醫(yī)用分子生物學(xué) 討論課 基因組DNA提取 瓊脂糖凝膠電泳 RNA提取

分子生物學(xué)討論課匯報(bào)展示

第五小組1人類基因組DNA提取2限制性核酸內(nèi)切酶切割的原理、方法3瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析（DNA）4瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用(DNA)5人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取6RT-PCR的原理、方法7瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析(RNA)8瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用(RNA)目錄人類基因組DNA提取限制性核酸內(nèi)切酶切割的原理、方法匯報(bào)人：哺乳動(dòng)物的一切有核細(xì)胞都可以用來(lái)制備DNA，除特殊要求外，白細(xì)胞、肝或脾組織是最常用的材料。原始材料較少或較難獲得時(shí)（如羊水細(xì)胞），還必須經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)獲得足夠量的細(xì)胞；有時(shí)為了簡(jiǎn)便易行起見(jiàn)，還可以無(wú)創(chuàng)傷地采集材料，如用口腔上皮脫落細(xì)胞、發(fā)根細(xì)胞。產(chǎn)前診斷所用的材料則為胎兒的羊水細(xì)胞或者絨毛膜細(xì)胞SDS是一種去污劑，破壞細(xì)胞膜的脂質(zhì)膜；蛋白酶K是一種很強(qiáng)的蛋白水解酶，能消化各種蛋白質(zhì)（包括糖蛋白和肽類）及脂類和胺類物質(zhì)，但糖蛋白的降解物常與DNA一同沉淀下來(lái)，干擾酶的活性，消化后需要用酚、氯仿抽提純化；人類基因組DNA提取原理principle1酚能變性蛋白質(zhì)而且還能將變性的蛋白質(zhì)溶解在其中；（加入1/3體積的飽和NaCl溶液，也可較好地祛除細(xì)胞降解物而純化DNA，可以避免酚的污染。）氯仿也是一種有效的蛋白變性劑，它還能促進(jìn)兩相的分離；DNA上清溶液再經(jīng)氯仿抽提后用乙醇沉淀，分離純化的DNA。人類基因組DNA提取原理principle1人類基因組DNA提取1提取方法從全血中提取12從口腔上皮脫落細(xì)胞，發(fā)根細(xì)胞中提取人類基因組DNA提取1操作方法（全血）點(diǎn)細(xì)胞裂解與RNase/蛋白酶K消化1.取100μl抗凝全血置于1.5mlEppendorf離心管中，再加入100μl裂解液和20μlRNaseA/蛋白酶K液，用移液器來(lái)回吹打混勻，室于55℃溫浴35分鐘，其間來(lái)回顛倒離心管幾次，直至溶液呈水溶狀。2.加入10μl3M的NaAc(pH4.8)，隨后加入1250μl結(jié)合緩沖液，充分振蕩混勻，12，000rpm離心30秒。人類基因組DNA提取1DNA與吸附柱的結(jié)合操作3．用移液器Tip轉(zhuǎn)移上清并加入到離心吸附柱（套好收集管）中，放置1分鐘，12，000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。注意：待轉(zhuǎn)移上清約1300μl，離心吸附柱容量約650μl，故需每次轉(zhuǎn)移上清650μl到離心吸附柱中，離心，倒掉收集管中的廢液，重復(fù)實(shí)驗(yàn)操作步驟3。人類基因組DNA提取1DNA的純化操作4.再加入600μl洗滌緩沖液（washingbuffer）到離心吸附柱（套好收集管）中，12，000rpm離心30秒。5．重復(fù)步驟4一次，12，000rpm離心3分鐘以充分除去洗滌緩沖液。6．小心取出離心吸附柱，棄收集管，將離心吸附柱套入一個(gè)干凈的1.5mlEppendorf離心管，并加入50μl洗脫緩沖液(elutionbuffer)到離心吸附柱中(洗脫緩沖液一定要加在離心吸附柱的正中)，放置1分鐘，于12，000rpm離心30秒。7．取出Eppendorf離心管，其中便是所提取基因組NA。無(wú)水乙醇沉淀時(shí)可見(jiàn)白色絮狀物0.8%瓊脂糖凝聚電泳可見(jiàn)一基因組DNA條帶OD值測(cè)定人類基因組DNA提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果experimentalresult1飽和酚吸取時(shí)記得吸取下層的有機(jī)相乙醇沉淀時(shí)，要沿離心管壁向DNA溶液中加入無(wú)水乙醇，輕輕搖動(dòng)離心管混合至體系完全均一，見(jiàn)白色絮狀DNA收集細(xì)胞的多少是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵沉淀中加入1mlSTE后，打散細(xì)胞團(tuán)便于充分消化細(xì)胞人類基因組DNA提取注意事項(xiàng)mattersneedingattention1限制性核酸內(nèi)切酶切割的原理、方法1定義限制性核酸內(nèi)切酶是可以識(shí)別特定的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一類酶，簡(jiǎn)稱限制酶。限制性核酸內(nèi)切酶切割的原理、方法1限制性核酸內(nèi)切酶分類根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu)，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型（TypeI）、第二型（TypeII）及第三型（TypeIII）。Ⅰ型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性內(nèi)切酶同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾（甲基化）作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅲ類酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA分子，然后從底物上解離。Ⅱ類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識(shí)別長(zhǎng)度為4至6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱特異核苷酸序列（如EcoRⅠ識(shí)別六個(gè)核苷酸序列：5'-G↓AATTC-3'），有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列。Ⅱ類酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中，有的在對(duì)稱軸處切割，產(chǎn)生平末端的DNA片段（如SmaⅠ：5'-CCC↓GGG-3'）；有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性末端。1限制性核酸內(nèi)切酶切割的原理、方法限制性核酸內(nèi)切酶切割的原理、方法

