長春龍嘉國際機場口岸犀攜帶病原菌基因組dna提取方法比較

長春龍嘉國際機場口岸犀攜帶病原菌基因組dna提取方法比較

著名的動物是世界上最重要的衛(wèi)生害蟲之一。不僅食品和非食品材料，它不僅會造成損失，還會導致大量細菌傳播各種疾病。隨著經濟全球化,進出口貿易的增加,交通工具和運輸設施的快捷、便利,使得蜚蠊及其卵鞘隱藏在各類貨物、行李、集裝箱中,經過交通工具,在地區(qū)間,乃至國際間廣泛傳播、擴散。隨著這些貨物、行李等,蜚蠊又悄悄地進駐各類建筑物,潛入到各行各業(yè)中。本研究利用1年時間,對長春龍嘉國際機場口岸的蜚蠊進行了本地調查,掌握了蜚蠊的種群構成、季節(jié)消長規(guī)律等基本情況,并對三種提取蜚蠊表面攜帶病原菌基因組DNA的方法進行了比較,為今后蜚蠊攜帶病原菌的檢測提供了幫助。1本研究1.1調查地點與方法采集地點:根據(jù)長春龍嘉國際機場口岸地區(qū)的具體情況結合蜚蠊的生態(tài)習性,選擇口岸內4種生境分別為辦公區(qū)、食品生產廠區(qū)(包括機場食品公司A、食品公司B)、餐飲業(yè)(包括機場賓館C、餐廳D、咖啡廳E)、倉儲場地(包括貨運倉庫F、貨運倉庫G),共8個監(jiān)測點,作為采集地點。采集方法:采用“盒式誘捕法”方法。在調查區(qū)共設150個點,每個點放一個誘捕盒,置于食源豐富潮濕背光隱蔽處。選用規(guī)格為15cm×10cm,高為3cm誘捕盒,在誘捕盒對應兩壁正中下方,用新鮮面包2g左右作為誘餌,每次捕集12小時,晚放晨收。將捕獲的蜚蠊進行種群分類、標本制作并進行攜帶病原菌的檢測。誘捕盒底層具有較強粘性,蜚蠊一旦進入則被粘住,從而達到捕獲的目的。1.2第1批的密度計算蜚蠊構成比的計算:構成比(%)=某種蜚蠊只數(shù)捕獲總的蜚蠊只數(shù)×100%(%)=某種蜚蠊只數(shù)捕獲總的蜚蠊只數(shù)×100%蜚蠊密度的計算:D=ΝcΝe?DD=NcNe?D為密度,單位為只每盒(只/盒),Nc粘捕到的蜚蠊數(shù),單位為只。Ne粘捕到蜚蠊的粘蟑盒數(shù),單位為盒。1.3添加溶菌豬肉、堿蛋白、gn增菌液、緩沖蛋白成分配比的確定在上述不同場所捕獲蜚蠊200只,分別用無菌鑷子夾取10只為1組,共20組放入滅菌三角瓶中,加入營養(yǎng)肉湯50mL,反復振蕩洗滌體表5min,各取1mL洗脫液分別接種溶菌肉湯、堿性蛋白胨水、GN增菌液、緩沖蛋白胨水做增菌培養(yǎng)。1.4組基因組dna提取方法的比較病原菌基因組DNA的提取質量直接影響用PCR或者基因芯片等分子生物學方法對病原菌的檢測效果,因此,本研究采用煮沸法、試劑盒法、SDS法三種基因組DNA提取方法進行比較。1.4.1pbs-1緩沖液制備取1mL菌液于離心管中,12000rpm,離心5min,棄上清,加PBS緩沖液1mL,12000rpm,離心5min,棄上清,加150微升雙蒸水,混勻,封口膜封口,100℃煮沸10min后,12000rpm,離心10min,將上清轉移至新的離心管中,-20℃保存?zhèn)溆谩?.4.2測試盒法細菌DNA的提取按照EasyPureTMGenomicDNAExtractionKIT試劑盒使用說明中的操作規(guī)程進行提取。1.4.3鹽藻dna的提取取1mL～2mL菌液至EP管中,10000rpm離心,沉淀菌體;加入200μL裂解液,(0.1MNaOH,1MNaCL,5%SDS),加熱煮沸20min;加入三倍體積0.1MTris-Hcl(ph7.4),離心5000rpm,5min;上清液用等體積的酚-氯仿抽提8000rpm,10min;無水乙醇沉淀DNA,室溫靜置10min,或5000rpm,離心5min,沉淀DNA;離心收集,用70%乙醇漂洗兩遍,開蓋晾干乙醇;加30μlddH2O,-20℃保存。