解酚菌b1512與6種藥用植物對(duì)草莓枯萎病的抑制作用

解酚菌b1512與6種藥用植物對(duì)草莓枯萎病的抑制作用

0植物源微生態(tài)改良劑草莓是一種嚴(yán)重的連作障礙品種之一。連作障礙是長(zhǎng)期以來(lái)困擾農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的復(fù)雜問(wèn)題,盡管土壤病原微生物、化感作用、土壤營(yíng)養(yǎng)元素虧缺等都可以導(dǎo)致連作障礙的發(fā)生,但土壤微生態(tài)失衡是連作障礙發(fā)生的根本,這一點(diǎn)為研究者所公認(rèn)。已有研究表明土壤中病原微生物侵害和草莓根系自毒物質(zhì)的分泌是草莓連作障礙的2個(gè)大主要原因。課題組前期的研究工作中已從153種藥用植物材料中篩選得到了可有效抑制土壤中病原菌侵害的6種藥用植物材料(或組合),同時(shí)篩選出對(duì)草莓根系分泌的自毒物質(zhì)——對(duì)羥基苯甲酸具有高效降解作用的解酚菌B3512,經(jīng)鑒定為煙酸芽孢桿菌。本研究擬采用6種藥用植物材料(或組合)為基質(zhì),與解酚菌B3512結(jié)合,研制附以有益微生物的植物源微生態(tài)改良劑,使植物材料在有益微生物的作用下分解產(chǎn)生抑菌活性成分并分解由于連作障礙產(chǎn)生的草莓根系自毒物質(zhì),同時(shí)充當(dāng)有益微生物在土壤中定植和增殖的載體,改善土壤微生態(tài)環(huán)境、增強(qiáng)抑制草莓土傳病害的作用,實(shí)現(xiàn)“祛毒抑菌”的作用,減化生產(chǎn)中防治草莓連作障礙的過(guò)程,最終有效控制草莓連作障礙的發(fā)生。旨在為利用生防手段防治草莓及相關(guān)作物的連作障礙提供新的思路,同時(shí)也為土傳病害的研究提供可資借鑒的參考。1材料和方法1.1試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)研究田間試驗(yàn)于2010年在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)氣象站進(jìn)行,室內(nèi)試驗(yàn)在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植病生態(tài)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。1.2試驗(yàn)材料1.2.1試驗(yàn)中使用的六種藥物或組合1.2.2試驗(yàn)菌b5121.2.3檢測(cè)試劑中的抗病性1.3測(cè)試方法1.3.1通過(guò)測(cè)定p3512細(xì)菌生長(zhǎng)1.3.2復(fù)合藥用植物材料的篩選抑制率=[(對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑-處理菌落生長(zhǎng)直徑)/對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑]×100%1.3.3固體發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化(1)固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方的優(yōu)化。本試驗(yàn)采用3因素3水平正交設(shè)計(jì)(見(jiàn)表1)優(yōu)化培養(yǎng)基比例,篩選適宜培養(yǎng)基配方。同樣以0.05mL/g接種量接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi),充分?jǐn)嚢杈鶆?各三角瓶中厚度一致,約1cm;置生化培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)48h;期間叩瓶翻料2次,取樣測(cè)定活菌數(shù)(CFU/g)。(2)固體發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化。分別檢測(cè)出不同的接種量(5%、10%、15%、20%、25%)、初始含水量(50%、100%、150%、200%、250%)、培養(yǎng)時(shí)間(24、48、72、96、120h)、培養(yǎng)溫度(26、28、30、32、34℃)、起始pH值(5、6、7、8、9),對(duì)菌株B3512生長(zhǎng)量的影響。固體培養(yǎng)基配方采用正交試驗(yàn)后確定的最佳配方。1.3.4統(tǒng)計(jì)分析2結(jié)果與分析2.1分離培養(yǎng)菌株b12菌落數(shù)量以6種藥用植物材料或組合為發(fā)酵基質(zhì),每隔12h測(cè)定B3512的活菌數(shù)。由圖1可知,6個(gè)處理的菌株B3512菌落數(shù)量在36h之前呈增長(zhǎng)趨勢(shì),36h附近達(dá)到最大活菌數(shù),之后出現(xiàn)下降趨勢(shì),且隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),活菌數(shù)有所下降或增長(zhǎng)平緩。不同處理間相比較,以姜黃為基質(zhì),B3512菌落數(shù)為最大,Z2系列處理居于其次,其他各處理差異無(wú)明顯規(guī)律性。2.2不同基質(zhì)中姜黃活菌量的檢測(cè)表2所示為不同藥用植物材料或組合作為發(fā)酵基質(zhì)對(duì)B3512增殖和對(duì)病原菌抑制作用的影響。由表2可知,以6種藥用植物材料或組合為發(fā)酵基質(zhì),B3512均可增殖,但增殖幅度明顯不同,其中以姜黃為發(fā)酵基質(zhì)時(shí),B3512的活菌量最大為25.6×106cfu/g,增殖率最高達(dá)77.7%。同時(shí)6種藥用植物材料或組合對(duì)草莓病害主要病原菌尖孢鐮刀菌均有抑菌作用,但抑菌率也有明顯差異,選姜黃作為發(fā)酵基質(zhì)時(shí),抑菌率最高可達(dá)71.4%。2.3酚菌t352與植物材料固結(jié)發(fā)酵條件的優(yōu)化2.3.1固體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成優(yōu)化2.3.2有效污泥培養(yǎng)條件的優(yōu)化3不同基質(zhì)的利用對(duì)a5492生長(zhǎng)的影響本研究是以解酚菌B3512為功能菌,以藥用植物材料或組合為基質(zhì),將二者有效結(jié)合制成復(fù)合生防制劑,達(dá)到祛毒抑菌的作用。