15第十五章β-內(nèi)酰胺類抗生素2已

第一節(jié)概述第二節(jié)青霉素第三節(jié)頭孢菌素第四節(jié)其他重要的β—內(nèi)酰胺類抗生素第十五章β—內(nèi)酰胺類抗生素抗生素是青霉素、鏈霉素、紅霉素等一類化學(xué)物質(zhì)的總稱。是生物在生命活動過程中產(chǎn)生的，在卑微濃度下有選擇性地抑制或殺滅其他種生物機(jī)能的有機(jī)物質(zhì)。具有抗菌、抗腫瘤、殺蟲除草、抑制生物體中某些酶類的作用，有些還具有某些藥理活性，如強(qiáng)力霉素——鎮(zhèn)咳；新霉素——降膽固醇抗生素概述抗生素的生產(chǎn)方法生產(chǎn)主要采用微生物發(fā)酵法，屬于次級代謝產(chǎn)物，少數(shù)如氯霉素、磷霉素亦可用化學(xué)合成法生產(chǎn)。

抗生素概述半合成抗生素將生物合成法制得的抗生素用化學(xué)或生化方法引入特定的功能基團(tuán)進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)改造而制成各種衍生物增強(qiáng)抗菌力擴(kuò)大抗菌譜對耐藥菌有效便于口服減低毒副作用改善藥理性質(zhì)、提高生物有效性抗生素概述抗生素的生物來源放線菌：鏈霉菌、諾卡氏菌屬、小單孢菌屬真菌：青霉菌屬、頭孢菌屬、擔(dān)子菌細(xì)菌：多粘桿菌、枯草桿菌、芽孢桿菌植物或動物：蒜蒜素；動物臟器魚素抗生素概述抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)的分類

-內(nèi)酰胺類：青霉素類、頭孢菌素類，包含一個四元內(nèi)酰胺環(huán)氨基糖苷類：鏈霉素、慶大霉素，既含有氨基糖苷，也含有氨基環(huán)醇大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素、麥迪加霉素，含有一個大環(huán)內(nèi)酯作配糖體，以苷鍵和1-3個分子的糖相連四環(huán)類：四環(huán)素、土霉素，以四并苯為母核多肽類：多粘菌素、桿菌肽，含有多種氨基酸，經(jīng)肽鍵縮合成線狀、環(huán)狀或帶側(cè)鏈的環(huán)狀多肽抗生素概述抗生素的作用的分類廣譜抗生素：氨芐青霉素抗革蘭氏陽性菌抗生素：青霉素抗革蘭氏陰性菌抗生素：鏈霉素抗真菌抗生素：制霉菌素抗病毒抗生素：四環(huán)類抗生素抗癌抗生素：阿霉素抗生素概述抗生素的作用機(jī)制抑制細(xì)胞壁合成：青霉素、頭孢菌素影響細(xì)胞膜功能：多烯類抗生素抑制病原菌蛋白質(zhì)合成：四環(huán)素抑制核酸合成：絲裂霉素C抗生素概述我國抗生素工業(yè)的開展我國1953年設(shè)計(jì)制造了4個5噸發(fā)酵罐，建立上海第三制藥廠，開始生產(chǎn)青霉素1957年建立華北制藥廠經(jīng)40多年來開展，國外有的根本抗生素品種我國都有生產(chǎn)，并已研制出國外沒有的抗生素——創(chuàng)新霉素等截止1996年上半年，總計(jì)127個品種生產(chǎn)，總產(chǎn)量近幾年3萬噸，約占世界抗生素產(chǎn)量的1/4。農(nóng)用抗生素研究生產(chǎn)也獲得了可喜的成績，滅瘟素、春日霉素和有效霉素等?？股馗攀鑫覈股禺a(chǎn)品種類齊全。在抗生素/抗菌素領(lǐng)域，我國具有一定的優(yōu)勢的是青霉素、四環(huán)素、氯霉素、土霉素、鏈霉素、螺旋霉素以及磺胺類產(chǎn)品，其中青霉素規(guī)模最大，我國青霉素年產(chǎn)量超過2.2萬噸，約占全球市場的70%，2002年出口額達(dá)1.59億美元，我國青霉素生產(chǎn)根本上集中于華藥、哈藥、石藥和魯抗四家，四家產(chǎn)量占國內(nèi)青霉素總產(chǎn)量的75%?？股馗攀鲆弧⒏艣r第一節(jié)概述1929:Fleming在葡萄球菌培養(yǎng)皿中，污染的霉菌周圍出現(xiàn)透明的抑菌圈。殺菌物質(zhì)，斷言太不穩(wěn)定，無法別離并用作藥物。1939：牛津病理家HowardFlorey化學(xué)家ErnstChain,NormanHeatley。發(fā)酵瓶培養(yǎng)霉菌，培養(yǎng)里提取，測活性，青霉素結(jié)晶。1940:8只鼠注射鏈球菌，提取物對4只治療。未經(jīng)治療鼠在24小時內(nèi)死亡，治療鼠存活數(shù)天至數(shù)周。1941年2月開始治療第一批人類病人。1943：威斯康辛大學(xué)小組，取得突破生產(chǎn)菌外表培養(yǎng)：幾十個單位。深層培養(yǎng)產(chǎn)黃青霉：100U/ml。X、UV誘變育種：1000－1500U/ml。不產(chǎn)色素變種：66000－70000U/ml目前：85000U/ml。一、概況β—內(nèi)酰胺類抗生素：含有β-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素青霉素類，頭孢菌素類、硫霉素類、頭霉素類、單環(huán)β－內(nèi)酰胺類目前品種最多、使用最廣泛的抗生素第一節(jié)概述分子結(jié)構(gòu)及衍生物如6-氨基青霉烷酸〔6-APA〕：側(cè)鏈基團(tuán)不同，形成不同的青霉素G：芐基青霉素，C6H5CH2-CO-，為主雙氫霉素F：戊青霉素X：對羥芐基青霉素F：2-戊烯基青霉素K：庚青霉素V：苯氧甲基青霉素產(chǎn)品：鈉、鉀、普魯卡因、二芐基乙二胺β-Lactams青霉素類頭孢菌素類頭霉素類碳青霉烯類單環(huán)β-內(nèi)酰胺類氧頭孢烯類

