全長(zhǎng)cDNA在功能基因組學(xué)中的意義

全長(zhǎng)cDNA在功能基因組學(xué)中的意義cDNA(complementaryDNA)是指從mRNA反轉(zhuǎn)錄而得到的DNA,是mRNA的一個(gè)可靠的拷貝。由于cDNA已經(jīng)經(jīng)過(guò)了剪接，而且含有完整的CDS，因此cDNA是研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)的重要資源。采用一般的方法構(gòu)建的cDNA文庫(kù)，其全長(zhǎng)的比例往往比較低，主要是因?yàn)樵赾DNA第一鏈的生成過(guò)程中，反轉(zhuǎn)錄酶在還沒(méi)有生成完整的第一鏈的情況下就脫離了反應(yīng)，以致得到不完整的cDNA。CDNA第一鏈的生成一般使用polyT作引物，因此，一般cDNA文庫(kù)中，含有大量的3’端EST，而mRNA5’端的信息較少。但在功能基因組的研究中，5’端序列更有意義。因此，構(gòu)建富含全長(zhǎng)的cDNA克隆的文庫(kù)顯得更加重要。1富含全長(zhǎng)cDNA的文庫(kù)的構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA就是含有完整的3’和5’端的cDNA，mRNA的3’端具有polyA作為“標(biāo)簽序列”sequencetag)用于辯別mRNA或cDNA是否含有完整的3’端。在生成第一鏈cDNA的過(guò)程中一般采用polyT作引物，所以，得到的cDNA克隆一般都含有完整的3’端。mRNA的5’端與3’端不同，它沒(méi)有高度保守的序列可用作“標(biāo)簽序列”來(lái)通過(guò)DNA/DNA或DNA/RNA雜交進(jìn)行5’端鑒定，只有帽子結(jié)構(gòu)(CAP)。因此為了分離到全長(zhǎng)cDNA克隆，研究者一般利用“帽子結(jié)構(gòu)”在mRNA的5’端加上一段序列或者其他標(biāo)記物。1?1.1常規(guī)方法這里說(shuō)的常規(guī)方法，也就是夠建一般的cDNA文庫(kù)所采用的方法。分離出mRNA后，以mRNA為模板、帶接頭的polyT作引物合成第一鏈cDNA，再以用第一鏈作模板合成雙鏈cDNA，加上5’端接頭，便可連到載體上。Oligo—CAP的方法Oligo—CAP的方法是在mRNA的5’端加上一段寡核苷酸取代5’CAP。具體過(guò)程如圖1所示。其原理是在BAP(bacterialalkalinephosphatase)和TAP(tobaccoacidpyrophosphatase)的作用下，完整的mRNA(含CAP)的5’端的G被切除，剩下一個(gè)一個(gè)磷酸基團(tuán)，可以在RNA連接酶的作用下與Oligoadapter連接；而不含CAP的mRNA的5’端則是一個(gè)羥基，無(wú)法與Oligoadapter連接。這樣，mRNA的5’端也有了可識(shí)別的“標(biāo)簽序列”。CAP—Select的方法如圖2所示，在生成cDNA第一鏈時(shí)，引物中帶錨定序列，同時(shí)加入MnCl2。在MnCl2存在時(shí)，反轉(zhuǎn)錄酶會(huì)在有CAP的mRNA為模板的第一鏈cDNA的3’端加上三至四個(gè)dCMP，然后在末端轉(zhuǎn)移酶的作用下加上三到四個(gè)dAMP，在3’端形成一粘端。這樣，在RNA連接酶的作用下加上3’接頭。這樣，在5’和3’端都有特異的序列用于PCR擴(kuò)增及全長(zhǎng)cDNA的篩選。1.1.4CAP—Traperselect的方法Tidl-leiigtli傾iikh"cDNAllVraiy圖1Oligo—Capping法構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)BATne^tinrtil.1.Gpi平—ffliRNAwithCAPHftRNAwiThoucCAPmKNAwith&ui:CAPI.MSAFmSTind.S^tiJkke-M 霖■=*Ig)-TirstS^ubtLe^ismfhdSWJhdS-inibwicR.yJim11/f MJ￡mHLI吐T4DSJA.PiUErWFUbtaii?PC'R-AjjnpljifirMiirioiLKfRDgttgTidl-leiigtli傾iikh"cDNAllVraiy圖1Oligo—Capping法構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)BATne^tinrtil.1.Gpi平—ffliRNAwithCAPHftRNAwiThoucCAPmKNAwith&ui:CAPI.MSAFmSTind.S^tiJkke-M 霖■=*Ig)-TirstS^ubtLe^ismfhdSWJhdS-inibwicR.yJim11/f MJ￡mHLI吐T4DSJA.PiUErWFUbtaii?PC'R-AjjnpljifirMiirioiLKfRDgttgAdapterli&rilxVpectorLig^ifiouKiH-FMdKYirh^lHLVraKrrLknuizCbarinrruEm>lh-1iJuiJ|<*#.y<：lw^pLfinlJIiMEdlpnipa^alittiAAAAfEEESII|i1一一j[...JMMhn)^vpenerp^IL1K￡2p-7IHl^pirC-L)Alk^hurTAPtie^hoeul1：七一、AAAAAAAEKAE^ACioia .HO—..~~ceri_qiu^ciCi.-Rd:XIMirfwrEEtLIT.TMIM；XhfJSocruw￡■&FrnJiLCniii7G(-5')pp]5po[y(A)oligo-dTancho^I.■■7r-si-sirhiir]ed崩syrii^s7.?innress'icenf小C.,3'01leer{chmRNAFirwlw妃ndlDNjEigprl山■必藤——.…FuhiIcrwlflCDNA. .IM!R^rrwr*T^cwTnwi!ii.nii買塞洌.s...e心/"TruMAit^d1cDriA= ■nriWT^^WFi*isU-<h-h：Ui!<2.AddLjreeiofourAio：「endAAA(A)CO：?BfoffnyWkmW也3一?！?3.Selectivelibationoffull-lengthednadsDNAadaptorNNNDDD(D)GKG<G)

AAAU)CCC(C>?二啤tunewlttinia^nglic；,:T7：dG-lailing4.PCRamplificationadapterprimeranchorprimer圖2CAP—SELECT法獲得全長(zhǎng)cDNA 主要過(guò)程如圖3所示。它采用的策略就是cDNA第一鏈生成，DNA/RNA復(fù)合物未分離時(shí)，用生物素標(biāo)記RNA的5’端，再用RnaseI處理。如果形成的第一鏈cDNA不完整，那在RnaseI的作用下，突出的單鏈RNA被降解，5’端的生物素標(biāo)記也隨之失去。生物素與磁珠偶聯(lián)的親和素吸附，這樣，經(jīng)過(guò)層析，便可把全長(zhǎng)與非全長(zhǎng)的cDNA分離開(kāi)。1.2文庫(kù)中全長(zhǎng)cDNA的識(shí)別以上介紹的幾種方法可得到含有一定比例全長(zhǎng)cD