基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控

第三章基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控現(xiàn)代分子生物學(xué)FrancisCrick在1958年提出中心法則，指出信息傳遞是單向過(guò)程，一旦轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍踪|(zhì)，就不會(huì)從蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)回到核酸分子，但遺傳信息可以從核酸到核酸或從核酸到蛋白質(zhì).遺傳信息從DNA經(jīng)過(guò)RNA傳遞到蛋白質(zhì)的過(guò)程稱為基因表達(dá)（geneexpression）。任何能較為直接影響轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程開(kāi)啟/關(guān)閉及發(fā)生速率的因素及其作用過(guò)程，稱為基因表達(dá)調(diào)控(regulationofgeneexpression)。可以在多層次或水平上進(jìn)行，如轉(zhuǎn)錄起始，轉(zhuǎn)錄延伸，轉(zhuǎn)錄終止及翻譯前/后等，但最主要也是最有效的調(diào)控是轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控。第三章基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控轉(zhuǎn)錄過(guò)程與DNA復(fù)制過(guò)程非常相似，都會(huì)在特定酶的催化下合成一條與DNA摸板互補(bǔ)的新核苷酸鏈，但有以下區(qū)別：1）轉(zhuǎn)錄過(guò)程產(chǎn)生的新鏈由核糖核苷酸組成，而復(fù)制產(chǎn)生的新鏈則是由脫氧核糖核苷酸組成；2）催化合成RNA的聚合酶不需要引物，可以從頭（denovo）起始轉(zhuǎn)錄.在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄是從一段特定的DNA序列起始并轉(zhuǎn)錄某一特定的DNA區(qū)段。3）產(chǎn)生的RNA產(chǎn)物并不與模板DNA保持大范圍堿基配對(duì)，而是僅僅在酶活性中心部位保持一段8個(gè)核苷酸的互補(bǔ)區(qū)，已經(jīng)合成的其它區(qū)段被從DNA模板上置換出來(lái)。既可以保證翻譯的同時(shí)進(jìn)行，也可以允許一個(gè)基因同時(shí)被幾個(gè)聚合酶所轉(zhuǎn)錄，從而保證短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。4）精確率低于復(fù)制過(guò)程（10-4Vs10-8）第一節(jié)轉(zhuǎn)錄一、RNA聚合酶

JHarowitz與SWeiss分別在1960年首次發(fā)現(xiàn)以DNA為模板的RNA聚合酶，可催化如下反應(yīng)：

原核生物一般只有一種RNA聚合酶，而真核生物有三種RNA聚合酶（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）。其中細(xì)菌RNA聚合酶核心酶由5個(gè)亞基組成（ββ’α’α’’ω），可以與另外六個(gè)其它亞基形成全酶（holoenzyme）,其中的σ亞基介導(dǎo)RNA聚合酶只對(duì)特定的啟動(dòng)子序列結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄。真核生物的核心酶由Rpb1,2,3,11,6組成，分別對(duì)應(yīng)于細(xì)菌聚合酶的β’βα’α’’ω亞基，與另外7個(gè)其它亞基組成全酶。真核生物RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子序列的特異性識(shí)別結(jié)合是由普通轉(zhuǎn)錄因子（generaltranscriptionfactor,GTF）介導(dǎo)的。.DNA模板，Mg2+/Mn2+RNAPolRNA+4nPPinNTPT.aquaticsS.cerevisiae晶體結(jié)構(gòu)顯示兩種核心酶的整體結(jié)構(gòu)非常相似，呈蟹爪狀（crabclaw）ThesubunitsofRNApolymerases