結(jié)構(gòu)中都含β-內(nèi)酰胺環(huán)，為抗菌活性之關(guān)鍵。

通過改造6-APA或7-ACA獲得大量各具特點(diǎn)的抗生素。第一節(jié)概述一、概況β－Lactamring6-AminoPenicillanic

Acidβ－LactamasePenicillinase7-氨基頭孢烷酸7-AminoCephalosporanicAcid一、概況青霉素sosc青霉素及半合成青霉素類

青霉素類

2-烯

O代S青霉烯類氧青霉烷類C代S

碳青霉烯類二、作用機(jī)制1.與細(xì)菌胞膜上青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)結(jié)合，阻礙細(xì)胞壁肽聚糖合成，使胞壁缺損，菌體膨脹裂解。2.激活細(xì)菌自溶酶。第一節(jié)概述三、臨床應(yīng)用的主要β—內(nèi)酰胺類抗生素青霉素類：①天然青霉素〔青霉素G、青霉素Ⅴ〕②側(cè)鏈改造〔氨芐青霉素、羥氨芐青霉素等〕頭孢菌素類：①天然頭孢菌素〔頭孢菌素C、頭霉素C〕②半合成衍生物〔頭孢克羅、頭孢西丁等〕碳青霉烯類：①天然〔噻納霉素等〕②衍生物〔亞胺青霉烯等〕單環(huán)β-內(nèi)酰胺類：①天然〔單菌胺類〕②衍生物〔氨曲南等〕第一節(jié)概述一、天然青霉素〔主要有五種：G、V、X、N、K，臨床常用G和V〕青霉素G：不耐酸，不耐酶青霉素Ⅴ：耐酸，不耐酶，抗菌同G，活性較弱工業(yè)上，用固定化青霉素?；杆釭或V來制備6-氨基青霉烷酸6-APA，再用化學(xué)或酶法添加側(cè)鏈，獲得半合成青霉素。第二節(jié)青霉素二、菌種改進(jìn)與保存〔一〕菌種改進(jìn)：點(diǎn)青霉〔固〕→產(chǎn)黃青霉〔漂浮〕→70年代前誘變和隨機(jī)篩選→據(jù)合成途徑理性化篩選→原生質(zhì)體誘變選育→基因工程技術(shù)育種?，F(xiàn)世界工業(yè)發(fā)酵水平達(dá)85000u/mL〔二〕菌株保存①真空冷凍枯燥：分生孢子②甘油等懸浮-70℃或液氮：分生孢子或菌絲第二節(jié)青霉素青霉素生產(chǎn)菌株原生質(zhì)體誘變選育與生產(chǎn)應(yīng)用1992年，石家莊制藥集團(tuán)河北中潤制藥〔原河北制藥廠〕生產(chǎn)菌株發(fā)酵效價和發(fā)酵指數(shù)低的問題。對青霉素生產(chǎn)菌——產(chǎn)黃青霉進(jìn)行了原生質(zhì)體連續(xù)誘變，選育出了高產(chǎn)菌株。按照方案，生產(chǎn)菌株JS94-18為初發(fā)株→原生質(zhì)體誘變篩選JS94-18-58。1994年應(yīng)用于生產(chǎn)，50噸發(fā)酵罐發(fā)酵203小時平均發(fā)酵單位49310u/ml，最高為53000u/ml，平均發(fā)酵指數(shù)為2.75Bu/h·m3。發(fā)酵單位和發(fā)酵指數(shù)分別比原生產(chǎn)菌株提高了10.40%、11.79%。第二節(jié)青霉素第二次以JS94-18-58為初發(fā)菌株→原生質(zhì)體誘變等→H94-9-61菌株。菌落和菌絲形態(tài)發(fā)生了明顯變化，新菌株菌落凸起、呈偏口狀、菌褶增加，菌絲短粗、菌隔增多。1996年應(yīng)用于生產(chǎn)，203小時平均發(fā)酵單位為52515u/ml，比JS94-18-58菌株提高了6.5%；發(fā)酵指數(shù)為3.05，比JS94-18-58菌株提高了10.91%。同時H94-9-61菌株對糖、氮的利用率高，對發(fā)酵液溶氧需求大大下降，增加了生產(chǎn)效率。1996年之后，生產(chǎn)上一直使用H94-9-61菌株。隨著菌種的進(jìn)一步別離純化和生產(chǎn)工藝的優(yōu)化，使生產(chǎn)發(fā)酵單位穩(wěn)定在56000-58000u/ml，發(fā)酵指數(shù)3.1-3.2。