b第六章植物基因工程上

基因工程第六章植物基因工程（上）湖南科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第六章植物基因工程（上）一、植物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本路線轉(zhuǎn)基因的受體系統(tǒng)外源基因?qū)胫参锏姆椒ǘ⑥D(zhuǎn)基因植物的篩選與檢測報(bào)告基因分子生物學(xué)檢測方法轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物（transgenicplant)：指利用基因工程技術(shù)，在離體條件下對不同生物的DNA進(jìn)行加工，并按照人們的意志和適當(dāng)?shù)妮d體相連，在將重組DNA轉(zhuǎn)入生物體或細(xì)胞內(nèi)，并使其在生物體或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的植物。轉(zhuǎn)基因植物通常具有高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、抗病蟲、耐寒、抗高溫、提高某些成分含量等優(yōu)良性狀。轉(zhuǎn)基因植物的種植，將會帶來全球種植業(yè)的“第二次綠色革命”。一、植物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)1939年white和Gatheret用實(shí)驗(yàn)方法培養(yǎng)植物組織和器官以來，經(jīng)過不斷的發(fā)展，植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為一門精細(xì)的實(shí)驗(yàn)科學(xué)。植物的體細(xì)胞具有全能性：即單個細(xì)胞經(jīng)過合適的培養(yǎng)，通過愈傷組織器官分化或體細(xì)胞胚胎分化途徑再生出完整的植株。一般先通過植物激素等調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)植物細(xì)胞進(jìn)行分裂，獲得再生的愈傷組織，通過激素誘導(dǎo)可獲得再生的植株。（一）植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（一）植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)植物細(xì)胞的全能性（二）植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本路線分離目的基因；將目的基因克隆到適當(dāng)?shù)妮d體上形成重組DNA；利用細(xì)菌繁殖擴(kuò)增重組DNA;利用基因槍、農(nóng)桿菌等方法將重組DNA導(dǎo)入到目標(biāo)植物的細(xì)胞中；篩選含有外源基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株；轉(zhuǎn)基因植株大規(guī)模種植。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本路線（三）轉(zhuǎn)基因的受體系統(tǒng)植物組織受體系統(tǒng)；植物細(xì)胞原生質(zhì)體系統(tǒng)；生殖細(xì)胞受體系統(tǒng);葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。1.植物組織受體系統(tǒng)受傷的細(xì)胞容易受到病毒或質(zhì)粒的感染，這些病毒或質(zhì)粒通過不同的方式轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞，并形成愈傷組織。愈傷組織可以培養(yǎng)成完整的轉(zhuǎn)化植株。該受體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化率高，可獲得較多的轉(zhuǎn)化植株，取材廣泛，適應(yīng)性強(qiáng)。但再生植株無性變異較大，轉(zhuǎn)化的外源基因穩(wěn)定性差。2.植物細(xì)胞原生質(zhì)體系統(tǒng)原生質(zhì)為植物細(xì)胞去壁后的部分，具有全能性。原生質(zhì)體在體外較易完成一系列細(xì)胞或遺傳操作，可以直接高效捕獲外源基因。但轉(zhuǎn)基因植株穩(wěn)定性差，培養(yǎng)周期長，難度大，再生頻率低。2.植物細(xì)胞原生質(zhì)體系統(tǒng)植物原生質(zhì)體的制備3.生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)是以植物生殖細(xì)胞，如花粉細(xì)胞、卵細(xì)胞為受體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。一是利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行花粉細(xì)胞和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng)，形成愈傷組織，進(jìn)一步分化成單倍體植株，建立單倍體的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；二是利用花粉和卵細(xì)胞受精過程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導(dǎo)入法、花粉粒浸泡法等。具有全能性的生殖細(xì)胞為受體細(xì)胞，具有更強(qiáng)的接受外源DNA的潛能，缺點(diǎn)是該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化受季節(jié)限制，只能在開花期進(jìn)行，且不適用無性植物。4.葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)外源基因可以在葉綠體中穩(wěn)定表達(dá)，且葉綠體作為外源基因的轉(zhuǎn)化受體又有很多的優(yōu)越性：