1.4.4dna純度、濃度計算及純度取細菌DNA5μL,在紫外分光光度下,分別取波長為260nm,280nm兩個波段,測得其相應的DNA的OD260值及OD280值。利用公式:DNA濃度(ng/μl)=50ng/μL×OD260,計算出DNA濃度;利用公式:DNA純度=OD260/OD280,計算出DNA的純度。計算結果采用SPSS16.0軟件進行完全隨機設計的方差分析進行比較。2結果2.1物種組成、密度和季節(jié)變化規(guī)律2.1.1不同的飛克集團2008年4至2009年3月,共捕獲蜚蠊3957只。經鑒定均為德國小蠊。德國小蠊構成比100%。2.1.2監(jiān)測點點分布根據(jù)監(jiān)測場所的性質,此次調查共分為4個不同生境,分別為辦公區(qū)、食品生產廠區(qū)(包括機場食品公司A、食品公司B)、餐飲業(yè)(包括機場賓館C、餐廳D、咖啡廳E)、倉儲場地(包括貨運倉庫F、貨運倉庫G),共8個監(jiān)測點。經監(jiān)測,在不同生境下,辦公區(qū)共捕獲蜚蠊225只,密度0.32只/盒;倉儲場地共捕獲蜚蠊0只,蜚蠊密度0只/盒;餐飲區(qū)共捕獲蜚蠊3470只,蜚蠊密度4.08只/盒;食品生產單位共捕獲蜚蠊262只,密度為0.34只/盒。整個口岸蜚蠊密度為1.36只/盒,結果見表1。2.1.3喬木密度季節(jié)的消長變化規(guī)律2008年4至2009年3月,經過春、夏、秋、冬四個季節(jié),共12個月的調查結果分析,1月份和7月份為蜚蠊密度高峰期,見表2,圖1。2.2病原菌基因組dna純度、濃度檢測測量提取的DNA樣本在260nm,280nm處的吸光度值。用OD260/OD280表示DNA的純度,OD260×50表示DNA的濃度(ng/μl),對提取的DNA濃度和純度進行比較,結果顯示煮沸法、試劑盒法、SDS法三種方法提取病原菌基因組DNA的純度分別為1.715±0.155、1.750±0.108、1.840±0.051,通過方差分析,三種方法具有顯著性差異(F=11.697,P<0.05),SDS法提取的DNA純度較好。煮沸法、試劑盒法、SDS法三種方法提取病原菌基因組DNA濃度分別為57.347±8.212ng/μL、1.883±0.782ng/μL、14.925±3.338ng/μL,通過方差分析,三種方法具有顯著性差異(F=637.137,P<0.05),可知煮沸法濃度最高,結果見表3。綜合比較,純度、濃度、成本、提取時間等因素,SDS法是比較理想的病原菌基因組DNA提取方法。3討論3.1應注重在國際機關分布的生長和季節(jié)動態(tài)吉林省屬于溫帶大陸性季風氣候,四季分明,冬季長而寒冷,夏季短而溫暖,春秋季風大,平均氣溫-3℃～7℃。一年四季溫差、濕度差較大,但北方的供暖設施致使常年室溫在20℃以上,近年來城市集中供熱的改造使得樓與樓之間形成高溫、高濕的通道。這些特點致使蜚蠊的季節(jié)消長受外界環(huán)境溫度變化的影響不明顯,在一些特定的環(huán)境下,蜚蠊終年可以繁殖。長春龍嘉國際機場位于長春、吉林兩市之間,地處九臺地區(qū)。屬半濕潤溫帶大陸性季風氣候。年均氣溫4.7℃,年日照時數(shù)2615.5小時,無霜期139天左右,年平均降水量573.2毫米。