新菌株H94-9-61的應(yīng)用，大大提高了生產(chǎn)效率，為企業(yè)新增加經(jīng)濟(jì)效益上億元。第二節(jié)青霉素二、菌種改進(jìn)與保存利用基因工程技術(shù)對新生產(chǎn)菌種進(jìn)行了改造，大幅度提高了菌種的生產(chǎn)性能，通過120噸發(fā)酵罐生產(chǎn)應(yīng)用，發(fā)酵效價和發(fā)酵指數(shù)均提高到新水平。新菌種屬于絲狀菌，菌落直徑較小，凸起較高，菌褶增多。該菌種產(chǎn)抗生素能力強(qiáng)，效價增長較快，165～170小時效價可到達(dá)60000u/mL，192小時效價可到達(dá)70000u/mL以上〔最高生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)罐到達(dá)80000u/mL〕。新菌種平均發(fā)酵效價到達(dá)70000u/mL以上、發(fā)酵指數(shù)平均到達(dá)4.0Bu/h·m3以上〔最高生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)罐到達(dá)4.6億/小時·立方米〕，該菌種的生產(chǎn)本錢大幅度的下降，是目前青霉素發(fā)酵生產(chǎn)最為理想的菌種之一。第二節(jié)青霉素二、菌種改進(jìn)與保存我國青霉素的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、臨床效果可以說根本上已與世界頂尖企業(yè)接軌，青霉素的產(chǎn)量已在國際市場上占到60％的份額，再加上價格優(yōu)勢，中國產(chǎn)品的競爭優(yōu)勢自然不言而喻。同時，我們也應(yīng)當(dāng)注意到，我國青霉素工業(yè)菌種的發(fā)酵能力，發(fā)酵指數(shù)和生產(chǎn)本錢與國外企業(yè)相比還有很大差距，國外工業(yè)菌株發(fā)酵能力約是我國的1.8倍，其發(fā)酵本錢僅占售價的25%，而我國發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)本錢占到售價的50%—60%。這使得我國發(fā)酵產(chǎn)品的利潤空間和發(fā)酵工業(yè)的贏利能力遠(yuǎn)低于國外同類企業(yè)。我國更多是以規(guī)模生產(chǎn)在國際市場參與競爭。第二節(jié)青霉素二、菌種改進(jìn)與保存〔三〕青霉素生產(chǎn)菌的生物學(xué)特性產(chǎn)黃青霉：Penicilliumchrosogenum孢子：綠色和黃色菌落：平坦或皺褶，圓形。青霉穗：分生孢子鏈狀深層培養(yǎng)菌絲：球狀和絲狀兩種。發(fā)酵培養(yǎng)下的生長過程及細(xì)胞學(xué)變化第1期：分生孢子萌發(fā)，具有小泡。第2期：菌絲繁殖，嗜堿性，類脂肪小顆粒。第3期：脂肪包涵體，貯藏物，嗜堿性很強(qiáng)。第4期：空泡，嗜堿性減弱，開始產(chǎn)生抗生素。第5期：大空泡，中性染色大顆粒，脂肪包涵體消失，青霉素產(chǎn)量最高。第6期：個別細(xì)胞自溶，胞內(nèi)無顆粒，釋放氨，pH上升。第7期：菌絲完全自溶，僅有空細(xì)胞壁。鏡檢控制規(guī)定時間取樣，顯微鏡觀察7個時期的態(tài)變化，控制發(fā)酵。1－4期為菌絲生長期，3期的菌體適宜種子。4－5期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強(qiáng)，通過工程措施，延長此期，獲得高產(chǎn)。第6期到來之前結(jié)束發(fā)酵。三、青霉素發(fā)酵生產(chǎn)〔一〕流程及工藝要點(diǎn)冷凍枯燥孢子→瓊脂斜面→米孢子→種子罐→發(fā)酵罐→過濾→青霉素回收

