fā)育分析提供基礎.c.系統(tǒng)發(fā)育分析(Phylogeneticanalysis).系統(tǒng)發(fā)育分析是確定微生物在發(fā)育過程中種屬關系的一種手段,其主要方法包括直接創(chuàng)建方法(基于距離評分方法)、樹查找方法(檢約法和最大可能性法)等.系統(tǒng)發(fā)育分析的原理及方法見文獻.2好氧和厭氧氨氧化菌原位檢測采用FISH,PCR,DNA克隆、DNA測序和序列分析等技術,對采自江蘇省新沂河、蘇州市城市河道和東太湖等不同生境條件的水體底泥樣品進行了好氧和厭氧氨氧化菌的原位檢測.2.1土壤樣品研究采集了6個底泥樣品,其特性見表1.2.2新沂蒙河底泥中anammox菌的原位檢測結(jié)果采用anammox菌特異性探針AMX368對所采集的6個底泥樣品進行anammox菌的原位檢測,結(jié)果表明,只有在新沂河底泥樣品XYR1和XYR2中觀察到了具有環(huán)狀形態(tài)(anammox菌區(qū)別于其他細菌的特殊形態(tài))的目標細胞(圖2),其余底泥樣品中均未發(fā)現(xiàn)目標細胞.系統(tǒng)發(fā)育分析表明,樣品XYR2中存在屬于Brocadia分支的anammox菌.2.3pcr產(chǎn)物的克隆在確認新沂河樣品XYR2中確實存在anammox菌之后,對其分離后的DNA再通過引物對amoA1F(氨單氧酶亞單元A向前引物)和amoA2R(氨單氧酶亞單元A向后引物)擴增后,對得到的PCR產(chǎn)物用PCR1.2TOPO載體進行了克隆;然后,對挑選出的白色菌落DNA進行分離,對其進行消化后,用凝膠電泳檢查并選擇進行測序的克隆DNA.共對樣品XYR2的4個amoA基因進行了測序.對于這些amoA序列轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)后的序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析