而德國小蠊的適應性極強,這些特點為其繁衍生殖提供了良好的孳生條件。本研究中,在長春龍嘉國際機場口岸蜚蠊本底調查中捕獲到的蜚蠊均為德國小蠊,這個結果與2000年長春市防疫站調查的蜚蠊分布界限基本吻合,即以長哈鐵路和伊通河為界,鐵路北側、伊通河東只有德國小蠊1種;鐵路以南伊通河以西4種均有且除美洲大蠊與黑胸大蠊不共棲外,其他各種均可共棲,但從未發(fā)現(xiàn)3種以上共棲的。與2006-2007年吉林省疾控中心調查的吉林省蜚蠊分布情況一致,該研究調查中發(fā)現(xiàn)長春市蜚蠊種類僅有德國小蠊存在,本研究結果說明長春龍嘉國際機場口岸的蜚蠊以德國小蠊為優(yōu)勢種屬。此次調查在長春龍嘉國際機場口岸中德國小蠊的年平均密度為1.36只/盒,此結果低于長春市蜚蠊密度3.62只/盒,說明長春龍嘉國際機場口岸的蜚蠊侵害程度要低于長春市區(qū),提示應加強在長春龍嘉國際機場口岸蜚蠊的防控工作,采取相應措施,防止口岸蜚蠊密度的上升,從而達到保護口岸人民群眾及出入境旅客生命財產的安全。蜚蠊的活動受濕度的影響,表現(xiàn)出明顯的季節(jié)消長現(xiàn)象—出現(xiàn)、增多、高峰、下降和越冬,這種規(guī)律在我國的大部分國境口岸都很明顯。南方各口岸地處亞熱帶,蜚蠊季節(jié)消長現(xiàn)象突出,但不一定越冬,北方各口岸,蜚蠊季節(jié)消長和越冬明顯,但在冬天有取暖設施的場所,或溫濕度較高的房間,蜚蠊可終年活動,無明顯季節(jié)變化。在首都機場危害高峰為8月份,南京祿口機場為6月和9月份,浦東機場為8月份,廣州白云機場為7月、9月和11月份。在東北,如吉林省長白口岸、集安口岸,即使室外氣溫在-20℃以下,但室內很暖和,所以蜚蠊照?；顒印１狙芯恐?長春龍嘉國際機場口岸蜚蠊活動分別在1月份和7月份出現(xiàn)兩次高峰,其他月份無明顯變化,這個結果與吉林省疾病預防控制中心調查的吉林省蜚蠊高峰出現(xiàn)在3月份和7月份的結論基本一致。蜚蠊的季節(jié)變化規(guī)律有助于提示口岸相關單位在蜚蠊活動高峰時期應加大控制措施,預防因蜚蠊引起的疾病在口岸傳播。3.2種基因組dna提取方法比較PCR檢測方法的可靠性主要依賴于模板DNA的質量,因此DNA的提取方法在PCR檢測中起著重要作用,細菌DNA提取方法有多種,不同的方法提取的量及純度不同,所需要的時間及經費也有差別,目前細菌DNA常采用經典的有機溶劑提取法。經典的有機溶劑法雖然得到的DNA質量較高,但是步驟繁瑣耗時長,不適于快速檢測中DNA的提取。本研究對蜚蠊表面攜帶的病原菌基因組DNA采用了3種不同的提取方法即煮沸法、試劑盒法、SDS法。從提取的基因組DNA的純度和濃度以及時間經濟等角度出發(fā),比較了三種基因組DNA提取方法。結果顯示,煮沸法的操作步驟簡潔、時間較短,費用低,減少了DNA損失及外源DNA的污染機會,不需要酚-氯仿抽提及乙醇沉淀,避免了有機溶劑對人體的危害,而且得到的DNA的產量高,但由于煮沸法并沒有去除雜質的過程,提取純度及效率明顯偏低,因此高溫煮沸法雖然簡單,但純度較低,僅適合于對模板要求較低的實驗,而且有文獻報道煮沸法無法提取革蘭陽性菌基因組DNA,在檢測鑒定中可能會因此造成假陰性。GenomicDNAExtractionKIT試劑盒法操作步驟相對煮沸法和SDS法較為復雜,整個提取過程時間較長。由于提取方法中需經多步洗脫,轉移,容易使DNA損失,導致DNA產量較少,且費用昂貴,不適于大量標本處