2021年土壤中放線菌的分離與純化

土壤中放線菌的分離與純化歐陽光明(2021.03.07)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握放線菌的生長(zhǎng)特性，微生物的培養(yǎng)方法。2掌握微生物實(shí)驗(yàn)的基本生物技術(shù)，主要包括無菌操作技術(shù)，純種分離技術(shù)，純種培養(yǎng)技術(shù)，以及抗生素檢測(cè)等。3掌握合成培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)基的制備方法。4學(xué)習(xí)對(duì)微生物實(shí)驗(yàn)的中出現(xiàn)問題的分析，解決方法實(shí)驗(yàn)材料藥品：可溶性淀粉、KNO3、NaCUK2HPO4-3H2O.MgSO4-7H2O.FeSO4-7H2O.瓊脂、重洛酸鉀其他：高壓蒸汽滅菌鍋.扭力天平、藥匙、燒杯.量筒、玻璃棒、三角瓶、試管.牛皮紙、硫酸紙、線繩.無菌培養(yǎng)DB.鐵鍬、小鏟、酒精棉球、躡子、玻璃鉛筆。實(shí)驗(yàn)原理放線菌杲重要的抗生素產(chǎn)生菌，主要分布在土壤中(主要是鏈霉菌)，其數(shù)量?jī)H次于細(xì)菌。一般在中性偏砌性、有機(jī)質(zhì)豐富、通氣性好的土壤中含量較多。由于土壤中的微生物是各種不同種類微生物的混合體，為了研究某種微生物，就必須把它們從這些混雜的微生物群體中分離出來，從而獲得某一菌株的純培養(yǎng)。分離放線菌常用稀釋倒平板法。根據(jù)放線菌的營(yíng)養(yǎng)、酸堿度等條件要求，常選用合成培養(yǎng)基或有機(jī)氮培養(yǎng)基。如果培養(yǎng)基成分改變，或土壤預(yù)先處理（120°C熱處理lh）,或加入某種抑制劑（如加數(shù)滴10%酚等），都可以使細(xì)菌，霉菌出現(xiàn)的數(shù)量大大減少，從而淘汰了其它雜菌。再通過稀釋法，使放線菌在固體培養(yǎng)基上形成單獨(dú)菌落，并可得到純菌株。放線菌可以產(chǎn)生抗生素，抑制其他菌種的生長(zhǎng)，故可用金黃色葡萄球菌（G+）和大腸桿菌（G-）作指示菌鑒別放線菌。高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基是培養(yǎng)放線菌的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基是采用化學(xué)成分完全了解的純?cè)噭┡渲贫傻呐囵B(yǎng)基，高氏一號(hào)培養(yǎng)基：碳源為可溶性淀粉、氮源為KNO3、NaCl.K2HPO4-3H2O.MgSO4-7H2O作為無機(jī)鹽，F(xiàn)eSO4-7H2O作為微生物的微量元素，提供鐵離子等組成1?高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基的制備K2HPO4?3H2O0.125g,可溶性淀粉5g,硝酸鉀0.25,MgSO4?7H2O0.125g,FeSO4>7H2O0.025g,氯化鈉0.125g,瓊脂5g,水250mlo配制時(shí)，先依次加入上述藥品（除瓊脂外）順序溶解，加入無菌水至250ml,調(diào)節(jié)pH=7.4,再加入瓊脂不斷攪拌震蕩至溶化后，121?滅菌20分鐘。將6套平皿、12只試管滅菌。土壤中放線菌的分離編號(hào)，分裝：取6套無菌平皿，在皿底貼上標(biāo)簽，注明土壤稀釋液的稀釋度(10-3-10七10-5)。每個(gè)稀釋度做兩個(gè)培養(yǎng)Wo然后在每皿中倒入己溶化并冷凝至50°C左右的高氏一號(hào)培養(yǎng)基15?20ml左右，待冷凝成平板。另取5支盛有9ml—只盛有10ml無菌水的試管，排列于試管架上，依次標(biāo)明10—10三10*10」、10210%稀釋傾注分離稱lg土樣放入10ml無菌水試管中振蕩lOmin,即10“的土壤懸液，靜置30s。用無菌吸管無菌操作取10"濃度的土壤懸液lml并加入編號(hào)10-2的無菌試管中，并吹吸吸管2?3次，吸時(shí)伸入管底，吹時(shí)離開水面，使其混合均勻。即為IO"濃度的土壤稀釋液。依此類推，直到稀釋至10-5的試管中(每個(gè)稀釋度換1支無菌吸管)。如圖倒平板分離培養(yǎng)于上述盛有不同稀釋度菌液的培養(yǎng)HD中，倒入溶化后冷卻至45°C左右的高氏培養(yǎng)基約10-15ml,置水平位置，迅速旋動(dòng)混勻，待凝固。（若融化的培養(yǎng)基溫度太高，會(huì)產(chǎn)生太多的冷凝水，影響觀察。）用1血無菌吸管分別精確地吸取10」、10210-6的稀釋菌液lml,對(duì)號(hào)放入編好號(hào)的無菌培養(yǎng)皿中，每一濃度對(duì)應(yīng)兩個(gè)平板。