中草藥抗大腸桿菌性腹瀉作用機(jī)制的初步研究

中草藥抗大腸桿菌性腹瀉作用機(jī)制的初步研究

仔豬的腸腹瀉是一種常見(jiàn)的仔豬育種疾病。發(fā)病率和死亡率很高，已成為養(yǎng)豬業(yè)的障礙。臨床上常用來(lái)治療仔豬大腸桿菌性腹瀉的抗菌藥物主要依賴于它們的抑菌作用,而中草藥的治療作用則是多方面的,其作用機(jī)理很復(fù)雜。引起仔豬大腸桿菌性腹瀉的病原為腸毒素性大腸桿菌(ETEC),其主要通過(guò)菌毛黏附素牢牢地黏附在仔豬黏膜表面,并產(chǎn)生腸毒素,繼而破壞體內(nèi)水分和電解質(zhì)正常的吸收和排泄動(dòng)態(tài)平衡,使腸管中的液體蓄積而導(dǎo)致腹瀉。另外,由于年齡、免疫狀態(tài)、生理機(jī)能、飼養(yǎng)條件等多種誘因造成的消化機(jī)能紊亂也是重要不利因素。仔豬消化道內(nèi)食物分解不全的產(chǎn)物或由于發(fā)酵產(chǎn)生的低級(jí)脂肪酸,刺激腸蠕動(dòng)加快而引起瀉下。病豬消化機(jī)能紊亂使腸道菌群失調(diào),大量有害細(xì)菌產(chǎn)生的有毒產(chǎn)物刺激腸黏膜發(fā)生炎癥過(guò)程,促進(jìn)液體從腸壁向腸腔滲出,加重了瀉下。本研究針對(duì)以上發(fā)病機(jī)理,通過(guò)大青葉、板藍(lán)根、連翹、敗醬草4味中草藥及其復(fù)方配伍對(duì)大腸桿菌的體外抑菌活性、抗腸毒素LT作用、減少炎性產(chǎn)物刺激下的腸液滲出、抑制腸蠕動(dòng)加快及對(duì)抗藥物性腹瀉等5個(gè)試驗(yàn)初步探討中草藥治療仔豬大腸桿菌性腹瀉的作用機(jī)理。1材料和方法1.1材料表面1.1.1藥物的提取液板藍(lán)根(Isatisindigotica)、大青葉(Isatistinctoria)、連翹(Forsythiasuspensa)、敗醬草(Patriniavillosa),均由黑龍江省藥材總公司提供;大青葉、板藍(lán)根采用水提醇沉淀法制備提取液,連翹和敗醬草采用雙提法(水提醇沉淀法及蒸餾法)制備提取液。4種藥物的提取液均為1mL相當(dāng)于原生藥1g。方劑:為10余種中草藥經(jīng)過(guò)前期正交試驗(yàn)選出的優(yōu)化復(fù)方,由連翹、敗醬草、板藍(lán)根按一定比例配伍組成。上述藥液均經(jīng)流通蒸汽滅菌30min,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.1.2病毒豬大腸桿菌O149K88,由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物教研室提供。1.1.3培養(yǎng)基的制備普通營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基按常規(guī)方法制備;CAYE(caseinicacid-yeastextract)培養(yǎng)液參照諸長(zhǎng)貴等的方法制備。1.1.4術(shù)后觀察和護(hù)理日本大耳白兔,體重(2.2±0.2)kg,雌雄各半,手術(shù)前禁食48h,自由飲水,術(shù)后自由活動(dòng),禁食禁水;健康昆明種小白鼠150只,體重(20±2)g,雌雄兼有,由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院試驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)提供。1.2方法1.2.1外部環(huán)境活性測(cè)定采用試管二倍稀釋法。相同過(guò)程重復(fù)4次。1.2.2抗腸毒素作用1.2.2.中草藥提取液與cayn培養(yǎng)液的比例關(guān)系將E.coli接種于普通瓊脂斜面培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)12h,再移植于蛋白胨水中,37℃培養(yǎng)12h。在加有CAYE培養(yǎng)液的錐形瓶中采用無(wú)菌方法按1∶0.4(v/v)的比例加入中草藥提取液并調(diào)整所含培養(yǎng)液成分的含量、pH及滲透壓,使其與不加中草藥提取液對(duì)照組的CAYE培養(yǎng)液一致。再按10∶1(v/v)的比例加入上述蛋白胨水12h培養(yǎng)物,同時(shí)加入微量葡萄糖使其終濃度為2.5g/L。