熒光原位雜交技術及其應用

熒光原位雜交技術及其應用

fluentisentihaybridization（fish）是在20世紀80年代末發(fā)展起來的一種非輻射原位雜交技術的基礎上發(fā)展起來的。用熒光標記代替相位標記形成的新的原位異交方法。首先，它與特定的觀分子（參考元素）結(jié)合，然后通過免疫細胞化學過程將殘余染料連接到觀細胞。FISH的基本原理是將DNA(或RNA)探針用特殊的核苷酸分子標記,然后將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上,再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結(jié)合來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量分析。FISH具有安全、快速、靈敏度高、探針能長期保存、能同時顯示多種顏色等優(yōu)點,不但能顯示中期分裂相,還能顯示于間期核。同時在熒光原位雜交基礎上又發(fā)展了多彩色熒光原位雜交技術和染色質(zhì)纖維熒光原位雜交技術。1原聚光燈技術1.1探針的制備熒光原位雜交探針的類型十分廣泛,大小可以從幾Mb~幾百bp。探針的獲得可通過克隆、酶擴增及化學方法合成。多種探針的使用使得FISH技術成為一個多功能原位研究DNA和RNA結(jié)構(gòu)和功能的方法。1.1.1探針的保守性人類和哺乳類基因組內(nèi)有一些高頻率的重復序列,在進化上很少具有保守性,如果以基因組為探針,這些存在于靶序列和探針之間的高度重復序列會首先退火,超過那些單一和保守的序列,因而雜交表現(xiàn)出種的特異性。1.1.2重復序列法類似于а衛(wèi)星、衛(wèi)星щ類的探針,雜交靶位點常常大于1mb,不含散在重復序列,與靶位點結(jié)合緊密,雜交信號強,易于檢測,常用于檢測間期細胞非整倍體和微小標志染色體。1.1.3病毒片段的制備通常是全染色體或染色體區(qū)域特異性探針(whole-chromosomeorchromosomeregion-specificprobes),由一條染色體或其上某一區(qū)域極端不同核酸片段組成,可由克隆到噬菌體或粘質(zhì)粒的染色體特異性大片段插入文庫制取,切微切文庫探針片段小,與鄰近區(qū)域發(fā)生重疊或制片中被破壞的可能性?？捎糜谥衅谌旧w重組和間期核結(jié)構(gòu)分析。1.1.4ds-ms/mss-fpss檢測對于存在于基因組內(nèi)的單一順序基因,檢出的最好方法是使用含有插入片段的較大的克隆載體,如全Cosmids可載40kb的插入片段,YAC載體能載100~800kb左右的片段。但有報告說,小到2kb的質(zhì)粒探針仍可用FISH檢測,只是效率很低(20~50%)。常有一個或幾個克隆序列組成,可由cDNA克隆或克隆到大片段插入載體的核酸片段制取。主要進行染色體克隆DNA定位和檢測靶細胞序列拷貝數(shù)和結(jié)構(gòu)變化。1.1.5寡核苷酸rna探針RNA探針包括ssRNA探針和寡核苷酸RNA探針兩種,其中單鏈反義RNA探針廣泛應用于組織切片和整體制備物上。寡核苷酸RNA探針比DNA探針優(yōu)越,它與目標RNA形成的雜交體比DNA探針更緊密,同時它可用來鑒別一些特定序列如兩個相關緊切的同源性mRNA(同型mRNA)。而且寡核苷酸RAN探針長度短小,具有超強的通透性進入細胞核和組織切片。通過核酸自動合成儀可輕易地制備寡核苷酸RNA探針。1.2探針的使用效果探針標記通常有兩個目的:一方面將標記好的核苷酸加入到探針序列中去,另一方面可以將DNA片斷長度縮小至500bp以下。