實驗總結-細胞培養(yǎng)方法

一、培養(yǎng)細胞常用配置培養(yǎng)基的配置：根底培養(yǎng)基500ml+胎牛血清50ml+雙抗5ml凍存液的配置：10%DMSO+90%胎牛血清依次比例酌量配置。超凈工作臺常規(guī)配置移液器1套〔2.5μl、20μl、200μl、1ml〕，酒精燈1盞，液器1臺，斜架1臺，酒精噴壺1個，酒精棉球缸1個，污缸1個，常規(guī)耗材：培養(yǎng)瓶〔50㎝2〕，定量移液管〔5ml、10ml〕，槍頭〔1ml、200μl、10μl〕，培養(yǎng)皿，6/24/48/96孔板，醫(yī)用脫脂棉球，凍存管所需試劑：培養(yǎng)基，胎牛血清，雙抗，DMSO，胰酶，75%酒精……實驗前準備：所需的各項高壓后的耗材及污物缸放于超凈工作臺，用酒精噴壺噴灑實驗臺面，并關閉工作臺翻開紫外燈照射30min后開場實驗操作。培養(yǎng)基及胰酶恢復常溫后使用，可37℃水浴5-10min二、細胞復步驟：1.紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。2.培養(yǎng)液〔DMEM〕，恒溫水浴箱37℃預熱20min，備用。超凈臺準備一支15ml離心管備用。3.將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后酒精消毒放于工作臺面，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后需再次分別消毒瓶口和瓶蓋。4.從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入37℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液融化至黃豆粒大小后迅速取出。5.將細胞懸液移入15ml離心管，緩慢參加4ml培養(yǎng)液，離心〔1000r/min，5min〕。6.取出2個培養(yǎng)皿并做好標記〔復日期等〕，提前參加5-10ml培養(yǎng)液；離心完畢后用1ml培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細胞后分別參加培養(yǎng)皿。7.將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。8.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)考前須知：1.取細胞的過程中注意帶好防凍手套。此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。2.凍存液的問題：凍存液的配置已是常識，在這里不作詳述，但二甲基亞砜〔DMSO〕對細胞不是完全無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作用較大，因此，必須在1-2min使凍存液完全融化。如果復溫度太慢，會造成細胞的損傷，二甲基亞砜〔DMSO〕最好選擇進口產品。3.離心前須參加少量培養(yǎng)液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意參加少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷。4.離心問題：目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進展培養(yǎng)，第二天換液。因為離心的目的是兩個，去除DMSO，去除死細胞，這個是標準流程，但對一般人來說，把握不好離心轉速和時間，轉的不夠活細胞沉底的少，細胞就全被扔掉了，轉過了活細胞會受壓過大，死亡。此外在操作過程中容易污染，所以不推薦。另一種說法為細胞懸液中含有二甲基亞砜〔DMSO〕，DMSO對細胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液體前倒凈，且一定倒干凈。5.凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml－15m培養(yǎng)液6.復細胞分裝的問題：復1管細胞一般可分裝到2-3只培養(yǎng)皿中，分裝過多，細胞濃度過低，不利于細胞的貼壁。7.加培養(yǎng)基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果你加培養(yǎng)基的太少，則DMSO的濃度就會比擬大，就會影響細胞生長，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時候對一般細胞沒有什么影響，還有一個說法是1％。所以如果你的凍存液的濃度是10％DMSO的話則加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度8.原理：在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導致細胞發(fā)生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養(yǎng)液參加保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞水份在凍結前透出細胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。細胞復時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的－5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。目前常用的保護劑為二甲亞砜〔DMSO〕和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。三、培養(yǎng)液的更換1.紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。2.培養(yǎng)液〔DMEM〕，恒溫水浴箱37℃預熱20min，備用。3.將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后酒精消毒放于工作臺面，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋。4.將培養(yǎng)皿蓋口朝上放在架子上，將培養(yǎng)皿的培養(yǎng)液懸空倒進污缸5．拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身2-3次，懸空進入培養(yǎng)基瓶吸取5-10ml培養(yǎng)基再懸空移入培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)皿蓋在酒精燈上消毒2-3次后蓋上。6.將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。7.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)每天定時觀察細胞生長情況，一般72-96h后，細胞生長密度大于90%，即可進展細胞的傳代。四、細胞傳代1.紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。2.培養(yǎng)液，胰酶，恒溫水浴箱37℃預熱20min，備用。3.將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈消毒后放于工作臺面，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側。4.將培養(yǎng)皿蓋口朝上放在架子上，將培養(yǎng)皿的培養(yǎng)液懸空倒進污缸。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1-2ml胰酶液，懸空沿皿壁參加培養(yǎng)皿。5.將培養(yǎng)皿來回傾倒使胰酶浸沒整個皿底的細胞層，計時越1-3min〔消化時間根據細胞不同時間不同〕，對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個細胞脫落，鏡下觀察到細胞都變圓時為胰酶消化的最適時機。〔假設看到成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；假設看不到針孔樣縫隙和細胞脫落，或鏡下細胞多有菱角則需繼續(xù)消化〕。用移液器將胰酶吸凈。6.吸取1ml培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次，使貼壁細胞完全脫落于培養(yǎng)基再輕輕吹打2-3次，使細胞盡可能處于單個懸浮狀態(tài)。7.取1或2個新的培養(yǎng)皿，然后將細胞培養(yǎng)基均勻的分到2或3個培養(yǎng)瓶〔注意原來傳代時使用的培養(yǎng)瓶可繼續(xù)傳代使用〕，進展1傳2或1傳3的培養(yǎng)。8.拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身2-3次，懸空進入培養(yǎng)基皿吸取5-10ml培養(yǎng)基懸空移入每個培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)皿蓋在酒精燈上消毒2-3次蓋上，在皿蓋上做好實驗標記。9.將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。10.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。注意整個培養(yǎng)箱底托盤一定要放高壓后的水，且定期更換確保無菌。每天定時觀察細胞生長情況，一般72-96h后，細胞生長密度大于90%，即可進展細胞的傳代或保株。五、細胞株的保存原理：細胞凍存最常用的技術是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護劑的緩慢冷凍法凍存細胞。細胞在不加任何保護劑的情況下直接冷凍，細胞外的水分會很快形成冰晶，從而引起一系列不良反響。如細胞脫水使局部電解質濃度增高，pH值改變，局部蛋白質由于上述原因而變性，引起細胞部空間構造紊亂，溶酶體膜由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶，使細胞構造成分造成破壞，線粒體腫脹，功能喪失，并造成能量代障礙。胞膜上的類脂蛋白復合體也易破壞引起細胞膜通透性的改變，使細胞容物喪失。如果細胞冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成細胞核DNA空間構型發(fā)生不可逆的損傷，而致細胞死亡。因此，細胞冷凍技術的關鍵是盡可能地減少細胞水分，減少細胞冰晶的形成。采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無明顯毒性。慢速冷凍方法又可使細胞的水分滲出細胞外，減少胞形成冰結晶的時機，從而減少冰晶對細胞的損傷。實驗步驟：選擇處于對數生長期的細胞，在凍存前一天最好換液。將多個培養(yǎng)瓶中的細胞培養(yǎng)液去掉，用0.25%胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶，參加少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中離心(1000r/min，10分鐘)。參加凍存管中，再參加1ml配置好的凍存液后放入梯度降溫盒，放入-80℃冰箱中。1.紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。2.培養(yǎng)液，胰酶，二甲基亞砜DMSO，胎牛血清〔解凍〕，梯度降溫盒恢復常溫，恒溫水浴箱37℃預熱20min，備用。3.將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈消毒后放于工作臺面，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側。4.將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，蓋放于酒精燈右側后將培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)液懸空倒進污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，豎直放好。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液，懸空移入培養(yǎng)瓶。5.將培養(yǎng)皿蓋口朝上放在架子上，將培養(yǎng)皿的培養(yǎng)液懸空倒進污缸。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1-2ml胰酶液，懸空沿皿壁參加培養(yǎng)皿。6.將培養(yǎng)皿來回傾倒使胰酶浸沒整個皿底的細胞層，計時越1-3min〔消化時間根據細胞不同時間不同〕，對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個細胞脫落，鏡下觀察到細胞都變圓時為胰酶消化的最適時機?！