酶工程考試重點

第一章：緒論?酶：由生物體產(chǎn)生的具有生物催化功能的生物大分子，按照分子中起催化作用的主要組分的不同，自然界中天然存在的酶可以分為蛋白類酶(proteinenzyme)和核酸類酶酶工程：酶的生產(chǎn)、改性與應(yīng)用的技術(shù)過程稱為酶工程鎖與鑰匙學(xué)說：底物結(jié)構(gòu)必須與酶活性部位的結(jié)構(gòu)非?；パa，就像鎖與鑰匙一樣，這樣才能緊密結(jié)合，形成酶-底物復(fù)合物。這個學(xué)說可以解釋酶的絕對專一性，但是不能解釋酶的相對專一性。?誘導(dǎo)契合理論：酶分子活性中心的結(jié)構(gòu)并不與底物分子的結(jié)構(gòu)互補，但活性中心有一定的柔性，當(dāng)?shù)孜锓肿优c酶分子相遇時可以誘導(dǎo)酶蛋白的構(gòu)象發(fā)生相應(yīng)的變化，使活性中心的各個結(jié)合基團與催化基團達到對底物結(jié)構(gòu)正確的空間排布與定向，從而使酶與底物互補結(jié)合，產(chǎn)生酶-底物復(fù)合物，并使底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)?中間產(chǎn)物學(xué)說：酶首先與底物結(jié)合成酶-底物復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)變成酶-過渡態(tài)中間物復(fù)合物，然后，生成酶-產(chǎn)物復(fù)合物，最后從酶分子上釋放產(chǎn)物，從而大大降低反應(yīng)的活化能(分子由基態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫^渡態(tài)即活化態(tài)所需的能量)。Km值是當(dāng)酶反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度?競爭性抑制：抑制劑競爭性與酶的活性中心結(jié)合，從而阻止底物與酶的結(jié)合。這是最常見的一種可逆抑制作用。隨著底物濃度增加，酶的抑制作用減弱。Vm不變，Km增大非競爭性抑制：底物和抑制劑可以同時與酶結(jié)合，抑制劑結(jié)合于活性中心以外的部位，兩者沒有競爭作用，但影響產(chǎn)物的釋放，Vm降低，Km不變?反競爭性抑制 Vm降低，Km減小酶活力：酶催化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的能力。測定酶活力，實際上就是測定酶促反應(yīng)進行的速度。酶促反應(yīng)速度越快，酶活力就越大；反之，速度越慢，酶活力就越小。酶的比活力：每毫克酶蛋白(酶制劑)所含的酶活力單位數(shù)稱為酶的比活力，用U/mg蛋白表示。酶的比活力是酶制劑的一個純度指標(biāo)。對同一種酶來說，比活力愈高，表明酶純度愈高。酶的生產(chǎn)方法：?提取分離法；生物合成法；化學(xué)合成法第二章：微生物發(fā)酵產(chǎn)酶結(jié)構(gòu)基因、操縱基因與啟動基因一起組成操縱子，分為誘導(dǎo)型與阻遏型。?誘導(dǎo)(induction)P33組成酶：細(xì)胞固有的酶類。誘導(dǎo)酶：是細(xì)胞為適應(yīng)外來底物或其結(jié)構(gòu)類似物而臨時合成的一類酶。?阻遏(repression)P33在無阻遏物情況下，基因表達正常，當(dāng)有阻遏物存在時，轉(zhuǎn)錄受到阻遏，如色氨酸操縱子。分解代謝物阻遏(cataboliterepression)反饋阻遏(feedbackrepression)酶合成誘導(dǎo)的現(xiàn)象一JacobandMonod的工作：已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶；-半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶。實驗：1?大腸桿菌生長在葡萄糖培養(yǎng)基上時，細(xì)胞內(nèi)無上述三種酶合成；2?大腸桿菌生長在唯一碳源乳糖培養(yǎng)基上時，細(xì)胞內(nèi)有上述三種酶合成；當(dāng)換成葡萄糖培養(yǎng)基時，三種酶基本消失；3?表明菌體生物合成的經(jīng)濟原則：需要時才合成。酶合成阻遏的現(xiàn)象一JacobandMonod的工作：實驗：1?大腸桿菌生長在無機鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時，檢測到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在；2?在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。3?表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌生長的經(jīng)濟原則：不需要就不合成。