37℃以170r/min連續(xù)有氧震搖培養(yǎng)18h,培養(yǎng)物取出后加入0.1g/L的硫柳汞過(guò)夜殺菌,以4℃10000r/min離心30min,收集上清液4℃冰箱保存?zhèn)溆?不超過(guò)3d)。1.2.2.llt+0.4ml小孔率提取液及藥物治療自盲腸游離端的回腸開始,沿向心方向用4號(hào)絲線結(jié)扎腸袢,注射段4cm,間隔段2cm。每個(gè)腸袢隨機(jī)注入1mLLT+0.4mL中草藥提取液或1.4mL提取液的培養(yǎng)物,對(duì)照組注入1mLLT+0.4mL生理鹽水,上述每種液體各注射6個(gè)腸袢。注射完畢后縫合腹壁。11h后撲殺試驗(yàn)兔,取出結(jié)扎腸袢,測(cè)定每個(gè)腸袢的長(zhǎng)度(cm)和液體蓄積量(mL),并求出二者的比值(mL/cm),根據(jù)二者的比值判定中草藥提取液抗腸毒素作用的強(qiáng)弱。1.2.3抗藥性腹瀉的作用小鼠50只,隨機(jī)分成5組,每組10只。方法主要參照文獻(xiàn)。1.2.4影響結(jié)腸的進(jìn)行運(yùn)動(dòng)小鼠50只,分組情況同前。方法主要參照文獻(xiàn)。1.2.5對(duì)小鼠作為小鼠的感染效果小鼠50只,分組情況同前。各藥物組小鼠分別灌服相應(yīng)的中草藥提取液0.3mL/只,對(duì)照組灌服等量生理鹽水。給藥后40min,每鼠尾靜脈注射0.5%伊文思藍(lán)生理鹽水0.1mL,隨后腹腔注射0.6%醋酸生理鹽水溶液0.2mL。0.5h后將小鼠脫頸椎處死,剪開腹部皮膚肌肉,用生理鹽水分?jǐn)?shù)次沖洗腹腔,用吸管吸出沖洗液,合并后定容至10mL,3000r/min離心15min。取上清液用分光光度計(jì)于590nm測(cè)定吸光度值,并于標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出每只小鼠腹腔滲出的染料量。對(duì)照組和藥物組小鼠腹腔滲出的伊文思藍(lán)的量之差與對(duì)照組小鼠腹腔滲出的伊文思藍(lán)的量之比即為抑制率。根據(jù)小鼠腹腔滲出的伊文思藍(lán)的量及抑制率即可判定中草藥對(duì)炎性滲出的抑制作用。1.2.6處理數(shù)據(jù)采用SAS6.12進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果2.1室外抗菌活性結(jié)果見(jiàn)表1。2.2對(duì)失血腸的毒力將中草藥提取液加入到細(xì)菌培養(yǎng)液中與大腸桿菌一起培養(yǎng),用所得培養(yǎng)物L(fēng)T進(jìn)行兔回腸結(jié)扎試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表2。連翹及復(fù)方組可極顯著地(P<0.01)減少LT所致腸袢液體蓄積量;同樣方法處理過(guò)的板藍(lán)根或大青葉則可顯著地(P<0.05)減少結(jié)扎腸袢的液體蓄積量。將中草藥提取液及LT一起注入結(jié)扎腸袢,觀察其直接的抗腸毒素作用。表3所列數(shù)據(jù)表明,與對(duì)照組相比,敗醬草可顯著地減少液體蓄積量(P<0.05),而其它單味藥及復(fù)方提取液未達(dá)到顯著水平。2.3小鼠腹瀉次數(shù)和腹瀉頻率的比較,見(jiàn)表1表4的結(jié)果表明,中草藥復(fù)方制劑能明顯地減少蓖麻油引起的腹瀉發(fā)生率和腹瀉頻率。與對(duì)照組比較,在1~3h內(nèi)復(fù)方組極顯著地(P<0.01)降低了小鼠腹瀉次數(shù);在同一時(shí)相內(nèi),敗醬草及復(fù)方組的腹瀉發(fā)生率有降低的趨勢(shì),其它單味中草藥在對(duì)抗蓖麻油所致小鼠腹瀉方面差異不顯著。2.4不同推進(jìn)率板藍(lán)根作用表5的數(shù)據(jù)顯示,各藥物組均不同程度地減少了小鼠小腸墨汁推進(jìn)率,其中,板藍(lán)根作用最強(qiáng),與對(duì)照組相比,差異極顯著(P<0.01);其次是復(fù)方組和連翹組,抑制率分別為13.11%和8.20%,但未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。2.5小鼠合成安物量由表6可以看出,與對(duì)照組相比,復(fù)方組極顯著地抑制了醋酸所致小鼠腹腔染料滲出(P<0.01),抑制率達(dá)58.65%;敗醬草和板藍(lán)根可顯著地(P<0.05)抑制醋酸所致小鼠腹腔染料的滲出,抑制率分別為35.86%和35.02%。