結(jié)果表明:(1)單一使用解酚菌或藥用植物材料防治草莓連作障礙過(guò)程復(fù)雜化,將二者結(jié)合可提高效率;(2)不同的藥用植物材料或組合對(duì)B3512的增殖和對(duì)病原菌抑制作用均有不同,結(jié)果表明以姜黃為基質(zhì)利于B3512增殖且對(duì)病原菌有較高的抑制作用;(3)在正交組合固體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng),以玉米秸桿粉、麩皮、姜黃質(zhì)量比為10:20:6時(shí)增殖量達(dá)到最大。接種量、溫度、培養(yǎng)時(shí)間、含水量和pH對(duì)B3512生長(zhǎng)和繁殖均有顯著影響,其中B3512以20%的接種量接入固體基質(zhì),最適溫度32℃、初始含水量50%、初始pH7.0培養(yǎng)時(shí),解酚菌B3512的繁殖能力最強(qiáng)且活菌數(shù)都高于其他發(fā)酵條件。4培養(yǎng)基的制備草莓連作障礙是現(xiàn)今制約草莓生產(chǎn)的主要因素,草莓連作種植時(shí),植株發(fā)病率可達(dá)89.2%,導(dǎo)致作物連作障礙發(fā)生原因歸納起來(lái)有3種:(1)由于土壤病原微生物數(shù)量增加。隨保護(hù)地作物種植年限的增加,土壤有害病原菌的種類和數(shù)量都明顯增加;(2)由于土壤理化性狀發(fā)生的變化,尤其是土壤肥力的下降;(3)作物根系土壤中發(fā)生的化感自毒作用。根據(jù)草莓連作障礙發(fā)生的原因,到目前為止,緩解連作障礙的方法主要有農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治3類。隨著化學(xué)藥物防治局限性逐步顯現(xiàn),基于引入有益微生物對(duì)連作障礙進(jìn)行修復(fù)已逐步成為生防領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。生物防治的防效較長(zhǎng),不會(huì)造成環(huán)境污染,安全性較高,且不易產(chǎn)生抗性。李自剛等利用含有4種不同菌種的微生物修復(fù)菌劑控制懷地黃連作障礙;喻國(guó)輝等利用微生物來(lái)緩解苯丙烯酸對(duì)黃瓜生長(zhǎng)的抑制;周曉芬等對(duì)連作黃瓜配合EM菌劑施用生物肥料,能減輕黃瓜枯萎病。總體看,利用微生物拮抗緩解連作障礙得到了越來(lái)越多的重視。本研究已找到將功能菌B3512與藥用植物材料最有效的結(jié)合方式,使解酚菌B3512可在以藥用植物材料姜黃為基質(zhì)的固體發(fā)酵培養(yǎng)基上定植增殖,其原因可能是藥用植物材料分解后可產(chǎn)生有效抑制病原菌活性的物質(zhì),并且其發(fā)酵液有利于有益微生物的增殖。受限于時(shí)間與場(chǎng)地,對(duì)于固體發(fā)酵物的接種量和處理時(shí)間以及藥用植物源的數(shù)量種類均有待于進(jìn)一步探討,另外關(guān)于生防制劑進(jìn)入大田后的繁殖情況還需深入研究。青皮、枳實(shí)、山柰、姜黃、Z1(青皮+山柰+枳實(shí))、Z2(姜黃+山柰+枳實(shí))購(gòu)自保定市南市區(qū)醫(yī)藥公司。煙酸芽孢桿菌,對(duì)草莓根系分泌自毒物對(duì)羥基苯甲酸具有降解作用,由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植病生態(tài)學(xué)研究室篩選得到。尖孢鐮刀菌草莓?；?FusariumoxysporumSchl.f.sp.Fragariae),由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植病生態(tài)研究室分離得到。以6種藥用植物材料為發(fā)酵基質(zhì),制備菌株B3512孢子懸浮液,使其終濃度為1×104個(gè)/mL;以0.05mL/g接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi),置30℃培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h后,取1g基質(zhì)加入到99g無(wú)菌水中,120r/min,28℃下?lián)u床振蕩30min,靜置10min,通過(guò)血球計(jì)數(shù)法測(cè)不同處理活菌數(shù),繪制菌落增長(zhǎng)曲線圖并計(jì)算增殖率。將發(fā)酵液在8000r/min,25℃下離心10min,取上清液,無(wú)菌條件下,依次用0.45μm和0.22μm孔徑的無(wú)菌濾膜過(guò)濾除去上清液中的細(xì)菌,得無(wú)菌濾液備用.對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用,通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定。取1mL無(wú)菌濾液與9mL冷卻至45℃的PDA培養(yǎng)基迅速混勻,待冷卻凝固后,在每個(gè)培養(yǎng)基中心接入1個(gè)病原菌菌餅,長(zhǎng)有菌絲的一面朝下,用無(wú)菌水作對(duì)照,重復(fù)3次。28℃培養(yǎng)3~5天,十字交叉法測(cè)量菌落擴(kuò)展直徑,計(jì)算抑制率。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化或歸一化處理,用DPS數(shù)據(jù)軟件統(tǒng)計(jì)分析,Tukey法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。由表3可知,通過(guò)測(cè)定9個(gè)處理活菌數(shù),對(duì)細(xì)菌B3512菌株的培養(yǎng),影響最大的是麥麩的含量,其次是玉米秸稈粉,最后是姜黃。最后篩選的適宜培養(yǎng)基配比是麥麩20g、玉米秸稈粉10g、姜黃6g。結(jié)果如表4所示,最佳活菌量為處理3,活菌量為75.77×106cfu/g。由表4可知,解酚菌B3512的最優(yōu)接種量為20%,接種量過(guò)低,解酚菌不能充分利用培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)