第二節(jié)青霉素消沫劑補(bǔ)料C、N及前體菌絲體豐富的孢子大量健壯的菌絲體生長階段：使菌絲快速生長生產(chǎn)階段：用糖控制最低比生長速率，有利于青霉素大量合成發(fā)酵工藝過程1、生產(chǎn)孢子制備工序斜面種子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成的固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)米孢子：移植到小米或大米固體培養(yǎng)基上，生長7天，25℃注意：每批孢子必需進(jìn)行嚴(yán)格搖瓶試驗(yàn)，測定效價及雜菌情況。2、種子罐培養(yǎng)工藝一級種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲。培養(yǎng)基：葡萄糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫劑等?？諝饬髁?：3〔體積比〕；300-350r/min；pH自然，溫度27±1℃,40h二級種子罐：繁殖罐，大量繁殖。接種量10％培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿，玉米油，消沫劑等。1:1-1.5；250-280r/min；pH自然，25±1℃。10-14h質(zhì)量：菌絲致密，菌絲粗壯，III期，倍增期6-8h發(fā)酵工藝過程3、生產(chǎn)罐培養(yǎng)工藝三級罐：生產(chǎn)罐；接種量20％培養(yǎng)基：花生餅粉，葡萄糖，尿素，硝酸銨，硫代硫酸鈉，苯乙酰胺，CaCO3,玉米油,硅油。參數(shù)條件：通氣量1:0.8-1.2；150-200r/min；前60小時：pH6.4-6.6，26℃；60小時后：pH6.7，24℃。發(fā)酵工藝過程4、發(fā)酵培養(yǎng)與過程控制操作方式：反復(fù)分批式發(fā)酵發(fā)酵罐：100M3，裝料80M3.帶放:6-10次，帶放量10％，間隔24h。發(fā)酵周期：180-220h發(fā)酵工藝過程〔1〕過程控制——補(bǔ)料分批操作控制基質(zhì)濃度前40小時：培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)物40小時后：低速連續(xù)補(bǔ)加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，維持一定的最適濃度。半饑餓狀態(tài)：延長合成期，提高產(chǎn)量。碳源占本錢12％以上，采用糖化液流加，降低本錢。糖與6APA結(jié)合形成糖基-6APA，影響青霉素產(chǎn)量。流加碳源控制根據(jù)殘?zhí)?、pH、尾氣中CO2和O2含量。葡萄糖的波動范圍較窄，濃度過低使抗生素合成速度減慢或停止，過高那么導(dǎo)致呼吸活性下降，甚至引起自溶。殘?zhí)?.3-0.6％左右，pH開始升高時流加糖。濃度：500kg/M3，流速:1.0-2.5kg/M3.h過程控制流加氮源控制玉米漿:最好，含有多種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。補(bǔ)加無機(jī)氮源：硫酸銨、氨水、尿素氨基氮濃度：0.01-0.05%。鹽離子控制無機(jī)鹽：硫、磷、鎂、鉀等。鐵對青霉素合成有毒，30-40μg/mL以下。罐壁涂環(huán)氧樹脂保護(hù)層。〔2〕添加青霉素側(cè)鏈前體時期：合成階段種類：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸毒性：抑制細(xì)胞生長和青霉素合成。