限制性內(nèi)切酶的作用機(jī)制1瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析應(yīng)用匯報(bào)人：

1、分析條帶出現(xiàn)拖尾原因：蛋白質(zhì)沒(méi)有去除干凈2、最下端出現(xiàn)明亮的條帶原因：樣本中含有RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析

結(jié)果分析interpretationofresult2

3、條帶的粗細(xì)原因：表明提取出的DNA的多少4、條帶沒(méi)有出現(xiàn)原因：1）膠太濃了，DNA跑不進(jìn)來(lái)2）最后洗膠的時(shí)候沖跑了瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析

結(jié)果分析interpretationofresult2瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用21檢測(cè)疾病基因2藥物靶

3基礎(chǔ)生物學(xué)應(yīng)用

人類基因組研究的一個(gè)關(guān)鍵應(yīng)用是通過(guò)位置克隆尋找未知生物化學(xué)功能的疾病基因。這個(gè)方法包括通過(guò)患病家族連鎖分析來(lái)繪制包含這些基因的染色體區(qū)域圖，然后檢查該區(qū)域來(lái)尋找基因。瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用

檢測(cè)疾病基因2

基因組序列的可用性同樣允許疾病基因的旁系同源性的快速識(shí)別，對(duì)于兩個(gè)理由是有價(jià)值的。首先，旁系同源基因的突變可以引起相關(guān)遺傳疾病。通過(guò)基因組序列使用發(fā)現(xiàn)的一個(gè)很好的例子是色盲（完全色盲）。CNGA3基因，編碼視錐體光感受器環(huán)GMP門(mén)控通道的a亞單位，顯示在一些色盲家系中存在突變體?；蚪M序列的計(jì)算機(jī)檢索揭示了旁系同源基因編碼相應(yīng)的b亞單位，CNGB3（在EST數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有出現(xiàn)）。CNGB3基因被快速認(rèn)定為是其他家系的色盲的原因。另一個(gè)例子是由早衰1和早衰2基因提供的，它們的突變可能導(dǎo)致Alzheimer疾病的的早期發(fā)生。第二個(gè)理由是旁系同源體可以提供治療敢于的機(jī)會(huì)，例子是在鐮刀狀細(xì)胞疾病或β地中海貧血的個(gè)體中試圖再次激活胚胎表達(dá)的血紅蛋白基因，它是由于β-球蛋白基因突變引起的。瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用

