印楝油的毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)

印楝油的毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)

因此，印度-巴基斯坦次大陸和南亞-南亞干旱地區(qū)的木本植物也被稱(chēng)為印度-巴基斯坦。由于印楝全身是寶,被美國(guó)國(guó)家研究委員會(huì)稱(chēng)之為“解決全球問(wèn)題之樹(shù)”、“天然藥庫(kù)”。印楝還被國(guó)際上認(rèn)為是最有潛力的殺蟲(chóng)植物,并被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織、亞太經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展委員會(huì)、國(guó)際林聯(lián)等推薦為東亞、南亞和非洲的優(yōu)先發(fā)展樹(shù)種。印楝油(neemoil)是印楝樹(shù)的種子提取物。印楝油有3種傳統(tǒng)制備方法,隨著現(xiàn)代提取技術(shù)的發(fā)展,出現(xiàn)了一種新型的提取方法,即采用CO2超臨界流體從印楝種仁中提取印楝油,此法能獲得較多的油脂和三萜類(lèi)化合物。印楝油含有7種化學(xué)成分,主要為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸及其甲酯,含量最多的成分為18-碳酸甲酯。印楝油在南亞及東南亞地區(qū)被用作民間醫(yī)藥使用已有2000多年的歷史,常用于麻風(fēng)病、腸道蠕蟲(chóng)病、呼吸系統(tǒng)疾病、便秘、血液疾病、風(fēng)濕病、膽道感染、潰瘍、子宮炎、牙齦炎、搔癢和慢性皮膚病等疾病的治療?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,印楝油具有多種生物學(xué)活性,如抗寄生蟲(chóng)、抗微生物、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗?jié)兒痛龠M(jìn)傷口愈合等。目前對(duì)印楝油毒理學(xué)方面的研究相關(guān)報(bào)道極少,僅見(jiàn)于殷中瓊報(bào)道了印楝油的氯仿提取物作為抗生育劑,屬無(wú)毒類(lèi)抗生育藥。隨著對(duì)印楝油藥理作用研究的深入,需要對(duì)印楝油的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià),以便為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。為此,筆者進(jìn)行了印楝油對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)和蓄積毒性研究。1材料和方法1.1試驗(yàn)藥物印楝油由成都綠金公司惠贈(zèng),通過(guò)超臨界CO2萃取所得,純度在99.9%以上。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用性成熟昆明種小鼠,體重為18~22g,用常規(guī)方式飼養(yǎng),自由采食。購(gòu)于原四川醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。1.3小鼠的急性毒性試驗(yàn)采用改良寇氏法測(cè)定印楝油對(duì)小鼠的經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)的LD50。取50只小鼠隨機(jī)分為5組,每組10只,雌、雄各半。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,設(shè)5個(gè)染毒劑量組:45.0、36.0、28.8、23.0和18.4g/kg組。對(duì)各劑量組進(jìn)行一次性經(jīng)口灌胃給藥,給藥后觀察并且記錄小鼠的攝食、飲水、呼吸、活動(dòng)和死亡情況,連續(xù)觀察14d,計(jì)算LD50。對(duì)死亡小鼠及觀察期滿處死的小鼠進(jìn)行剖檢,若發(fā)現(xiàn)異常組織或臟器則做病理學(xué)檢查。1.4固定劑量法檢測(cè)k采用固定劑量蓄積毒性系數(shù)法,評(píng)價(jià)印楝油對(duì)小鼠的蓄積毒性。取40只小鼠,隨機(jī)分為試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組兩組,每組20只,雌、雄各半,試驗(yàn)組小鼠以1/5LD50劑量每日灌胃,陰性對(duì)照組小鼠不予任何處理。當(dāng)試驗(yàn)組累計(jì)發(fā)生一半動(dòng)物死亡,即可終止試驗(yàn)。