策略：低濃度流加濃度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.05-0.08%控制：保持供給速率略大于生物合成需要?！?〕溫度控制適宜菌絲生長溫度30℃，分泌青霉素20℃。20℃青霉素破壞少，周期很長。變溫控制，不同階段不同溫度。生長階段:較高溫度，縮短生長時間；生產(chǎn)階段適當(dāng)降低溫度，以利于青霉素合成。前期控制26℃左右，后期降溫控制24℃〔4〕pH控制合成適宜pH6.4－6.6左右，防止超過7.0直接加酸或堿：自動控制pH下降：補(bǔ)加CaCO3、通氨、尿素或提高通氣量pH上升：補(bǔ)加糖、生理酸性物質(zhì)〔硫酸銨、油脂〕〔5〕溶氧控制假設(shè)＜30％飽和度，產(chǎn)率急劇下降；假設(shè)＜10％，造成不可逆的損害。臨界溶氧濃度：30％。通氣比：1：0.8－1.5。適宜的攪拌速度:保證氣液混合，提高溶氧調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速:各階段的生長和耗氧量不同?！?〕消沫天然油脂：玉米油；化學(xué)消沫劑：泡敵。策略：少量屢次。注意：前期不宜多參加，影響呼吸代謝?！捕秤绊懬嗝顾匕l(fā)酵產(chǎn)率的因素環(huán)境變量：①基質(zhì)濃度②溫度③pH④溶氧生理變量：⑤菌絲濃度⑥菌絲生長速度⑦菌絲形態(tài)①基質(zhì)濃度：由于〔葡萄糖、銨、苯乙酸〕產(chǎn)生阻遏或抑制，故采用流加補(bǔ)料分批發(fā)酵。②溫度：生長最適30℃，生產(chǎn)25℃。③pH：最適6.5，盡量≯7.0④溶氧：一般溶氧濃度≮30%，但過高說明菌絲生長不良或加糖率過低等?？勺鳛檠a(bǔ)料的參考指標(biāo)。第二節(jié)青霉素〔二〕影響青霉素發(fā)酵產(chǎn)率的因素⑤菌絲濃度：傳氧速率〔OTR〕與攝氧速率〔OUR〕相平衡時的菌體濃度—臨界菌體濃度。使≯此值，但臨界菌體濃度可提高。⑥菌絲生長速度：臨界比生長率青霉素：μc=0.015/h，依此，46h菌濃應(yīng)翻番，但與實(shí)際有別⑦菌絲形態(tài)：絲狀：與基質(zhì)、氧充分接觸，生產(chǎn)率高，應(yīng)保持適當(dāng)長度，防結(jié)球結(jié)球：粘度小，氣/液間傳氧率高，臨界菌體濃度高，生產(chǎn)率甚至高于前者第二節(jié)青霉素比生長速率μ，1/h相對比生產(chǎn)速率0.010.02μc1.0青霉素發(fā)酵菌種(strain)：產(chǎn)黃青霉菌(Penicilliumchrysogenum)孢子培養(yǎng)(sporecultivation)：25oC,6-7d種子培養(yǎng)(seedcultivation)：25oC，2-3d發(fā)酵培養(yǎng)(fermentation)：22-26oC,6-7d加糖控制(sugarfeeding)：殘?zhí)墙抵?.6％補(bǔ)氮(nitrogenfeeding)：氨控制在0.01-0.05％前體(precursor)：剩余苯乙酰胺0.05-0.08％溫度控制(temperature)：前期25-26oC后期23oC通氣與攪拌(aeration&stir)：1:0.8VVM泡沫(foam)：天然油脂,如豆油四、青霉素的生物合成與理論生產(chǎn)得率〔該局部自學(xué)〕第二節(jié)青霉素頭孢菌素C是繼青霉素之后在自然界發(fā)現(xiàn)的又一類重要的β－內(nèi)酰胺抗生素。迄今，通過化學(xué)改造，已制備出數(shù)以千計(jì)的半合成頭孢菌素化合物，其中已有數(shù)十種在市場供給，是目前世界上銷售額最大的抗生素之一。第三節(jié)頭孢菌素C頭孢菌素C