分解代謝物阻遏現(xiàn)象：實驗：細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長，優(yōu)先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產(chǎn)生了兩個對數(shù)生長期中間隔開一個生長延滯期的“二次生長現(xiàn)象”這一現(xiàn)象又稱葡萄糖效應(yīng)，產(chǎn)生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是環(huán)腺苷酸受體蛋白（CRP），亦稱降解物基因活化蛋白（CAP）。分解代謝物阻遏：指細(xì)胞內(nèi)同時有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時，利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。分解代謝物阻遏作用實際上是cAMP通過啟動基因?qū)γ干锖铣蛇M行調(diào)節(jié)控制。?因此在培養(yǎng)環(huán)境中控制好某些容易降解物質(zhì)的量，或者添加一定量的cAMP,均可減少或解除分解代謝物阻遏作用。影響酶生物合成模式的主要因素：（1）mRNA的穩(wěn)定性；（2）培養(yǎng)基中阻遏物存在與否。通過分析比較細(xì)胞生長與酶產(chǎn)生的關(guān)系，可以把酶生物合成的模式分為4種類型。即同步合成型，延續(xù)合成型，中期合成型和滯后合成型。第三章動植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶?三者之間的差異主要有：植物細(xì)胞〉動物細(xì)胞〉微生物細(xì)胞。動物細(xì)胞、植物細(xì)胞的生產(chǎn)周期比微生物長。植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的營養(yǎng)要求較簡單。植物細(xì)胞的生長以及次級代謝物的生產(chǎn)要求一定的光照。植物細(xì)胞和動物細(xì)胞對剪切力敏感。植物、微生物和動物細(xì)胞的主要目的產(chǎn)物各不相同。第四章：酶的分離純化細(xì)胞破碎：1）機械破碎；2）物理破碎；3）化學(xué)破碎；4）酶解破碎酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。也稱為酶的抽提。沉淀分離：沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。離心分離是借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。?萃取分離是利用物質(zhì)在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術(shù)。萃取分離中的兩相一般為互不相溶的兩個液相。有時也可采用其它流體?；厥章剩夯厥章适侵柑峒兦芭c提純后酶的總活力之比。它表示提純過程中酶的損失程度，回收率愈高，其損失愈少。提純倍數(shù)：提純倍數(shù)是指提純前后兩者比活力之比。它表示提純過程中酶純度提高的程度，提純倍數(shù)愈大，提純效果愈佳。?判斷一個分離純化方法的優(yōu)劣，常用總活力的回收率和比活力的提純倍數(shù)兩個指標(biāo)借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆粒或分子進行分離的技術(shù)稱為膜分離。膜分離過程中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^，而把大于其孔徑的顆粒截留。第五章：酶的分子修飾酶在實際應(yīng)用中有局限性：作為異體蛋白在體內(nèi)難于吸收、易引起免疫反應(yīng)和被識別降解；酶蛋白經(jīng)不起溫度、酸堿、有機溶劑及時間的考驗，半衰期短、易變性失活；酶的活性、作用專一性和最適條件不一定能適應(yīng)生產(chǎn)工藝要求，限制了酶制劑的應(yīng)用范圍。通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變,從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。活性中心：結(jié)合基團和催化基團活性中心的共性：⑴活性部位只占酶分子很小的一部分(1-2%)。活性部位是一個三維實體?；钚灾行奈挥诿阜肿颖砻娴氖杷粤芽p中?；钚灾行臉?gòu)象不是固定不變的(誘導(dǎo)契合)。酶與底物通過鹽鍵、氫鍵、范德華力和疏水作用等次級鍵結(jié)合。酶分子修飾的意義：提高酶的活力；增強酶的穩(wěn)定性；降低或消除酶的抗原性；研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象的影響大分子結(jié)合修飾：采用水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團結(jié)合，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的催化特性的方法稱為大分子結(jié)合修飾。