計(jì)算累積總接觸劑量LD50(n),根據(jù)此公式計(jì)算K值進(jìn)行評(píng)價(jià):K=LD50(n)/LD50。若接觸劑量累積達(dá)到5個(gè)LD50劑量,試驗(yàn)組動(dòng)物死亡還未達(dá)到一半,可終止試驗(yàn),此時(shí)計(jì)算出K>5。固定劑量法試驗(yàn)期為25~100d。在給藥期間觀察小白鼠的精神、食欲、飲水及死亡情況和有無(wú)異常反應(yīng)。給藥結(jié)束后,剖檢各組小鼠,對(duì)試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組小鼠的每周飼料利用率以及臟器系數(shù)進(jìn)行分析比較,若發(fā)現(xiàn)異常組織或臟器則做病理學(xué)檢查。1.5處理數(shù)據(jù)用SPSS17.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分析、處理和顯著性t檢驗(yàn)。2結(jié)果與分析2.1急性ld-md最高劑量組小鼠染毒后第50min,精神沉郁,行動(dòng)遲緩,畏寒扎堆,逐漸癱臥,第3h左右開(kāi)始出現(xiàn)腹瀉癥狀,6h內(nèi)9只死亡。其余劑量組的中毒表現(xiàn)同上,但中毒程度隨劑量遞減而減輕,24h內(nèi)存活者基本能恢復(fù)正常。具體死亡記錄見(jiàn)表1。對(duì)各組死亡小鼠和觀察期滿存活的小鼠進(jìn)行處死剖檢,發(fā)現(xiàn)急性中毒死亡小鼠腸道內(nèi)有大量液體充盈、腸道腫脹,其余組織或臟器無(wú)明顯異常。采用改良寇氏法計(jì)算可得印楝油對(duì)小鼠的經(jīng)口LD50為31.95g/kg,95%可信限為27.73~36.06g/kg。根據(jù)外源化學(xué)物急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),印楝油屬實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)。2.2累積毒性試驗(yàn)2.2.1漢植物葉片殘留毒性小鼠給藥后第28d,對(duì)照組20只小鼠全部存活。試驗(yàn)組有4只雄鼠與3只雌鼠死亡,存活小鼠13只。眼觀和病理剖檢各組小鼠均未見(jiàn)異常變化。經(jīng)測(cè)定,蓄積系數(shù)K>5。根據(jù)蓄積毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),印楝油的蓄積毒性為輕度毒性。試驗(yàn)期間,試驗(yàn)組動(dòng)物未見(jiàn)明顯的中毒癥狀。2.2.2兩組的飼料利用率由表2可見(jiàn),在給藥后第1周,試驗(yàn)組的飼料利用率略高于對(duì)照組,差異不顯著(P>0.05);第2周,試驗(yàn)組的飼料利用率明顯低于對(duì)照組,差異顯著(P<0.05);第3周,試驗(yàn)組的飼料利用率與對(duì)照組比較,差異不顯著(P>0.05);第4周,試驗(yàn)組的飼料利用率與對(duì)照組比較,差異不顯著(P>0.05)。表明在28d內(nèi)給予小鼠1/5LD50及以下劑量范圍內(nèi)的印楝油對(duì)小鼠的飼料利用率無(wú)影響。2.2.3《清咸水歌》載由表3可知,在印楝油的蓄積毒性試驗(yàn)中,試驗(yàn)組小鼠心、肝、脾、肺、腎的臟器系數(shù)與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。這表明在28d內(nèi)給予小鼠1/5LD50及以下劑量范圍內(nèi)的印楝油對(duì)小鼠的臟器系數(shù)無(wú)影響(P>0.05)。Themeanwith*issignificantlydifferentfromthatinthecontrolgroupatthesametime3討論3.1急性毒性指標(biāo)急性毒性和蓄積毒性試驗(yàn)是評(píng)價(jià)外源化合物安全性的重要指標(biāo)。急性毒性試驗(yàn)是藥物毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)的第一步,具有了解受試物急性毒性強(qiáng)弱的作用。LD50是評(píng)價(jià)受試物急性毒性強(qiáng)弱以及比較其急性毒性大小的一個(gè)常用指標(biāo)。LD50數(shù)值越大,則表明受試物急性毒性越弱、越小;反之,急性毒性就越強(qiáng)、越大。有文獻(xiàn)報(bào)道,印楝油對(duì)大鼠和兔有一定急性毒性,內(nèi)服LD50分別為14.1、24.0mL/kg;對(duì)懷孕早期大鼠有致流產(chǎn)作用。印楝油對(duì)小鼠的急性毒性較小,只有在高劑量時(shí)才出現(xiàn)高度興奮、個(gè)別死亡的情況。印楝油氯仿提取物對(duì)大鼠幾乎無(wú)毒,其急性經(jīng)口LD50>10000mg/kg,經(jīng)皮LD50>5000mg/kg,對(duì)家兔皮膚、眼黏膜無(wú)刺激性。