頭孢菌素C〔天然頭孢菌素中活性最強(qiáng)的〕結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

ABα-氨基己二酸（單酰—-胺）7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）α-氨基己二酸—β內(nèi)酰胺—?dú)浠玎骸阴Ｑ跫谆?、生物合成與代謝調(diào)控(一)生物合成概述頭C也是由α-氨基己二酸、半胱氨酸和纈氨酸經(jīng)三肽途徑生物合成的，而且，在異青霉素N以前的階段和青霉素的生物合成完全一樣。此后，經(jīng)頂頭孢霉產(chǎn)生的異構(gòu)酶作用，將異青霉素N轉(zhuǎn)化為青霉素N，再由擴(kuò)環(huán)酶催化擴(kuò)環(huán)生成脫乙酰氧頭孢菌素C，最后通過羥化和轉(zhuǎn)乙酰基反響得到頭孢菌素C。第三節(jié)頭孢菌素C(二)頂頭孢霉的硫代謝硫可以通過兩種途徑由頂頭孢霉攝入頭孢菌素C分子：一種是和青霉素發(fā)酵一樣的硫酸鹽復(fù)原途徑，另一種是蛋氨酸的逆轉(zhuǎn)硫途徑。野生頂頭孢霉菌株不能利用硫酸鹽，故只能以蛋氨酸為基質(zhì)。主要通過逆轉(zhuǎn)硫途徑提供硫。通過突變篩選獲得的能有效利用硫酸鹽的工業(yè)生產(chǎn)菌株，可在不加蛋氨酸的情況下高效地合成頭孢菌素C。第三節(jié)頭孢菌素C(二)頂頭孢霉的硫代謝

第三節(jié)頭孢菌素CSO42-(三)生物合成中的調(diào)控反響葡萄糖等快速利用的碳源阻遏頭孢菌素C的生物合成。較高葡萄糖濃度→青霉素N積累增加而頭孢菌素C產(chǎn)率↓，說明葡萄糖主要阻遏擴(kuò)環(huán)酶的生成。葡萄糖接近耗盡時，頭孢菌素C才大量合成。碳源限制流加補(bǔ)料發(fā)酵可顯著提高頭孢菌素C的產(chǎn)率。在分批和補(bǔ)料分批發(fā)酵中，用代謝慢的植物油做碳源也可以防止碳源阻遏。第三節(jié)頭孢菌素C(三)生物合成中的調(diào)控反響頂頭孢霉發(fā)酵液中存在乙酰酯酶，能將頭孢菌素C水解生成脫乙酰頭孢菌素C〔抗菌活性很弱〕。且影響頭C的別離和提純。對于某些菌株，碳源的存在可抑制乙酰酯酶的活性，故在發(fā)酵液中保持一定的碳源濃度對于防止頭C的水解是一個決定性因素。另外，防止發(fā)酵過程中溫度和pH的異常升高，對減少脫乙酰頭孢菌素C的生成有一定作用。第三節(jié)頭孢菌素C二、菌種選育與保存頂頭孢霉M8650—工業(yè)生產(chǎn)的原始親株，幾乎所有高產(chǎn)菌株都是由它反復(fù)誘變、篩選得到。①誘變→蛋氨酸營養(yǎng)缺陷株→轉(zhuǎn)入用含硫化合物(如硫酸鹽)代替蛋氨酸的根本培養(yǎng)基→篩選不需要蛋氨酸的高產(chǎn)突變株，降低發(fā)酵本錢。②原生質(zhì)體融合也是高產(chǎn)菌株選育的一種有效方法。③用現(xiàn)代基因工程技術(shù)構(gòu)建含克隆的擴(kuò)環(huán)／羥化酶基因的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)人工業(yè)生產(chǎn)菌株中，獲得顯著提高頭孢菌素C生產(chǎn)能力的基因工程菌。第三節(jié)頭孢菌素C遺傳改進(jìn)后的頂頭孢霉，平板上的菌落直徑縮小(10～15mm→3～5mm)、顏色變淺；生孢子能力有退化的趨勢，不利于保存。用原生質(zhì)體融合育種，可改善菌株的孢子生成狀況。菌株的保存：采用冷凍枯燥法或液氮法保存營養(yǎng)菌絲。經(jīng)長期保存后，生命力的恢復(fù)較差，故應(yīng)對其進(jìn)行復(fù)壯，恢復(fù)菌株生命力和生產(chǎn)能力。三、發(fā)酵過程優(yōu)化(一)培養(yǎng)基沒有一種普遍適用的一成不變配方，在每個新菌株用于生產(chǎn)之前，都必須對培養(yǎng)基進(jìn)行再優(yōu)化試驗(yàn)。氮源：玉米漿〔優(yōu)良氮源，含豐富的氨基酸、肽、蛋白質(zhì)和微量元素，起始用量一般為2～6g(N)／L〕。其他氮源有花生餅粉、硫酸銨、氨、尿素等。當(dāng)根底培養(yǎng)基中的氮源消耗到一定程度時，要不斷補(bǔ)入硫酸銨或氨，以維持發(fā)酵液中銨氮含量在0.5～0.7g／L之間。補(bǔ)氨還能起到控制pH的作用(一般在6～7之間)。第三節(jié)頭孢菌素C(一)培養(yǎng)基碳源：葡萄糖、糊精、淀粉或植物油。植物油通常作為流加碳源，而其他參加根底培養(yǎng)基中。玉米漿中所含的有機(jī)酸可以作為前期菌絲生長的優(yōu)良碳源。假設(shè)流加豆油，放置使卵磷脂沉淀后再使用為好。其他：通常還要添加無機(jī)鹽以滿足菌絲生長對Mg2+、PO43-等的需要。蛋氨酸。頭孢菌素C發(fā)酵過程的典型物質(zhì)消耗如下：