大分子修飾(共價)的過程：修飾劑的選擇：大分子結(jié)合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子;修飾劑的活化：作為修飾劑中含有的基團往往不能直接與酶分子的基團進行反應(yīng)而結(jié)合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過活化，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團進行反應(yīng)。修飾：將帶有活化基團的大分子修飾劑與經(jīng)過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應(yīng)一段時間，使修飾劑的活化基團與酶分子的某側(cè)鏈基團以共價鍵結(jié)合，對酶分子進行修飾。分離：需要通過凝膠層析等方法進行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。酶修飾后的性質(zhì)變化：熱穩(wěn)定性：一般來說，熱穩(wěn)定性有較大的提高?？乖裕罕容^公認(rèn)的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。各類失活因子的抵抗力：修飾酶對蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強對熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長了在體內(nèi)的半衰期。最適pH：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應(yīng)用研究上有時具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。Km的變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，Vm沒有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾后，Km值變大。第六章酶、細(xì)胞、原生質(zhì)體固定化固定化酶是指固定在一定載體上并在一定的空范圍內(nèi)進行催化反應(yīng)的酶酶的固定化：采用各種方法，將酶固定在水不溶性的載體上，制備成固定化酶的過程。吸附法：利用各種固體吸附劑將酶吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。常用的吸附劑：活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石、咼嶺土、石英沙、火棉膠等。包埋法：將酶包埋在各種多孔載體中(高分子凝膠或高分子半透膜)，使酶固定化的方法。常用載體：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、淀粉、明膠、膠原、和卡拉膠等高分子化合物結(jié)合法：選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵，與酶結(jié)合在一起的固定化方法，稱為結(jié)合法。常用載體：各種陰、陽離子交換劑°DEAE-纖維素、TEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠交聯(lián)法：利用雙功能試劑或多功能試劑在酶分子間，酶分子與惰性蛋白間，或酶分子與載體間進行交聯(lián)反應(yīng)，以共價鍵制備固定化酶的方法。常用雙功能和多功能試劑：雙功能試劑：戊二醛、乙二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯多功能試劑：甲苯-2-異氰-4-異硫氰其中最常用的是戊二醛熱處理法：將含酶細(xì)胞在一定溫度下加熱處理一段時間，使酶固定在菌體內(nèi)，而制備得到固定化菌體的方法固定化酶的性質(zhì)：構(gòu)象改變、立體屏蔽；分配效應(yīng)、擴散限制；微擾?性質(zhì)變化：固相酶的穩(wěn)定性比游離酶高，主要表現(xiàn)在以下幾個方面：①熱穩(wěn)定性：固定化酶熱穩(wěn)定性較之天然酶提高。②對蛋白酶水解作用穩(wěn)定性：固相酶比天然酶有更強的抵抗蛋白酶水解作用的能力。③對變性試劑作用的穩(wěn)定性：固相酶對各種蛋白變性劑的穩(wěn)定性，一般都比天然酶強。④保藏穩(wěn)定性：固相酶比天然酶保存的時間更長。最適溫度：①固相酶的最適溫度一般比天然酶高，個別會有所降低。②同種酶，采用不同的方法或不同載體固定化后，其最適溫度可能不同。最適pH：酶經(jīng)固定化后，其作用的最適pH常會發(fā)生偏移，影響固定化酶最適PH的因素主要有兩個。載體性質(zhì)對最適pH影響：用帶負(fù)電荷載體制備的固定化酶，最適pH比游離酶最適pH高。用帶正電荷載體制備的固定化酶，最適pH比游離酶最適pH低。用不帶電荷載體制備的固定化酶，最適pH一般不改變。產(chǎn)物性質(zhì)對最適pH影響；若酶催化反應(yīng)產(chǎn)物為酸性時，固定化酶最適pH比游離酶的最適pH要高。若酶催化反應(yīng)產(chǎn)物為堿性時，固定化酶最適pH比游離酶的最適PH要低。