檢測(cè)疾病基因2

在過(guò)去的世紀(jì)里，制藥產(chǎn)業(yè)很大程度上依賴于有限的藥物靶來(lái)開(kāi)發(fā)新的治療手段。最近的綱要列舉了483個(gè)藥物靶被看作是解決了市場(chǎng)上的所有藥物。知道了人類的全部基因和蛋白質(zhì)將極大的擴(kuò)展合適藥物靶的尋找。雖然，僅僅人類的小部分基因可以作為藥物靶，可以預(yù)測(cè)這個(gè)數(shù)目將在幾千之上，這個(gè)前景將導(dǎo)致基因組研究在藥物研究和開(kāi)發(fā)中的大規(guī)模開(kāi)展。瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用

藥物靶2

半胱氨?；兹┑氖湛s和炎癥作用，先前認(rèn)為是過(guò)敏反應(yīng)的慢反映物質(zhì)（SRS-A），通過(guò)特定的受體介導(dǎo)。第二個(gè)類似的受體，CysLT2，使用老鼠EST和人類基因組序列的重組得到識(shí)別。這導(dǎo)致了與先前識(shí)別的唯一的其它受體有38%氨基酸一致性的基因的克隆。這個(gè)新的受體，顯示高的親和力和幾個(gè)白三烯的結(jié)合，映射在與過(guò)敏性哮喘有關(guān)的第13號(hào)染色體區(qū)域上。這個(gè)基因在氣道平滑肌和心臟中表達(dá)。作為白三烯途徑中抗哮喘藥物開(kāi)發(fā)中一個(gè)重要的靶，新受體的發(fā)現(xiàn)有明顯的重要的作用瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用

藥物靶2

人體基因組圖譜是全人類的財(cái)產(chǎn)，這一研究成果理應(yīng)為全人類所分享、造福全人類，這是參與人類基因組工程計(jì)劃的各國(guó)科學(xué)家的共識(shí)。值得關(guān)注的是，目前在人類基因組研究領(lǐng)域，出現(xiàn)了一些私營(yíng)公司爭(zhēng)相為其成果申請(qǐng)專利的現(xiàn)象。美國(guó)塞萊拉基因公司曾表示，想把一部分研究成果申請(qǐng)專利，有償提供給制藥公司。瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用

基礎(chǔ)生物學(xué)2

找到了一批主宰人體疾病的重要基因如：肥胖基因、支氣管哮喘基因。這類基因的新發(fā)現(xiàn)每年都有新報(bào)道。這些基因的發(fā)現(xiàn)，增進(jìn)了人們對(duì)許多重要疾病機(jī)理的理解，并且推動(dòng)整個(gè)醫(yī)學(xué)思想更快的從重治療轉(zhuǎn)向重預(yù)防。例如：湖南醫(yī)科大學(xué)夏家輝教授組于1998.5.28發(fā)表克隆了人類神經(jīng)性高頻性耳聾的致病基因（GJB3），這是第一次在中國(guó)克隆的基因。瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用

基礎(chǔ)生物學(xué)2人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取RT-PCR的原理、方法匯報(bào)人：人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取3真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中總RNA主要由rRNA、tRNA和核內(nèi)小分子RNA、mRNA組成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于細(xì)胞質(zhì)中。人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取3一般步驟

破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA破碎：可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織加入β-ME可以抑制RNA酶活性分離：一半用酚、氯仿等有機(jī)溶劑，加入少量異戊醇，經(jīng)過(guò)此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開(kāi)。一半用酚、氯仿等有機(jī)溶劑，加入少量異戊醇，經(jīng)過(guò)此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開(kāi)。沉淀：一般用乙醇、3MNaAc（pH-5.2）或異丙醇。洗滌：使用70％乙醇洗滌，有時(shí)，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過(guò)于干燥，否則不易溶解。溶解：一般使用TE。保存：應(yīng)該盡量低溫人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取具體操作operation33分析不同發(fā)育時(shí)期基因的表達(dá)狀況獲得新基因研究基