物質(zhì)名稱消耗量，kg／m3發(fā)酵液物質(zhì)名稱消耗量，kg／m3發(fā)酵液氧80~160豆油70~130

糖30~120

玉米漿50~75

無機(jī)鹽17~23氨10~20表15—5頭孢菌素c發(fā)酵過程的物質(zhì)消耗三、發(fā)酵過程優(yōu)化(二)通氣與攪拌在頭孢菌素C發(fā)酵中要求較高的氧傳遞速率，溶氧濃度≮25％飽和度。原因：三肽的環(huán)化、青霉素N的擴(kuò)環(huán)和脫乙酰氧頭孢菌素C的羥化都是氧化反響。攪拌輸入功率為4kW／m3(發(fā)酵液)以上。嚴(yán)格控制油的流加〔碳源；增加氧傳遞阻力〕，使溶氧始終保持在25％飽和度以上。三、發(fā)酵過程優(yōu)化(三)菌絲生長速率用葡萄糖作為生長限制基質(zhì)進(jìn)行的恒化器實(shí)驗(yàn)說明，菌絲比生長率與抗生素比生產(chǎn)率成反比。但用豆油作為生長限制基質(zhì)時，比生長率那么與比生產(chǎn)率成正比；比生長率由0.01／h提高到0.04／h，比生產(chǎn)率增加到2倍。因此，在前一種情況下，與其說是生長率的影響，不如說是葡萄糖的碳源調(diào)控在起作用。三、發(fā)酵過程優(yōu)化

(四)菌絲形態(tài)

在頭孢菌素C發(fā)酵過程中，產(chǎn)生菌頂頭孢霉呈現(xiàn)明顯的形態(tài)分化。形態(tài)分化是頭孢菌素C生物合成啟動的關(guān)鍵要素。在快速生長期，菌體以細(xì)長的絲狀為主；隨著營養(yǎng)的消耗和比生長率的下降，菌絲開始膨脹、斷裂，最后形成單細(xì)胞的節(jié)孢子。節(jié)孢子可發(fā)育成新的菌絲，產(chǎn)生新的生長循環(huán)。第三節(jié)頭孢菌素C三、發(fā)酵過程優(yōu)化

(四)菌絲形態(tài)

節(jié)孢子arthrospore菌絲生長到一定階段，長出許多橫隔，然后從橫隔處斷裂，產(chǎn)生許多單個孢子，即節(jié)孢子，又稱粉孢子。具有進(jìn)行繁殖和擺脫不適宜的環(huán)境的作用。常見于放線菌類和擔(dān)子菌類的氣生菌絲。第三節(jié)頭孢菌素C三、發(fā)酵過程優(yōu)化

(四)菌絲形態(tài)

圖15—14說明，在菌株選育過程中，隨著菌株生產(chǎn)能力的提高，形成節(jié)孢子的能力呈增加的趨勢。頭孢菌素C效價,μg／mL圖15—14C．a(chǎn)cremonium菌株形成節(jié)孢子能力與頭孢菌素C生產(chǎn)能力的關(guān)系節(jié)孢子，％三、發(fā)酵過程優(yōu)化(五)發(fā)酵終點(diǎn)應(yīng)根據(jù)產(chǎn)率、產(chǎn)物組成、本錢、效益、過濾速度等各方面的情況，綜合考慮，把握發(fā)酵終點(diǎn)，以達(dá)最大生產(chǎn)效益。①頭孢菌素C是不穩(wěn)定的化合物，存在非酶降解，且頭孢菌素C濃度↑，絕對降解量逐漸↑；②乙酰酯酶轉(zhuǎn)化頭孢菌素C為脫乙酰頭孢菌素C。③發(fā)酵時間的延長，菌絲自溶，發(fā)酵液難以過濾。四、7-氨基頭孢烷酸7-ACA的酶法制備與直接發(fā)酵生產(chǎn)頭孢菌素C通過兩個酶，即D-氨基酸氧化酶及戊二酰7-ACA酰化酶的作用，可以生成7-ACA。1990年?中國科學(xué)報?報導(dǎo)了中國科學(xué)院植物生理研究所，以頭孢菌素C為原料，二步酶法制備7-ACA獲得成功。第三節(jié)頭孢菌素C四、7-ACA的酶法制備與直接發(fā)酵生產(chǎn)(一)7-ACA的酶法制備