若酶催化反應(yīng)產(chǎn)物為中性時，固定化酶最適pH不變。底物特異性：固定化酶底物特異性與游離酶相比，有一定變化，一般為：作用于小分子底物的酶類經(jīng)固定化后，專一性基本不變。而既可作用大分子也可作用小分子底物的酶類經(jīng)固定化后專一性會發(fā)生變化。固定化酶的應(yīng)用：①氨基?；福哼@是世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶，從米曲霉中提取分離得到的氨基?；?，用DEAE-葡聚糖凝膠為載體通過離子鍵結(jié)合法制成固定化酶，用來拆分DL-乙酰氨基酸，連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸；②葡萄糖異構(gòu)酶：這是世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。將培養(yǎng)好的含葡萄糖異構(gòu)酶的放線菌細(xì)胞用60?65°C熱處理15min,該酶就固定在菌體上，制成固定化酶，用于連續(xù)生產(chǎn)果葡糖漿。破壁使用的酶：主要根據(jù)細(xì)胞壁的主要成分不同而進行選擇。細(xì)菌胞壁：主要成份為肽多糖，使用酶為溶菌酶。酵母胞壁：主要成份為B-葡聚糖，使用酶為B-1.3-葡聚糖酶。霉菌胞壁：主要成份為幾丁質(zhì)及其它，使用酶為幾丁質(zhì)酶及其它有關(guān)酶植物胞壁：主要成份為纖維素、半纖維素、果膠，使用酶為纖維素酶和果膠酶等。固定化酶與固定化細(xì)胞異同點：相同點1） 兩者都由載體固定在一定的空間范圍內(nèi)2） 兩者都可以通過包埋法與吸附法進行固定化3） 兩者都由于有載體的保護作用，穩(wěn)定性顯著提高4） 兩者都可以反復(fù)使用或連續(xù)使用一段較長時間不同點1） 目的不同：固定化酶催化各種生物化學(xué)反應(yīng)，固定化細(xì)胞用于胞外酶的生產(chǎn)2） 方法不同：細(xì)胞固定化方法主要有吸附法、包埋法、直接固定法。3） 變化情況不同：固定化原生質(zhì)體的應(yīng)用：胞內(nèi)酶生產(chǎn)：用固定化枯草桿菌原生質(zhì)體生產(chǎn)堿性磷酸酶，使原來存在于細(xì)胞間質(zhì)中的堿性磷酸酶，全部分泌到發(fā)酵液中，提高產(chǎn)率36%，可連續(xù)使用37天;用固定化黑曲霉原生質(zhì)體生產(chǎn)葡萄糖氧化酶，使細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖氧化酶90%以上分泌到發(fā)酵液中。固定化細(xì)胞與固定化原生質(zhì)體有哪些異同點？第七章：酶的非水相催化?有機介質(zhì)中的酶催化:有機介質(zhì)中的酶催化是指酶在含有一定量水的有機溶劑中進行的催化反應(yīng)。適用于底物、產(chǎn)物兩者或其中之一為疏水性物質(zhì)的酶催化作用。酶在有機介質(zhì)中由于能夠基本保持其完整的結(jié)構(gòu)和活性中心的空間構(gòu)象，所以能夠發(fā)揮其催化功能。維持酶分子完整的空間構(gòu)象所必需的最低水量稱為必需水。有機介質(zhì)中水的含量對酶催化反應(yīng)速度有顯著影響。存在最適水含量。酶在有機介質(zhì)中的催化特性：酶在有機介質(zhì)中起催化作用時，由于有機溶劑的極性與水有很大差別，對酶的表面結(jié)構(gòu)、活性中心的結(jié)合部位和底物性質(zhì)都會產(chǎn)生一定的影響，從而顯示出與水相介質(zhì)中不同的催化特性底物特異性I;立體選擇性I；區(qū)域選擇性I；鍵選擇性：有機溶劑中特有；熱穩(wěn)定性f；pH特性：接近或者相同非水相中酶促反應(yīng)的特點：有利于疏水性底物的反應(yīng)，能催化在水中不能進行的反應(yīng)?？商釂J酶的熱穩(wěn)定性?？筛淖兎磻?yīng)平衡移動方向?？煽刂频孜飳Ｒ恍?。酶和產(chǎn)物易于回收?？杀苊馕⑸镂廴?。第八章酶定向進化定向進化概念：模擬自然進化的過程，進行人工隨機突變，并在特定的環(huán)境條件下進行選擇，使進化朝著人們所需方向發(fā)展的技術(shù)過程。?常用方法：易錯PCR技術(shù)：從酶的單一基因出發(fā)，在改變反應(yīng)條件的情況下進行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）,使擴增得到的基因出現(xiàn)堿基配對錯誤，從而引起基因突變的技術(shù)過程。在該方法中遺傳變化只發(fā)生在單一分子內(nèi)部，所以屬于無性進化。由于它較為費力、耗時，一般多用于較小基因片段（＜800bp）的改造。DNA重排技術(shù)：DNA重排又稱為有性PCR（SexualPCR）,其目的是創(chuàng)造將親本基因群中的突變盡可能組合的機會，以導(dǎo)致更大的變異，最終獲得具有最佳突變組合的酶。其基本操作過程如下：靶基因經(jīng)隨機突變產(chǎn)生含不同突變類型的親本基因群，用DNaseI隨機切割；得到的片段經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，在該過程中，這些片段之間互為引物和模板進行擴增，直至獲