免疫學(xué) 第7章 抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用

第七章抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用教學(xué)目標(biāo)和要求：掌握不同抗體的制備的原理與程序；掌握抗原抗體反應(yīng)的原理；熟悉常見免疫分析方法。教學(xué)重點(diǎn)和難點(diǎn)：不同抗體的制備的原理與程序以及抗原抗體反應(yīng)的原理。主要內(nèi)容第一節(jié)抗體的制備第二節(jié)抗原抗體反應(yīng)原理第三節(jié)常見免疫分析方法第一節(jié)抗體的制備一、基本概念二、抗血清的制備三、單克隆抗體的制備四、基因工程抗體的制備一、基本概念1.多克隆抗體p140：由多個抗原決定簇刺激不同B細(xì)胞克隆而產(chǎn)生的抗體。如：抗血清。2.單克隆抗體p140：由一個B細(xì)胞克隆所分泌的針對一個抗原決定簇的抗體。3.基因工程抗體：又稱重組抗體，是指利用重組DNA和蛋白質(zhì)工程技術(shù)對編碼抗體的基因按不同需要進(jìn)行加工改造和重新裝配，經(jīng)轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞所表達(dá)的抗體分子。4.催化性抗體(抗體酶)p148：具有催化活性的抗體。二、抗血清的制備(一)免疫動物p1411.抗原選擇病毒、細(xì)菌、其他蛋白質(zhì)抗原,小分子激素等半抗原必須與大分子載體偶聯(lián)抗原的用量：動物種類2.佐劑及乳化3.免疫動物豚鼠、家兔、小鼠、大鼠，大量生產(chǎn)可用羊、馬二、抗血清的制備(一)免疫動物4.免疫途徑的選擇免疫動物的途徑：動物種類、抗原特性、是否使用佐劑腹腔注射、肌內(nèi)注射、皮內(nèi)注射、皮下注射：任何抗原靜脈注射：可溶性抗原及分散的單細(xì)胞懸液，不能使用佐劑脾臟直接注射、體外免疫：單克隆抗體二、抗血清的制備初次免疫后要經(jīng)過2-3次以上的免疫加強(qiáng)，兩次免疫注射之間的間隔一般為2－4周，小動物可間隔10－14天，大動物2個月左右。二、抗血清的制備(二)抗血清的純化與保存純化：鹽析法：蛋白質(zhì)分子越大，沉淀時所需鹽離子濃度越低色譜法:更高純度保存：低溫、冷凍干燥二、抗血清的制備(三)抗血清的特性鑒定p1421.效價(滴度)：顯示抗血清中特異性抗體相對含量的一個半定量指標(biāo)，在給定的條件下，結(jié)合一定量抗原的抗血清的稀釋度。2.親和力（K）：抗血清與相應(yīng)抗原的結(jié)合強(qiáng)度3.抗體特異性與交叉反應(yīng)三、單克隆抗體的制備(一)基本原理雜交瘤技術(shù)（hybridomatechnique）即淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，又稱單克隆抗體技術(shù)?？死眨↘ohler）和米爾斯坦（Milstein）（1975）證明，骨髓瘤細(xì)胞與免疫的動物脾細(xì)胞融合，形成能分泌針對該抗原的均質(zhì)的高特異性的抗體——單克隆抗體。這一技術(shù)的基礎(chǔ)是細(xì)胞融合技術(shù)。骨髓瘤細(xì)胞在體外可以連續(xù)傳代，而脾細(xì)胞是終末細(xì)胞，不能在體外繁殖。如將小鼠的骨髓瘤細(xì)胞與分泌某種抗體或因子的淋巴細(xì)胞融合，則融合細(xì)胞既具有腫瘤細(xì)胞無限繁殖的特性，又具有淋巴細(xì)胞能分泌特異性抗體或因子的能力，同時也克服了免疫淋巴細(xì)胞不能在體外繁殖的缺點(diǎn)，融合的細(xì)胞稱為淋巴細(xì)胞雜交瘤。