長的探針會導致明顯的背景著色。當使用短的探針時,可以通過降低甲醛的濃度,增加SSC的濃度,或者降低洗滌溫度來調(diào)整雜交和洗滌條件。探針長度縮短時,相應的洗滌時間也要縮短。1.2.1熒光顯微鏡檢測將熒光分子直接標記于探針DNA/RNA上,雜交后可直接在熒光顯微鏡下檢測。這種方法快速簡潔、結(jié)果背景干擾很少,但雜交信號較弱,且不能進一步放大。1.2.2中間分子有采用一中間分子標記探針,雜交后再用熒光分子標記的中間分子的的親和物或抗體進行檢測。目前采用的中間分子有:生物素、地高辛配基、2-乙酰氨基芴、二硝基苯酚、汞分子和硫化基團。目前前兩者以標記核苷酸類似物的形式被滲入探針的,因此,可以采用常規(guī)的缺口平移法、隨機引物法、PCR或RNA體外轉(zhuǎn)錄法進行標記,故最為常用。標記后的探針長度應為200-400bp,以保證最佳的雜交效果。1.3鉻原代交叉技術1.3.1抑制性染色體原位雜交標記的探針變性后,加于變性的中期染色體分裂相標本上,于37℃、50%的甲酰胺2╳SSC條件下進行雜交。最適的雜交條件主要取決于探針與靶基因的性質(zhì)。對于單拷貝基因的雜交,特別是較長的來自基因組的序列,一般在雜交之前應進行預復性過程,標記的探針與過量的基因組DNA或Cot-1重復序列一起孵育1小時,使探針中非特異的重復序列被封閉,從而抑制該部分探針與染色體之間發(fā)生非特異性雜交,上述過程又稱為抑制性染色體原位雜交。經(jīng)預復性之后的探針再與變性的染色體標本雜交過夜。雜交結(jié)束后,標本經(jīng)雜交后清洗。去除非特異性雜交或未發(fā)生雜交的探針,然后用熒光標記的檢測試劑進行檢測。對于生物素標記的探針,一般采用熒光標記的卵白素檢測,對于其它中間分子,則主要采用熒光標記的相應抗體來檢測,常用于標記的熒光分子及其特性如表1所示。1.3.2般顯帶的處理先進行染色體顯帶,然后再進行FISH,會明顯降低雜交信號的檢出率,因此,一般顯帶是在雜交之后。常用的顯帶方法有:Actinomycin/DAPI顯示的G帶,經(jīng)溴尿嘧啶處理后Hoechest染色顯示的R帶等。采用Alu或ine重復序列與探針同時進行雜交,亦可得出R帶或G帶的效果。1.3.3圖像壓縮和定位熒光鏡檢時顯微鏡的質(zhì)量及濾片的選擇,對滿意結(jié)果的獲得至關重要。特別是濾片系統(tǒng),應嚴格按照表所列的熒光激發(fā)/發(fā)射光波長,選擇最適的激發(fā)/阻擋濾片組合。攝影記錄系統(tǒng)由于固態(tài)電荷耦聯(lián)掃描裝置及圖象分析儀的應用,可以使背景著色很大程度的減低。應用激光共軛聚焦顯微鏡,可通過對染色體標本的不同平面進行斷層掃描,并將得到的結(jié)果經(jīng)計算機處理,獲得高質(zhì)量的圖象結(jié)果。采用FISH,在中期染色體上直接定位基因,分辨率可達3-20Mb;在間期核確定基因之間的距離,分辨率可達50-850Kb。同時采用不同的中間分子標記,不同的熒光分子檢測可得到多種熒光色彩的雜交信號,分辨率還可以進一步提高。1.4基因圖譜的構(gòu)建、研究是基因的分析基目前,熒光原位雜交技術已廣泛應用在細胞遺傳學、育種學、醫(yī)學等多個領域,如動植物基因組結(jié)構(gòu)、變異及空間規(guī)律的研究、分辨復雜的染色體易位變異、病毒感染、DNA物理圖譜的構(gòu)建、人類的產(chǎn)前診斷、哺乳動物染色體進化研究、轉(zhuǎn)基因的細胞學鑒定、檢測外源染色體片段及其滲入特點、物種間的親緣關系、性別鑒定及RNA的表達。