醫(yī)學免疫學教學課件：第十八講 免疫學檢測技術的基本原理

第十八講

免疫學檢測技術的基本原理

2免疫學檢測方法——應用免疫學理論設計的一系列測定抗原、抗體、免疫細胞及其分泌的細胞因子的實驗方法。3第一節(jié)

體外抗原抗體結(jié)合反應

的特點及影響因素一、抗原抗體反應的特點1、抗原抗體結(jié)合的特異性2、抗原抗體結(jié)合的可逆性3、適宜的抗原抗體濃度和比例4、抗原抗體反應的兩個階段4抗原抗體結(jié)合的特異性抗原抗體結(jié)合的特異性由抗原表位與抗體分子中的超變區(qū)互補結(jié)合所決定。互補程度越高，特異性越強，親和力越高。親和力指抗體分子單一抗原結(jié)合部位與一個相應抗原表位之間互補結(jié)合的強度。用已知抗原檢測未知抗體，也可用已知抗體檢測未知抗原。5抗原抗體結(jié)合的可逆性非共價鍵結(jié)合，易解離

范德華力靜電引力氫鍵疏水鍵解離后抗原和抗體仍具有原來的特性解離度取決于

抗體親和力的大小環(huán)境因素：如溫度、pH等6適宜的抗原抗體濃度和比例免疫復合物中抗原和抗體的量肉眼可見肉眼不可見肉眼不可見7抗原抗體反應的階段性與可見性（1）特異性結(jié)合階段反應迅速一般不出現(xiàn)肉眼可見的反應（2）可見反應階段小的Ag-Ab復合物形成較大復合物的過程易受溫度、電解質(zhì)和酸堿度等影響8二、抗原抗體反應的主要影響因素電解質(zhì)溫度37℃pH6-89三、抗原、抗體的制備㈠、抗原制備顆粒性抗原：細胞性抗原可溶性抗原㈡、抗體制備多克隆抗體單克隆抗體10四、體液免疫檢測技術㈠、傳統(tǒng)的血清學方法1.凝集反應(Agglutination)顆粒性抗原＋抗體凝集可溶性抗原＋相應抗體不凝集可溶性抗原—無關載體＋抗體凝集常用載體RBC聚苯乙烯乳膠活性碳膠體金11

凝集反應的類型①直接凝集反應：玻片法試管法微量凝集法

12凝集反應的類型②間接凝集反應：

132.沉淀反應

Precipitation可溶性抗原＋相應抗體沉淀物方法：1、單向瓊脂擴散2、火箭電泳＝單向瓊脂擴散＋電場3、雙向瓊脂擴散4、對流免疫電泳＝雙向瓊脂擴散＋電泳5、散射比濁（敏感、精確、自動化）6、速率散射比濁141516171819第二節(jié)免疫標記技術

Immunolabellingtechnique用酶、熒光素、同位素等物質(zhì)標記抗體或抗原進行抗原抗體反應，檢測抗原或抗體的技術。1、常用標記物質(zhì)：酶：HRP、AP熒光素：FITC、RB200放射性同位素膠體金電子致密物質(zhì):2、用途：免疫組織化學技術：用于抗原定位（組織切片、細胞涂片、活體定位），在細胞或亞細胞水平上觀察鑒定抗原、抗體、受體等。免疫定量測定：用于液體標本中抗原或抗體含量的測定。20一、免疫熒光技術㈠、熒光素：1、異硫氫酸熒光素（黃綠色熒光）

fluoresceinisothiocyanate,FITC,495nm2、羅丹明（紅色熒光）LissaminerhodamineB,RB200,3、R—藻紅蛋白R-pheoerythin,R-PE㈡、熒光顯微鏡21㈢、常見免疫熒光技術的方法1.熒光抗體染色技術直接熒光法間接熒光法2.熒光免疫測定技術時間分辯熒光免疫測定（timeresolovedfluorescenceimmunoassay,TR-FIA）22PemphigusvulgarisIntercellularIgG

staining2324二、免疫酶標記技術

Immunoenzymatictechnique用酶標記抗體或抗抗體進行的抗原抗體反應，以底物被酶分解后的顯色深淺來反應待檢樣品中抗原或抗體的含量。1、常用酶：辣根過氧化物酶（Horseradishperoxidase,HRP）堿性磷酸酶（Alkalinephosphatase,AKP）2.常用方法：免疫組織化學技術酶聯(lián)免疫吸附試驗25㈠、酶免疫組織化學技術Normalisletof

LangerhanInsulitis-Pretype

1diabetesAlphacells

(Glucagon)Betadells

(Insulin)Autoimmunity:Diabetes26㈡酶聯(lián)免疫吸附試驗

EnzymeLinedImmunasorbentAssay，

ELISA原理：一種固相免疫酶技術固相載體的種類：聚苯乙烯板聚苯乙烯小珠基本方法：⑴、間接法⑵、雙抗體夾心法⑶、抗原競爭法檢測儀器2728三、放射免疫分析法

Radioimmunoassay,RIA同位素分析的靈敏性＋抗原抗體反應的特異性優(yōu)點：靈敏度高特異性強精確性好樣品用量少測定方法規(guī)范、自動化常用同位素：125I、131I、3H、14C、32P29常用抗原抗體反應的相對敏感度

反應名稱敏感度（/L）血清蛋白電泳（區(qū)帶電泳）1000mg免疫電泳50～100mg單向免疫擴散＜10～20mg雙向免疫擴散＜10mg火箭電泳＜5.0mg對流免疫電泳＜1.0mg免疫比濁1.0mg補體結(jié)合反應10ug凝集反應10ugELISA＜10ugRIA＜10ug30第三節(jié)

免疫細胞及其功能檢測一、免疫細胞的分離選擇性分離細胞的依據(jù)：細胞大小、密度、表面電荷、粘附能力、細胞吞噬能力、細胞膜上的特異性標志等；31㈡、外周血中單個核細胞分離單個核細胞＝淋巴細胞＋單核細胞細胞分離液：Ficoll-hypaque密度梯度離心法Percoll不連續(xù)密度梯度法32㈢、T、B淋巴細胞分離1、免疫磁性微珠分離法（Immunomagneticbeads,IMB)用包被用抗體或抗原的可磁化顆粒（Fe3O4+大分子材料）作為免疫反應的載體，快速高效的分離，無需離心沉淀分離技術；33㈢、T、B淋巴細胞分離5、熒光激活細胞分離儀分離法

流式細胞術（Flowcytometry,FCM）將光學流體力學、電子學和計算機等多種技術綜合為一體，對單個細胞進行快速、靈敏、多參數(shù)的定量測定，并進行綜合分析的一項技術。熒光激活細胞分離器（Fluorescenceactivatedcellsorter,FACS）34熒光激活細胞分離器組成部分：氣控單細胞層流系統(tǒng)激光光源系統(tǒng)光檢測及信息處理系統(tǒng)細胞分離純化系統(tǒng)35流式細胞儀檢測范圍細胞大小細胞粒度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細胞結(jié)構(gòu)特異性抗原（細胞表面/胞漿/核）細胞內(nèi)細胞因子細胞活性酶活性激素結(jié)合位點細胞受體細胞功能36㈢、淋巴細胞體外增殖試驗1、淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗形態(tài)學方法：淋巴母細胞計數(shù)

3H—胸腺嘧啶核苷摻入法MTT檢測法：

線粒體脫氫酶

四甲基偶氮唑藍藍黑色甲潛∝活細胞（MTT）（formazan）

570nm測吸光值37㈣、細胞毒性試驗1、抗體依賴性細胞介導的細胞毒