布僭O看到成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；假設看不到針孔樣縫隙和細胞脫落，或鏡下細胞多有菱角則需繼續(xù)消化〕。用移液器將胰酶吸凈。6.吸取1ml培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次，使貼壁細胞完全脫落于培養(yǎng)基再輕輕吹打2-3次，使細胞盡可能處于單個懸浮狀態(tài)。7.將懸浮細胞吸入15ml離心管，參加4ml培養(yǎng)基離心1000r/min，5min8.預先配制凍存液：10%DMSO+90%胎牛血清。按需要配置一定數量備用9.棄去培養(yǎng)基，用凍存液進展重懸混勻后，將1ml含有細胞的凍存液移入凍存管，擰緊瓶蓋，做好實驗標記。10.將培養(yǎng)基，胰酶瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。8.將凍存管先放于4℃冰箱30min后拿出放置-20℃冰箱過夜，次日再放于-80℃的冰箱3-4天，最后存放于-196℃的液氮灌長期保存?；蛑苯臃湃胩荻冉禍睾校湃?80℃冰箱過夜后最后存放于液氮罐?！蔡荻冉禍睾袨榧状迹褂?次需要更換，每次使用需做好標記，使用前需恢復常溫〕六、細胞轉染RNA干擾〔RNAinterference,RNAi〕:是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA〔double-strandedRNA，dsRNA〕誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現象。基因沉默，主要有轉錄前水平的基因沉默(TGS)和轉錄后水平的基因沉默(PTGS)兩類:TGS是指由于DNA修飾或染色體異染色質化等原因使基因不能正常錄;PTGS是啟動了細胞質靶mRNA序列特異性的降解機制。有時轉基因會同時導致TGS和PTGS。由于使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，〔長度超過三十的dsRNA會引起干擾素毒性〕所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領域。病毒基因、人工轉入基因、轉座子等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組，并利用宿主細胞進展轉錄時，常產生一些dsRNA。宿主細胞對這些dsRNA迅即產生反響。作用機制其胞質中的核酸切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和構造的小片段RNA〔大約21～23bp〕，即siRNA。siRNA在細胞RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體一些酶〔包括切酶、外切酶、解旋酶等〕結合形成RNA誘導的沉默復合物〔RNA-inducedsilencingple*，RISC)。RISC與外源性基因表達的mRNA的同源區(qū)進展特異性結合，RISC具有核酸酶的功能，在結合部位切割mRNA，切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細胞針對這些mRNA的降解反響。siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結合并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP〕作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用進一步放大，最終將靶mRNA完全降解。RNAi發(fā)生于除原核生物以外的所有真核生物細胞。需要說明的是，由于dsRNA抑制基因表達具有潛在高效性，任何導致正常機體dsRNA形成的情況都會引起不需要的相應基因寂靜。所以正常機體各種基因有效表達有一套嚴密防止dsRNA形成的機制。脂質體轉染原理：脂質體是磷脂分散在水中時形成的脂質雙分子層，又稱為人工生物膜。最初，人們只是運用脂質體模擬生物膜，研究膜的構造及功能，從而發(fā)現了膜的融合及吞作用，因而可用作外源物質進入細胞的載體陽離子脂質體外表帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用將DNA分子包裹人，形成DNA一脂復合體，也能被外表帶負電荷的細胞膜吸附，再通過膜的融合或細胞的吞作用，偶爾也通過直接滲透作用，將DNA傳遞進入細胞，形成包涵體或進入溶酶體其中一小局部DNA能從包涵體釋放，并進入細胞質中，再進一步進入核轉錄、表達DNA轉染步驟轉染前一天接種細胞于6孔板，0.5-2×105每孔，2ml無抗生素培養(yǎng)基每孔，第二天轉染時細胞到達90-95%每孔。轉染前半小時換Opti-MEM無血清培養(yǎng)基1.5ml。A液：DNA5ug參加245ulOpti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻。B液：脂質體使用前輕輕混勻，脂質體10ul參加245ulOpti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜止5min。B液參加A液，用槍輕輕混勻，室溫靜止20min。將混合液均勻分散慢慢滴加到6孔板細胞中，邊滴加變前后左右十字穿插搖晃。孵箱37℃培養(yǎng)48h〔轉染時間待定〕。第二天看細胞狀態(tài)來決定是否換液。同時設立細胞對照組，空白轉染組。siRNA轉染步驟轉染前一天接種細胞于6孔板〔40*104〕，2ml無抗生素培養(yǎng)基每孔，第二天轉染時細胞到達50-60%每孔。轉染前半小時換Opti-MEM無血清培養(yǎng)基1.5ml。A液：siRNA5ul〔共100pmol〕參加245ulOpti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻?！瞫iRNA按照說明書稀釋〕B液：脂質體〔RNAima*〕使用前輕輕混勻，脂質體10ul參加245ulOpti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜止5min。B液參加A液，用槍輕輕混勻，室溫靜止20min。將混合液均勻分散慢慢滴加到6孔板細胞中，邊滴加變前后左右十字穿插搖晃。孵箱37℃培養(yǎng)48h〔轉染時間待定〕。第二天看細胞狀態(tài)來決定是否換液。同時設立細胞對照組，空白轉染組。使用RNAiMA*和AGScell用于siRNA在6孔板上進展轉染實驗提前配制