ProkaryoticBacteriaArcheaEukaryoticRNAP1RNAPⅡRNAPⅢβ’βα’α’’ωA’/A’’BDLK[+6others]RPA1RPA2RPC5RPC9RPB6RPB1RPB2RPB3RPB11RPB6RPC1RPC2RPC5RPC9RPB9[+9others][+7others][+11others]Channelsintoandoutoftheopencomplex二、轉(zhuǎn)錄過(guò)程整個(gè)轉(zhuǎn)錄過(guò)程可以分為三個(gè)階段：1）轉(zhuǎn)錄起始(initiation)；2）轉(zhuǎn)錄延伸(elongation)；3）轉(zhuǎn)錄終止(termination)1）DNA中一段特定序列（啟動(dòng)子）被RNA聚合酶所結(jié)合，形成一個(gè)閉合復(fù)合物（closedcomplex）；閉合復(fù)合物或在其它蛋白質(zhì)因子作用下,或自發(fā)地發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，形成一開(kāi)放復(fù)合物（opencomplex），此過(guò)程為不可逆過(guò)程，不需要ATP水解；在開(kāi)放復(fù)合物中,一段圍繞轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)約14bp（+3～-11）的區(qū)段發(fā)生解鏈，形成“轉(zhuǎn)錄泡（transcriptionbubble）”結(jié)構(gòu)。相應(yīng)于最初的兩個(gè)核苷酸隨后進(jìn)入酶活性位點(diǎn)，被催化形成磷酸二酯鍵并繼續(xù)進(jìn)行其它核苷酸的合成。在RNA鏈最初10個(gè)核苷酸的合成中，RNA聚合酶易從模板鏈上脫落，合成效率較低,此階段稱為流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄(abortivetrancription)；一旦合成的RNA鏈長(zhǎng)度>10nt,聚合酶可以與DNA、RNA形成穩(wěn)定的三維復(fù)合結(jié)構(gòu)，進(jìn)入轉(zhuǎn)錄延伸階段，這一轉(zhuǎn)變過(guò)程稱為啟動(dòng)子逃離（promoterescape）.①啟動(dòng)子原核生物核心酶理論上可以識(shí)別結(jié)合DNA分子上的任何一個(gè)位點(diǎn);但在細(xì)胞內(nèi)只會(huì)從特定啟動(dòng)子序列起始轉(zhuǎn)錄。這種特異性是通過(guò)可以對(duì)啟動(dòng)子序列特異性識(shí)別結(jié)合的σ因子來(lái)完成。在大腸桿菌中最主要的σ因子為σ70。被σ70識(shí)別的啟動(dòng)子具有下面特點(diǎn)：1）具有兩段保守序列，序列中心點(diǎn)分別距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)為10bp及35bp，稱為-10區(qū)及-35區(qū)；2）通過(guò)比較各種被σ70識(shí)別的啟動(dòng)子序列發(fā)現(xiàn)，不同啟動(dòng)子-10區(qū)及-35區(qū)序列非常相似，存在一個(gè)共有序列（concensussequence），其中-10區(qū)序列為TATAA

T,-35區(qū)序列為TTGACA;3)兩個(gè)保守區(qū)的間隔距離為17-19bp.ThephasesoftranscriptioncyclePromoterconsensussequenceandspacingconsensusσandαsubunitsrecruitRNApolymerasecoreenzymetothepromoter

2)當(dāng)RNA聚合酶成功脫離啟動(dòng)子后，進(jìn)入轉(zhuǎn)錄延伸階段（transcriptionelongation）.未轉(zhuǎn)錄的DNA雙鏈從兩蟹爪交接處進(jìn)入聚合酶,并分別進(jìn)入酶分子中各自通道,在離開(kāi)聚合酶后又重新恢復(fù)雙鏈結(jié)構(gòu).轉(zhuǎn)錄延伸中的RNA分子只有8～9nt與模板DNA互補(bǔ),其余的RNA鏈則從模板鏈上剝離,并通過(guò)RNA通道離開(kāi)RNA聚合酶.在延伸過(guò)程中,RNA聚合酶具有兩種校正功能:第一種為焦磷酸裂解編輯反應(yīng)(pyrophosphorolyticediting),通過(guò)重新加合一個(gè)焦磷酸基團(tuán)使錯(cuò)誤合成的核苷酸得以釋放;另一種稱為水解編輯(hydrolyticediting),在一種Cre蛋白的協(xié)助下,聚合酶可以從錯(cuò)誤加合核苷酸處后退一個(gè)或幾個(gè)核苷酸,從而使RNA3’OH端離開(kāi)活性中心而被切割,后退的聚合酶則利用重新位于活性中心的3’OH進(jìn)行延伸.3)當(dāng)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行到特定序列時(shí),聚合酶會(huì)從DNA模板上脫落并使RNA鏈得以釋放,這種使轉(zhuǎn)錄發(fā)生停止的特定DNA序列稱為終止子序列(terminator).終止子序列可以分為兩類:①Rho因子非依賴型;②Rho因子依賴型.第一類終止子終止轉(zhuǎn)錄不需其它蛋白因子參與,而第二類則需要Rho蛋白.Rho非依賴型終止子含有兩段特征性序列元素,第一段為長(zhǎng)度20bp的倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列;第二段為緊隨其后的富含A:T區(qū)(7-8對(duì)).終止子本身對(duì)轉(zhuǎn)錄無(wú)任何影響,只有在其被聚合酶轉(zhuǎn)錄后會(huì)造成轉(zhuǎn)錄終止.被轉(zhuǎn)錄的倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列區(qū)段可以通過(guò)自身堿基配對(duì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin),可以對(duì)轉(zhuǎn)錄三維復(fù)合物產(chǎn)生一種張力而容易引起復(fù)合物的解體;當(dāng)此種莖環(huán)結(jié)構(gòu)與富含A:U區(qū)相鄰時(shí),由于A:U配對(duì)間較弱的作用力,可以最終促使上游形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物解體而終止轉(zhuǎn)錄.Sequenceofarho-independentterminatorTranscirptionterminationRho依賴型終止子沒(méi)有明顯的序列特征,轉(zhuǎn)錄終止的完成依賴于Rho蛋白.Rho蛋白以六聚體形式形成一環(huán)狀結(jié)構(gòu),可以結(jié)合到從RNA聚合酶中RNA通道釋放出的RNA單鏈區(qū)段;Rho蛋白同時(shí)具有ATPase活性,一旦與轉(zhuǎn)錄物結(jié)合后可以利用水解ATP的能量把RNA從模板鏈與聚合酶中釋放出來(lái).通常Rho蛋白可以結(jié)合到RNA中rut位點(diǎn)(Rhoutilizationsite),rut位點(diǎn)長(zhǎng)度一般為40nt,富含C,且不形成二級(jí)結(jié)構(gòu);另外,Rho蛋白不會(huì)結(jié)合已經(jīng)結(jié)合了核糖體正在進(jìn)行翻譯的RNA,而在細(xì)菌中,翻譯與轉(zhuǎn)錄是緊密偶聯(lián)的,因此,Rho一般只會(huì)結(jié)合終止已經(jīng)超越基因末端的轉(zhuǎn)錄過(guò)程.