通過融合兩種細(xì)胞而同時保持兩者的主要特征。兩種細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞特征：在培養(yǎng)條件下無限分裂、增殖；次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺失脾淋巴細(xì)胞(經(jīng)抗原免疫)特征：分泌抗體功能和能夠在選擇培養(yǎng)基上生長

融合后，形成同時具備抗體分泌功能和保持細(xì)胞永生性兩種特征的細(xì)胞克隆(二)單抗制備流程1.抗原免疫選擇抗原動物選擇免疫途徑選擇抗原顆粒性抗原：細(xì)胞、細(xì)菌和病毒等，顆粒性抗原一般具有良好的免疫原性，可直接免疫動物?？扇苄钥乖喝绲鞍踪|(zhì)、碳水化合物或核酸，多肽，可和福氏完全佐劑混合，制成乳劑后免疫動物。動物選擇常用:六周齡的雌性Balb/c小鼠免疫途徑選擇皮下注射腹腔注射靜脈注射肌肉注射脾臟直接注射皮下免疫腹腔注射尾靜脈免疫足墊免疫脾臟免疫－1所需器具稱重脾臟免疫－2注射麻藥脾臟免疫－3打結(jié)固定小鼠脾臟免疫－4酒精消毒去毛碘酒消毒脾臟免疫－5剪開外皮剪開腹膜找到脾臟脾臟免疫－6注射抗原縫合傷口每隔15天重復(fù)注射作加強(qiáng)免疫，共重復(fù)2次第三次免疫之后10天，將小鼠斷尾取血，用ELISA方法，檢測血清效價。取脾細(xì)胞融合前3天加強(qiáng)免疫一次，以活化B淋巴細(xì)胞2.脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備

脾細(xì)胞的制備：將Balb/c小鼠處死。浸泡在75％乙醇中帶入無菌室。取出小鼠置于無菌紙上，左腹側(cè)朝上；在小鼠左腹側(cè)中部剪開小口，撕開皮膚，暴露腹壁，可見紅色長條狀脾臟；在脾臟下側(cè)提起腹膜，剪開后上翻，暴露脾臟，用鑷子提起脾臟，眼科剪分離脾臟下面的結(jié)締組織，取出脾臟。放入盛有5mlHanks液的培養(yǎng)皿中；