D-氨基酸氧化酶乙醛酸,Cu2+和吡啶脫氨反應(yīng)頭孢烯酸(GL-7-ACA)假單胞菌(Pseudo-monasGK-16)GL-7-ACA?；?-ACA第一步反應(yīng)可直接用頭孢菌素C發(fā)酵液進(jìn)行，反應(yīng)生成的GL-7-ACA需提取和部分精制，才用于第二步反應(yīng)。頭孢菌素C

三角酵母(Trigonopsisvariabilis)(一)7-ACA的酶法制備

第二步:GL-7-ACA?；赣藐庪x子樹脂為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，制成固定化酶，在溫度15～25℃、pH7.5～8.5下進(jìn)行酰化反響7-ACA可以用等電點(diǎn)結(jié)晶法精制。

(二)7-ACA的直接發(fā)酵生產(chǎn)假單胞菌SE83(PseudomonasSE83)和缺陷假單胞菌(PseudomonasdiminutaV22)能產(chǎn)生直接水解頭孢菌素C生成7-ACA的酰化酶。將這一?；富蚩寺〉筋^孢菌素C產(chǎn)生菌中，使該菌在產(chǎn)生頭孢菌素C的同時，將局部頭孢菌素C脫酰基生成7-ACA，從而開創(chuàng)了直接發(fā)酵生產(chǎn)7-ACA的一種可能途徑。1986年日本有了一步酶法制備7-ACA的專利申請。第四節(jié)其他重要的β-內(nèi)酰胺抗生素一、頭霉素C頭霉素與頭孢菌素具有相同的母核，故有時也歸入頭孢菌素類。它們的主要區(qū)別在于頭霉素在7α位上有一個甲氧基，從而增加了β-內(nèi)酰胺環(huán)的穩(wěn)定性，使其能夠耐受β-內(nèi)酰胺酶。

第四節(jié)其他重要的β-內(nèi)酰胺抗生素一、頭霉素C(一)產(chǎn)生菌

頭霉素C主要由內(nèi)酰胺諾卡氏菌(Nocardialactamdurans)和克拉維鏈霉菌(Strepto—mycesclavuligerus)生產(chǎn)。第四節(jié)其他重要的β-內(nèi)酰胺抗生素一、頭霉素C(二)生物合成與代謝調(diào)控和青霉素及頭孢菌素一樣，頭霉素C也是由α-氨基己二酸、半胱氨酸和纈氨酸經(jīng)三肽途徑生物合成的。圖15-17說明了頭霉素C分子各局部的代謝來源。擴(kuò)環(huán)反響是頭霉素C生物合成的限速階段。甘油阻遏擴(kuò)環(huán)酶的生成但不抑制其活性，而糖酵解途徑磷酸化中間產(chǎn)物葡萄糖-6-磷酸和果糖-1，6-二磷酸強(qiáng)烈抑制該酶的活性。因此，葡萄糖、麥芽糖和甘油的過量參加都將降低頭霉素C的發(fā)酵產(chǎn)量。第四節(jié)其他重要的β-內(nèi)酰胺抗生素一、頭霉素C(二)生物合成與代謝調(diào)控

過量磷酸鹽阻遏三肽合成酶和擴(kuò)環(huán)酶的生成，并抑制環(huán)化酶和擴(kuò)環(huán)酶的活性。10～25mol／m3的磷酸鹽支持一定量的產(chǎn)生菌生長，且適合于抗生素合成；低于10mol／m3，產(chǎn)生菌的生長和抗生素合成都將受到限制；大于25mol／m3時，生長進(jìn)一步增加，而抗生素產(chǎn)量呈下降趨勢。過量的NH4+阻遏三肽合成酶、環(huán)化酶和擴(kuò)環(huán)酶的生成，而對這些酶的活性沒有明顯影響。賴氨酸及Fe2+對頭霉素C的生物合成有刺激作用。第四節(jié)其他重要的β-內(nèi)酰胺抗生素一、頭霉素C(三)發(fā)酵生產(chǎn)

發(fā)酵