TheRhotranscriptionterminator第二節(jié)真核生物基因轉(zhuǎn)錄真核生物具有三種RNA聚合酶；與原核生物RNA聚合酶需要σ因子來(lái)啟動(dòng)特定染色體區(qū)段轉(zhuǎn)錄不同，真核生物通常需要多種不同起始因子來(lái)協(xié)助RNA聚合酶在特定啟動(dòng)子序列有效起始轉(zhuǎn)錄，這些起始因子統(tǒng)稱為普通轉(zhuǎn)錄因子（generaltranscri-ptionfactors，GTFs）.在體外條件下，GTFs與RNA聚合酶足以啟動(dòng)特定DNA模板的轉(zhuǎn)錄；而在胞內(nèi)條件下，還需要其它蛋白因子如mediator復(fù)合物，DNA結(jié)合調(diào)控蛋白及chromatin-modifyingenzymes來(lái)啟動(dòng)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。一、真核基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)核心啟動(dòng)子（corepromoter）是指體外條件下可以被RNA聚合酶Ⅱ精確識(shí)別結(jié)合,并起始轉(zhuǎn)錄所必需的一套最少序列元素。長(zhǎng)度通常約為40bp,從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)向上游或下游延伸。在核心啟動(dòng)子的上游通常還存在其它一些調(diào)控序列，如近啟動(dòng)子元素（promoterproximalele-ments），上游激活序列(upstreamactivatorsequences)，增強(qiáng)子(enhancers)及抑制基因轉(zhuǎn)錄的沉默子(silencers)，邊界元素(boundaryelements)和絕緣子(insulators)等.所有這些調(diào)控元素都是通過(guò)與特定調(diào)控蛋白的結(jié)合來(lái)影響從核心啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。PolⅡcorepromoter前起始復(fù)合物的形成位點(diǎn)是核心啟動(dòng)子的TATA元素。GTFs中的TFⅡD首先通過(guò)TBP亞基結(jié)合到TATA序列上而形成一個(gè)其它GTFs與RNA聚合酶Ⅱ?qū)?dòng)子結(jié)合的平臺(tái)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，其它GTFs與RNA聚合酶Ⅱ按照一定的順序在啟動(dòng)子上完成組裝。前起始復(fù)合物形成后在特定條件下，在TFⅡH解旋酶活性的催化下引起啟動(dòng)子區(qū)域解鏈，并同時(shí)對(duì)RNA聚合酶Ⅱ大亞基羧基端(C-terminaldomain,CTD)七肽重復(fù)序列中（Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser）的Ser進(jìn)行磷酸化修飾，使RNA聚合酶Ⅱ起始轉(zhuǎn)錄并脫離其它GTFs。二、轉(zhuǎn)錄前復(fù)合物的形成普通轉(zhuǎn)錄因子可以協(xié)助RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合到啟動(dòng)子并協(xié)助實(shí)現(xiàn)從閉合復(fù)合物向開(kāi)放復(fù)合物的轉(zhuǎn)化；同時(shí)還協(xié)助聚合酶脫離啟動(dòng)子順利進(jìn)入延伸階段。把結(jié)合在啟動(dòng)子上準(zhǔn)備起始轉(zhuǎn)錄的一整套GTFs及RNA聚合酶Ⅱ稱為前起始復(fù)合物（pre-initiationcomplex）.ThegeneraltranscriptionfactorsofRNApolymeraseIITBP1TFⅡA2TFⅡB1TFⅡE2TFⅡF3TFⅡH9TAFs11GTFsNumberofsubunitsTranscriptioninitiationbyRNApolymeraseⅡTBP-DNAcomplexTFIIB-TBP-promotercomplex由于真核生物染色體是以染色質(zhì)結(jié)構(gòu)存在，所以細(xì)胞內(nèi)特定基因的轉(zhuǎn)錄還需要許多其它蛋白因子如轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白,Mediatorcomplex,核小體修飾/重塑酶（nucleosome-modifyingenzymes）的協(xié)同作用等。結(jié)合在啟動(dòng)子上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白通?？梢酝ㄟ^(guò)Mediatorcomplex的介導(dǎo),協(xié)助并穩(wěn)定RNA聚合酶Ⅱ?qū)?dòng)子的結(jié)合；Mediatorcomplex可以通過(guò)調(diào)節(jié)TFⅡH激酶活性而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始。酵母與人的Mediatorcomplex均含有>20亞基。Assemblyofthepre-initiationcomplexinpresenc