A：梳刮法：脾臟可用鑷子輕輕梳刮，避免將脾臟弄成碎片，將細(xì)胞懸液吸入離心管中，自然沉降5分鐘，將懸液移至另一離心管中，棄去較大的組織塊，離心沉淀細(xì)胞；B：鋼網(wǎng)研磨法：將脾臟放置不銹鋼網(wǎng)（100或200目）上，用注射器針芯輕輕研壓脾臟，獲細(xì)胞懸液；C：酶消化法：將脾臟用鑷子夾碎，加入400u/ml膠原酶（III型）5ml/只脾臟，37度消化20分鐘，用尼龍網(wǎng)過濾，得到單細(xì)胞懸液。2.脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備選擇生長旺盛，形態(tài)良好的細(xì)胞將上清倒入離心管內(nèi)，剩余貼壁的細(xì)胞用0.02％EDTA消化液消化細(xì)胞5分鐘后倒入同一離心管，1000～1500rpm離心5分鐘，收集細(xì)胞計(jì)數(shù)骨髓瘤細(xì)胞消化數(shù)分鐘中止消化、吹散細(xì)胞收集細(xì)胞、離心計(jì)數(shù)骨髓瘤細(xì)胞系的選擇要求：來源應(yīng)同免疫動物種屬一致自身不產(chǎn)生免疫球蛋白應(yīng)為次黃嘌呤鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶（TK）缺陷型骨髓瘤的誘生：在小鼠腹腔中注射礦物油3.雜交瘤細(xì)胞的制備將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1:10的比例混合，低速離心后棄上清，用手指彈勻細(xì)胞。將1mL50％的PEG在1分鐘內(nèi)緩緩加到混合的細(xì)胞內(nèi)，注意邊滴加PEG邊搖動離心管。PEG作用1分鐘后，迅速滴加培養(yǎng)液終止PEG作用，低速離心洗滌細(xì)胞。用10mLHAT培養(yǎng)液懸浮融合細(xì)胞，按每孔3滴的量滴加到含滋養(yǎng)層的96孔板內(nèi)，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4.雜交瘤細(xì)胞的篩選融合后，混合液中含有五種細(xì)胞未融合的脾細(xì)胞未融合的骨髓瘤細(xì)胞脾細(xì)胞與脾細(xì)胞形成的同核體骨髓瘤細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞形成的同核體骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞形成的異核體HAT培養(yǎng)液篩選法(Littlefield,1964)HAT組成：次黃嘌呤、氨甲蝶呤、胸腺嘧啶核苷基礎(chǔ)：該方法是根據(jù)次黃嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成途徑設(shè)計(jì)的。4.雜交瘤細(xì)胞的篩選4.雜交瘤細(xì)胞的篩選核酸合成通路與HAT選擇性培養(yǎng)作用原理4.雜交瘤細(xì)胞的篩選骨髓瘤細(xì)胞突變體HGPRT-8-雜氮鳥嘌呤或6-硫代鳥嘌呤HAT死亡脾細(xì)胞HGPRT突變體HGPRT-存活HAT5.篩選陽性克隆與克隆培養(yǎng)篩選陽性克隆目的：產(chǎn)生特定抗原的抗體產(chǎn)生細(xì)胞僅占所有脾細(xì)胞的5%左右。篩選方法：免疫酶技術(shù)：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)免疫熒光技術(shù)放射免疫技術(shù)5.篩選陽性克隆與克隆培養(yǎng)克隆培養(yǎng)：

由單個細(xì)胞繁殖擴(kuò)增而形成性狀均一的細(xì)胞集落的過程。目的：

確保雜交瘤所分泌的抗體具有單克隆性，以及從細(xì)胞群中篩選出具有穩(wěn)定表型的關(guān)鍵一步。5.篩選陽性克隆與克隆培養(yǎng)常用的細(xì)胞克隆培養(yǎng)技術(shù)有限稀釋法軟瓊脂克隆技術(shù)有限稀釋法雜交瘤細(xì)胞收集稀釋逐步單細(xì)胞克隆培養(yǎng)4~5天更換培養(yǎng)液鏡檢篩選單細(xì)胞集落檢測抗體分泌情況該過程需重復(fù)3～5次才能獲得穩(wěn)定基因型和穩(wěn)定分泌的細(xì)胞軟瓊脂克隆技術(shù)細(xì)胞混懸液0.5％瓊脂液倒在瓊脂培養(yǎng)基37oC，一周5％CO2培養(yǎng)箱觀察采集克隆轉(zhuǎn)移培養(yǎng)板檢測抗體反復(fù)進(jìn)行單克隆細(xì)胞群瓊脂培養(yǎng)基：由含20％血清的完全培養(yǎng)液配制6.雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色體分析應(yīng)選擇染色體數(shù)目較多又較集中的雜交瘤細(xì)胞鑒定單克隆抗體的Ig類和亞類單克隆抗體的親和力測定測定單抗的特異性、純度和識別抗原的相對分子量7.單克隆抗體的大量制備體外培養(yǎng)動物體內(nèi)誘生法從腹水中制備抗體，需注射降植烷破壞腹腔內(nèi)膜8.單克隆抗體的純化單克隆抗體分離純化技術(shù)建立的依據(jù)Ig的類和亞類不同用途8.單克隆抗體的純化澄清和沉淀處理分離方法p142分子篩色譜：用于IgM類陽離子交換層析：用于IgG類親和層析：IgG類研究基因工程抗體的目的降低鼠源性單克隆抗體分子的免疫原性降低抗體的相對分子質(zhì)量，以增加組織的透過性四、基因工程抗體的制備四、基因工程抗體的制備(一)抗體的化學(xué)修飾p148用雙功能連接劑將抗體Fc段與熒光素、同位素、酶、發(fā)光化合物、稀土元素、藥物、毒素等連接四、基因工程抗體的制備(二)抗體基因文庫p147將不同的重鏈和輕鏈基因隨機(jī)組合，克隆到合適的表達(dá)載體中，在原核細(xì)胞表達(dá)不同的抗體，形成一個表達(dá)文庫(三)抗體基因改造1984年，第一個基因工程抗體定義：在基因水平上將鼠源單抗的V區(qū)基因與人Ig的C區(qū)基因相連接，構(gòu)成嵌合基因，導(dǎo)入受體細(xì)胞表達(dá)出的嵌合抗體分子。特性：注入人體后可減少人抗鼠抗體（HAMA）反應(yīng)現(xiàn)已制備出大量抗結(jié)腸癌，乳癌，B及T細(xì)胞惡性腫瘤的嵌合抗體