本試驗(yàn)采用改良寇氏法測(cè)定的印楝油對(duì)小鼠的經(jīng)口LD50為31.95g/kg。根據(jù)世界衛(wèi)生組織推薦的五級(jí)毒性標(biāo)準(zhǔn)可知,印楝油屬于實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)。3.2蓄積性毒性的測(cè)定外源化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后,經(jīng)過(guò)代謝轉(zhuǎn)化后以代謝產(chǎn)物或者以未經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化的原形母體化學(xué)物質(zhì)排出體外。但是當(dāng)化學(xué)物質(zhì)反復(fù)多次染毒動(dòng)物,而且進(jìn)入機(jī)體的速度或總量超過(guò)代謝轉(zhuǎn)化的速度與排出機(jī)體的速度或總量時(shí),化學(xué)物質(zhì)或其代謝產(chǎn)物就可能在機(jī)體內(nèi)逐漸增加并貯留某些部位。這種現(xiàn)象稱(chēng)為化學(xué)物質(zhì)的蓄積作用(accumulation),大多數(shù)蓄積作用會(huì)產(chǎn)生蓄積毒性(accumulativetoxicity)。蓄積毒性是指低于一次中毒劑量的外源化學(xué)物質(zhì),反復(fù)與機(jī)體接觸一定時(shí)間后致使機(jī)體出現(xiàn)的中毒作用。外源化學(xué)物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)所產(chǎn)生的蓄積作用是引起亞慢性毒性作用和慢性毒性作用的基礎(chǔ)。人們?cè)谕庠椿瘜W(xué)物質(zhì)毒理學(xué)評(píng)定的實(shí)際工作中,可根據(jù)受試物的蓄積毒性強(qiáng)弱作為評(píng)估它的毒性作用指標(biāo)之一,也是制定衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)時(shí)選用安全系數(shù)大小的重要參考依據(jù)。至今國(guó)內(nèi)外關(guān)于印楝油的蓄積毒性試驗(yàn)研究報(bào)道幾乎為空白。本試驗(yàn)采用固定劑量蓄積毒性系數(shù)法測(cè)定的蓄積系數(shù)K>5。根據(jù)蓄積系數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),判斷印楝油基本無(wú)蓄積毒性。急性毒性與蓄積毒性試驗(yàn)結(jié)果可以初步確定印楝油使用安全,為以后的亞慢性毒性試驗(yàn)和特殊毒性試驗(yàn)劑量的選擇與產(chǎn)品開(kāi)發(fā)利用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。3.3對(duì)飼養(yǎng)的影響飼料消耗量是喂飼染毒時(shí)確定染毒劑量的關(guān)鍵參數(shù),也是化學(xué)物質(zhì)毒性作用的重要指標(biāo)。一般藥物會(huì)影響動(dòng)物的飲水量與攝食量。在分析評(píng)價(jià)藥物對(duì)動(dòng)物攝食量的影響時(shí),通常以飼料利用率進(jìn)行比較。飼料利用率即動(dòng)物每攝入100g飼料所增加的體重。如果印楝油影響動(dòng)物食欲,則每日進(jìn)食量減少,體重增長(zhǎng)會(huì)受到影響,但飼料利用率不一定改變,如果印楝油干擾了動(dòng)物對(duì)食物的吸收或代謝,雖然不一定影響食欲,但體重增長(zhǎng)卻很緩慢,因而飼料利用率會(huì)有所改變。在蓄積毒性試驗(yàn)中測(cè)定的試驗(yàn)組與對(duì)照組飼料利用率沒(méi)有明顯的差異,這表明在28d內(nèi)給予小鼠1/5LD50及以下劑量范圍內(nèi)印楝油對(duì)小鼠的飼料利用率無(wú)影響。3.4印蔗油在不同劑量印酒中的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果臟器系數(shù),又稱(chēng)臟/體比值,指某一臟器濕重在100g體重中所占的質(zhì)量。一般用于心、肝、脾、肺、腎等實(shí)質(zhì)器官。在排除稱(chēng)重前的失水及年齡、性別、營(yíng)養(yǎng)不良等因素的影響后,如果臟器系數(shù)增大,表明有充血、水腫、增生、肥大等變化;臟器系數(shù)減小,表明臟器可能出現(xiàn)萎縮、退行性等變化。臟器系數(shù)的比較結(jié)果在藥物毒性試驗(yàn)中被看做一項(xiàng)重要指標(biāo),這項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果一定程度上