用無菌涂布棒（從濃度小液開始）將加入平板培養(yǎng)基上的土壤稀釋液在整個(gè)平板表面涂勻，涂完一個(gè)平板用酒精燈滅菌。稀釋涂布平板法4培養(yǎng)接種完畢，將平皿和試管放入28°C恒溫箱培養(yǎng)7天，觀察平皿上放線菌（主要杲鏈霉菌）菌落。菌種純化1、 倒平板將加熱融化的高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基倒平板，并標(biāo)號(hào)。2、 平板劃線劃線的方法很多，但無論哪種方法劃線，其目的都是通過劃線將樣品在平板上逬行稀釋，使形成單個(gè)菌落。常用的劃線方法有下列二種：圖V-3劃線分離示意圖⑴分區(qū)劃線用接將培養(yǎng)皿底部用姆指和無名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)m［稍微打開。在此同時(shí)，用環(huán)狀接種針在火焰旁刮取少許菌苔，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線6一7條，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70°角，用燒過冷卻的接種針，通過第1

次劃線部分作第2次平行劃線（圖V-3）,然后再用同樣方法，作第3次平行劃線。劃線時(shí)，接種針應(yīng)與平板表面成30。角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。劃線完畢后，蓋上HD蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。⑵連續(xù)劃線將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線（圖V-4,B）。劃線完畢后，蓋上All蓋，倒置28°C培養(yǎng)。AV—4AV—4劃線分離示意圖拮抗實(shí)驗(yàn)長(zhǎng)出菌落后，要判斷是否已分離到了純菌種。1配置鑒別培養(yǎng)基配置金黃色葡萄球菌和大腸桿菌培養(yǎng)基。2標(biāo)號(hào)在兩平板上標(biāo)注均勻間隔的7個(gè)區(qū)域。2挑菌落在純培養(yǎng)的平板上切取生長(zhǎng)較好的放線菌落依次放入標(biāo)注區(qū)域中（在火焰旁切?。?，置于28°C恒溫箱培養(yǎng)1天后可觀察到有抑菌圈生成。討論1高氏培養(yǎng)基的配置關(guān)鍵是pH值的調(diào)節(jié)和重輅酸鉀的加入。放線菌的最適生長(zhǎng)條件是23?37,pH7.0—7.5,而在同樣條件下也利于霉菌生長(zhǎng)。在高溫殺菌下，放線菌和霉菌的鞄子仍可以存活，所以必須加入重洛酸鉀抑制霉菌和細(xì)菌的生長(zhǎng)（對(duì)放線菌無抑制作用）。否則霉菌大量生長(zhǎng)。如圖培養(yǎng)基配置時(shí)各成分的溶解順序應(yīng)是先加緩沖化合物，后是主要元素、次要元素。調(diào)節(jié)pH值時(shí)，加入酸堿要緩慢、少量.多加攪拌，防止局部過酸或過堿而破壞營(yíng)養(yǎng)成分。我們第一次配置的高氏培養(yǎng)基很可能就是由于酸堿調(diào)節(jié)時(shí)酸堿過量和未加入重洛酸鉀而導(dǎo)致失收。2放線菌可以產(chǎn)生色素，且放線菌代表屬也分好幾種。其菌落—般為圓形，菌落質(zhì)地致密表面呈較緊密的絨狀或堅(jiān)實(shí)、干燥.多皺，地衣狀。表面干燥?？勺鳛殍b別菌種的基本參考依據(jù)。鞄子絲生長(zhǎng)到一定階段可形成鞄子由于鞄子含有不同色素，成熟的鞄子堆也表現(xiàn)出特定的顏色，而且在一定條件下比較穩(wěn)定，故也是鑒定菌種的依據(jù)之一。但鞄子的形態(tài)和大小不能籠統(tǒng)地作為分類鑒定的重要依據(jù)。3整個(gè)過程要保證在無菌條件下進(jìn)行，培養(yǎng)基及儀器可用高壓蒸汽滅菌。接種時(shí)，實(shí)驗(yàn)桌要用95%的酒精擦拭，且在接種時(shí)要在火焰區(qū)的無菌范圍內(nèi)（空氣中含有大量灰塵、細(xì)菌和霉菌匏子等造成污染），且打開培養(yǎng)基時(shí)間盡量短。4稀釋倒平板法時(shí)涂布要均勻，否則，細(xì)菌密度不均導(dǎo)致菌落生長(zhǎng)過于集中，細(xì)菌無法充分利用營(yíng)養(yǎng)成分影響生長(zhǎng)，且在鑒別時(shí)較難看到明顯的抑菌圈。稀釋時(shí)除了應(yīng)用平板涂布外還用了劃線法。涂布主要是通過稀釋溶液方法減少細(xì)菌分布密度，劃線法