名詞解釋：效價第二節(jié)抗原抗體反應(yīng)原理抗原與相應(yīng)抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)稱為抗原抗體反應(yīng)(antigen-antibodyreaction)?？乖贵w反應(yīng)既可在體內(nèi)作為體液免疫應(yīng)答的效應(yīng)機(jī)制自然發(fā)生，也可在體外作為免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果出現(xiàn)。在體內(nèi)，可表現(xiàn)為溶菌、殺菌、促進(jìn)吞噬或中和毒素等作用，有時亦可引起免疫病理損傷；在體外，依相應(yīng)抗原物理性狀(顆粒狀或可溶性)以及反應(yīng)的條件(電解質(zhì)、補(bǔ)體等)不同，可出現(xiàn)凝集、沉淀、細(xì)胞溶解和補(bǔ)體結(jié)合等反應(yīng)。第二節(jié)抗原抗體反應(yīng)原理一、抗原抗體反應(yīng)原理二、抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)三、抗原抗體反應(yīng)的影響因素四、抗原抗體反應(yīng)類型一、抗原抗體反應(yīng)原理抗原抗體結(jié)合反應(yīng)是抗原決定簇（表位）和抗體超變區(qū)分子之間的相互作用，是一種分子表面的特異的可逆的弱結(jié)合力。這些弱結(jié)合力只能在極短距離內(nèi)才能發(fā)生效應(yīng)。因此抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的最重要的先決條件是抗原與抗體間的特定部位的空間結(jié)構(gòu)必須相互吻合，具有互補(bǔ)性；其次，抗原決定簇與抗體超變區(qū)必須緊密接觸，才能有足夠的結(jié)合力，使抗原抗體分子結(jié)合在一起。

物質(zhì)基礎(chǔ):抗原表位與抗體高變區(qū)的溝槽分子表面的互補(bǔ)結(jié)合抗原抗體之間的結(jié)合力親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體靜電引力（electrostaticforces）范德華引力:作用最?。╲anderWaalsinteractions）氫鍵:最具特異性（hydrogenbond）疏水作用力:作用最大（hydrophobicinteractions）