3中草藥的抗腹瀉作用3.1試驗(yàn)所用的大腸桿菌接種物的濃度為1.5×105/mL,在試驗(yàn)中盡可能保證培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間及判斷標(biāo)準(zhǔn)的一致,以確保試驗(yàn)結(jié)果有較好的重復(fù)性。與西藥不同,中草藥有顏色,清晰度差,易干擾試驗(yàn)結(jié)果的判定,因此本試驗(yàn)中所設(shè)陰性對(duì)照并非常規(guī)的培養(yǎng)基對(duì)照而是含有藥液的培養(yǎng)基,以消除上述不利因素,確保結(jié)果判定的準(zhǔn)確性。清熱類中草藥板藍(lán)根、連翹、敗醬草對(duì)大腸桿菌O149K88都顯示出不同程度的體外抗菌活性,由它們組成的復(fù)方的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度較單味藥均有所增強(qiáng),表明這幾味中草藥在抗菌活性方面具有協(xié)同作用。3.2在特定環(huán)境及宿主條件下,定居在仔豬小腸內(nèi)的大腸桿菌產(chǎn)生的腸毒素是引起下痢的直接原因。在ETEC產(chǎn)生的兩種腸毒素中ST無(wú)免疫原性,作用迅速但較短暫,而LT是一種大分子的蛋白質(zhì),有抗原性,雖然作用較遲但持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),被認(rèn)為是在大腸桿菌致腹瀉中起重要作用。因此,運(yùn)用熱敏腸毒素進(jìn)行抗腸毒素試驗(yàn)來(lái)篩選中草藥,對(duì)開展仔豬大腸桿菌性腹瀉的防治研究具有重要的理論意義和實(shí)踐意義。3.3將中草藥提取液加入到培養(yǎng)液中培養(yǎng)大腸桿菌,或直接與LT一同注入結(jié)扎腸袢可明顯降低大腸桿菌培養(yǎng)物上清液所致的腸袢液體蓄積量。中草藥提取液可能通過(guò)以下3種方式發(fā)揮作用:(1)在培養(yǎng)過(guò)程中,由于中草藥的殺菌作用使培養(yǎng)液中的大腸桿菌數(shù)目減少,產(chǎn)生LT的量也隨之減少;(2)中草藥能抑制培養(yǎng)液中存活的大腸桿菌產(chǎn)生LT,致使LT的量減少;(3)中草藥對(duì)大腸桿菌腸毒素LT有直接的拮抗作用。3.4張明發(fā)等曾在研究中草藥的抗炎和抗腹瀉作用時(shí)提出“炎癥介質(zhì)是一類致瀉性自體活性物質(zhì),臨床所見(jiàn)的大多數(shù)腹瀉性疾病和瀉藥都是通過(guò)致病因子使腸道發(fā)生炎癥,釋放出各種炎癥介質(zhì)所致,因此藥物可以通過(guò)對(duì)抗炎癥過(guò)程產(chǎn)生止瀉效果?！被即竽c桿菌性腹瀉病的仔豬消化機(jī)能紊亂,致使細(xì)菌、腸毒素和各種有毒產(chǎn)物作用于腸黏膜引起炎癥,腸道的炎癥過(guò)程又促進(jìn)液體從腸壁向腸腔滲出而加重了瀉下。試驗(yàn)選用的中草藥為清熱類藥物,具有清熱解毒抗菌消炎的功效,對(duì)病毒感染也有抑制作用。試驗(yàn)結(jié)果表明,無(wú)論單味藥(板藍(lán)根或敗醬草)還是復(fù)方,均能顯著或極顯著地抑制醋酸所致的小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高,也就是說(shuō),它們對(duì)急性炎性滲出過(guò)程有抑制作用。3.5小鼠藥物性腹瀉模型和小鼠小腸推進(jìn)運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)是研究藥物抗腹瀉機(jī)理常用的方法。下痢仔豬表現(xiàn)為腸炎的變化,且主要的病變部位是在小腸。蓖麻油是刺激小腸性致瀉劑,通過(guò)促進(jìn)炎性介質(zhì)的合成和釋放,致使腸腔積液,腸蠕動(dòng)加快,而導(dǎo)致腹瀉。連翹、板藍(lán)根、敗醬草所組成的復(fù)方配伍能極顯著地減少蓖麻油所致的小鼠腹瀉頻率,腹瀉發(fā)生率也較對(duì)照組和其它藥物組有所降低,表明該復(fù)方具有較好的抗炎止瀉之功效。幾種中草藥均不同程度地減少了小鼠小腸墨汁推進(jìn)率,板藍(lán)根極顯著地抑制了炎性產(chǎn)物刺激下的腸蠕動(dòng)加快,表明抑制腸運(yùn)動(dòng)也是中草藥抗仔豬大腸桿菌性腹瀉的機(jī)理。3.6本試驗(yàn)結(jié)果證明,板藍(lán)根、連翹