隨著分子生物學的發(fā)展,新探針的出現(xiàn)特別是全探針及染色體原位抑制雜交技術的出現(xiàn),計算機輔助的共聚焦顯微系統(tǒng)和數(shù)字成像系統(tǒng)的發(fā)展,FISH技術的應用會加深加快人類的腫瘤學、產(chǎn)前診斷、哺乳動物的染色體進化研究及親緣關系等領域的研究。2熒光顯微鏡標記探針多彩色熒光原位雜交(multicolorfluorescenceinsituhybridization)是在熒光原位雜交的基礎上發(fā)展起來的新技術,不僅FISH的優(yōu)點,而且克服了FISH的許多局限,能同時檢測多個基因,分辨復雜的染色體易位和微小靶位的真正意義的分子細胞遺傳學。探針的熒光素標記分為間接標記和直接標記。間接標記是用生物素標記的dUTP(biotin-dUTP)通過缺口平移法標記探針,雜交后再用偶聯(lián)有熒光素的抗生物素抗體檢測。通過幾輪抗生物素蛋白-熒光素、生物素化的抗-抗生物素蛋白、抗生物素蛋白-熒光素的一系列處理,可放大被檢信號,檢測小至500bp的靶序列。直接標記是通過熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價結(jié)合、或缺口平移法標記探針時摻入熒光素核苷三磷酸標記探針。直接標記的探針雜交后經(jīng)過簡單沖洗就可鏡檢,省去了間接標記的探針那樣進行多步驟信號放大,因而不如間接標記的探針靈敏,但靶較大(數(shù)百kb),還是較可靠,且探針標記數(shù)不受高親和力配基(high-affinitybindingparter)能力限制,所以直接標記的探針在多彩色FISH中應用更廣。用激發(fā)光譜和吸收光譜不同的熒光素按一定調(diào)色方法標記探針,就可同時分析不同探針對應的靶DNA。探針熒光素顏色調(diào)配的方法有:a.非調(diào)色法(coloruncoding):是用幾種不同顏色的熒光素標記n中探針。b.混合調(diào)色法(combinationcoding):是用幾種不同的熒光素分別標記2n-1種探針,如n-3時,用紅、綠和藍三種熒光素把七種探針分別標記為:紅、綠、藍、紅+綠、紅+藍、綠+藍、紅+綠+藍七種顏色。c.比例調(diào)色法(ratio-coding):即用兩種以上不同熒光素按不同比例混合標記探針,如用紅色和綠色兩種熒光素,按紅:綠比值分別為∞、2、1、0的比例,把四種探針分別標記為紅、橙、黃、綠四種顏色。這三種調(diào)色法中比例調(diào)色法只需要極少幾種熒光素就可標記多種探針,因而更有發(fā)展?jié)摿?。熒光顯微鏡配有濾光片或響應裝置,透過不同濾光片可觀察相應探針的熒光,如用透紅光的濾光片可看到紅色熒光素標記的探針,換用透綠光的綠光片則相反;多次曝光可攝制出鏡下所見并能分辨綠色和紅色兩種熒光素共同標記的探針。使用多色綠光片可同時觀察多種熒光素標記的探針,簡化了觀察和照相過程,但所見熒光不如單色濾光片強,故靈敏度不如單色濾光片。數(shù)字顯微鏡可分析探針發(fā)出或吸收光線的光譜組成而把它們區(qū)分開,且靈敏度高、可視性強、可量化分析和自動化分析,已越來越多地應用于FISH信號檢測。共焦顯微鏡可檢測懸浮細胞和石蠟切片、冰凍切片的熒光信號,并有空間分辨力強、可屏蔽共焦平面上下的熒光干擾,只分析共焦平面上圖象的優(yōu)點。共焦顯微鏡和數(shù)字成像系統(tǒng)相結(jié)合,借助計算機,可實現(xiàn)細胞核層掃描,觀察胞核三維結(jié)構(gòu)。3低滲及甲酰胺ish熒光原位雜交的分辨率受到分裂期染色體高度凝聚的限制,最高分辨率約為1Mb。由于染色質(zhì)在細胞間期核中折疊程度較低,,如果采用染色質(zhì)FISH(又稱Halo-FISH),將能有效提高FISH的