便于外源基因的定位整合；

基因?yàn)槎嗫截悾磉_(dá)量高；

導(dǎo)入的外源基因性狀穩(wěn)定性高、安全性好；

能直接表達(dá)原核基因。（四）外源基因?qū)胫参锏姆椒―NA直接轉(zhuǎn)移法：化學(xué)刺激法；電擊法；顯微注射法；基因槍法；脂質(zhì)體介導(dǎo)法；微激光束法；花粉通道法2.載體介導(dǎo)法：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法；植物病毒DNA介導(dǎo)法。DNA直接轉(zhuǎn)移法是指通過物理化學(xué)法將外源基因直接轉(zhuǎn)入受體植物細(xì)胞的方法。最大的特點(diǎn)是無宿主范圍，外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，最終整合到植物基因組中。該法特別適用于單子葉植物。A.化學(xué)刺激法植物細(xì)胞的原生質(zhì)體經(jīng)過某些化學(xué)藥品（PEG、PNA、磷酸鈣、氯化鈣）處理后，能夠捕獲外源DNA。此法對細(xì)胞傷害少，易于選擇轉(zhuǎn)化體，受體植物不受種類限制。在適當(dāng)?shù)耐饧与妷合?，?xì)胞膜可能被擊穿，但不影響或很少影響細(xì)胞質(zhì)的生命活動，移去外加電壓后，膜孔在一定時間內(nèi)可以自動恢復(fù)，細(xì)胞膜這種可逆性的變化使得溶液中的大分子物質(zhì)（DNA）進(jìn)入細(xì)胞?？赡鎿舸┑呐R界電壓、脈沖時間長度、溫度、PEG的濃度和處理時間、細(xì)胞類型等都影響到轉(zhuǎn)化的頻率。B.電擊法在適當(dāng)?shù)耐饧与妷合?，?xì)胞膜可能被擊穿，但不影響或很少影響細(xì)胞質(zhì)的生命活動，移去外加電壓后，膜孔在一定時間內(nèi)可以自動恢復(fù)，細(xì)胞膜這種可逆性的變化使得溶液中的大分子物質(zhì)（DNA）進(jìn)入細(xì)胞。可逆擊穿的臨界電壓、脈沖時間長度、溫度、PEG的濃度和處理時間、細(xì)胞類型等都影響到轉(zhuǎn)化的頻率。C.顯微注射法D.基因槍法利用帶有外源DNA的金粉或鎢粉微粒經(jīng)過放電或機(jī)械加速后對細(xì)胞射擊。其過程為先用CaCl2、亞精胺或聚乙二醇沉淀外源DNA，然后將外源DNA與球狀鎢、金等金屬顆粒共同溫育，使DNA吸附于金屬表面，再利用基因槍加速包裹了外源DNA的顆粒，使之穿過細(xì)胞壁及細(xì)胞膜，進(jìn)入受體細(xì)胞。轉(zhuǎn)化受體迅速、簡單、取材廣泛、植株可育性高等優(yōu)點(diǎn)，但有轉(zhuǎn)化效率低、儀器昂貴、不易獲得再生植株等缺點(diǎn)。D.基因槍法基因槍法用于植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化E.脂質(zhì)體介導(dǎo)法脂質(zhì)體為人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜結(jié)構(gòu)，包裹在脂質(zhì)體內(nèi)的外源DNA可免受酶的降解。當(dāng)脂質(zhì)體與植物原生質(zhì)體共溫育時，脂質(zhì)體內(nèi)的外源DNA通過融合或吞噬作用高效率地轉(zhuǎn)運(yùn)到原生質(zhì)體細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)。該法轉(zhuǎn)化效率高，適用植物種類廣，重復(fù)性高，簡單易操作。但局限性在于只能用在有原生質(zhì)體再生出植株的植物。F.微激光束法利用激光微束脈沖引起細(xì)胞膜可逆性穿孔，從而將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。先在熒光顯微鏡下找到合適的細(xì)胞，然后用激光光源替代熒光光源，使目的細(xì)胞的細(xì)胞壁被激光微束脈沖擊穿，外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞。G.花粉通道法法是將外源DNA片段在自花授粉后的特定時期注入柱頭或花粉，外源DNA沿花粉管通道或傳遞組織通過珠心進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化不具備正常細(xì)胞壁的受精卵、合子及早期的胚體細(xì)胞。參與了被轉(zhuǎn)化植物的生殖過程，直接操作于整體植株，避免了傳統(tǒng)的基因槍法和土壤桿菌轉(zhuǎn)化法所要求的組織培養(yǎng)技術(shù)，轉(zhuǎn)化方法簡單、易操作，育種時間短。但此方法仍存在爭議，一些理論問題未得到合理的解釋。載體介導(dǎo)法是指通過農(nóng)桿菌或植物病毒介導(dǎo)感染受體植物，將外源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的技術(shù)。主要包括Ti質(zhì)粒及植物病毒DNA介導(dǎo)法。A.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法農(nóng)桿菌介導(dǎo)法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物A.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法1、為根瘤土壤桿菌提供附著與植物細(xì)胞壁的能力；2、參與寄主細(xì)胞制造植物激素（生長素和分裂素）的能力；3、決定所誘導(dǎo)的腫瘤的形態(tài)特征和冠嬰堿成分；4、賦予寄主菌株對土壤桿菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素的反應(yīng)性；5、決定宿主菌株的植物寄主范圍；6、具有對噬菌體的排外性，抑制噬菌體的生長與發(fā)育。Ti質(zhì)粒的遺傳特性O(shè)ri區(qū)：控制質(zhì)粒的自我復(fù)制T-DNA區(qū)：農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞時，從Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA，也稱轉(zhuǎn)移DNA。隨機(jī)整合到植物基因組位點(diǎn)上。vir區(qū)：該區(qū)段上的基因能激活T-DNA的轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌顯出毒性，也稱為毒區(qū)。Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)T-DNA的長度在12-24kb間，在其5’及3’端都有真核表達(dá)信號，如TATAbox