抗原抗體結(jié)合力示意圖（一）、抗原抗體結(jié)合力抗原抗體是一種非共價的結(jié)合，不形成共價鍵，需要四種分子間引力參與。1.靜電引力：又稱庫倫引力。是因抗原、抗體帶有相反電荷的氨基與羧基基團(tuán)間相互吸引的能力，這種吸引力的大小和兩個電荷間的距離平方成反比。兩個電荷距離越近，靜電引力越大；2.范德華引力：這是原子與原子、分子與分子相互接近時分子極化作用發(fā)生的一種吸引力，是抗原、抗體兩個大分子外層軌道上電子相互作用時，兩者電子云中的偶極擺動而產(chǎn)生的引力。這種引力的能量小于靜電引力；3.氫鍵結(jié)合力：是供氫體上的氫原子與受氫體上氫原子間的引力。其結(jié)合力較強(qiáng)于范德華引力；4.疏水作用力：水溶液中兩個疏水基團(tuán)相互接觸，由于對水分子的排斥而趨向聚集的力。當(dāng)抗原表位和抗體超變區(qū)靠近時，相互間正負(fù)極性消失，周圍親水層也立即失去，從而排斥兩者間的水分子，使抗原抗體進(jìn)一步吸引和結(jié)合。疏水作用力是這些結(jié)合力中最強(qiáng)的，因而對維系抗原抗體結(jié)合作用最大。親和力指抗體分子上一個抗原結(jié)合點(diǎn)與對應(yīng)的抗原決定簇之間相適應(yīng)而存在的引力，它是抗原抗體間固有的結(jié)合力。親和力用平衡常數(shù)K來表示，K值越大，親和性越高，與抗原結(jié)合也越牢固。親和力(affinity)抗原抗體親和力示意圖（二）、抗原抗體的親和力和親合力 抗體與抗原結(jié)合是可逆的反應(yīng)，其親和常數(shù)

K=抗原抗體復(fù)合物濃度游離抗原濃度×游離抗體濃度 K代表抗體結(jié)合抗原的親和力。K值大的抗體與抗原牢固結(jié)合，不易解離，稱該抗體有高親和力?？贵w對抗原分子總的結(jié)合強(qiáng)度親合力(avidity)p156抗原抗體親合力示意圖抗體的親合力(avidity)是指一個抗體分子與整個抗原表位之間結(jié)合的強(qiáng)度，與抗體結(jié)合價直接相關(guān)。即所謂多價優(yōu)勢，例如，IgG為兩價，其親和力為單價的l03倍;而IgM為5～10價;其親和力為單價的107倍。由于抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)為非共價的可逆結(jié)合，它們空間構(gòu)象的互補(bǔ)程度不同，結(jié)合力強(qiáng)弱也不同，互補(bǔ)程度越高，親和力越高，與抗原結(jié)合更牢固，不易解離；反之就容易解離。而在單克隆抗體反應(yīng)系統(tǒng)中，只有某些決定簇起作用，因此，單克隆抗體與相應(yīng)抗原的親合力相對較弱。（三）、親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體可見反應(yīng)抗原抗體復(fù)合物(疏水膠體)電解質(zhì)抗原(親水膠體)

抗體(親水膠體)

+抗體是球蛋白，大多數(shù)抗原亦為蛋白質(zhì)，它們?nèi)芙庠谒薪詾槟z體溶液，不會發(fā)生自然沉淀。親水膠體形成機(jī)制是因蛋白質(zhì)含有大量的氨基和羧基殘基，這些殘基在溶液中帶有電荷，由于靜電作用，在蛋白質(zhì)分子周圍出現(xiàn)了帶相反電荷的電子云。如果溶液pH偏高，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷，周圍出現(xiàn)極化的水分子，形成水化層，而當(dāng)抗原抗體的結(jié)合，使表面電荷減少或消失，電子云也消失，水化層變薄，蛋白質(zhì)由親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體。此時，如再加入電解質(zhì)，如NaCl，則進(jìn)一步使疏水膠體物相互靠攏，形成可見的抗原抗體復(fù)合物。二、抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)特異性比例性可逆性敏感性階段性特異性（specificity）：

是指任何一種抗原分子，一般只能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體結(jié)合發(fā)生反應(yīng)的專一性能。特異性是抗原抗體反應(yīng)的最重要特征之一?？乖c抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)：抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合部位間存在結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性，二者相互結(jié)合，在適宜條件下，出現(xiàn)可見反應(yīng)。二者的空間構(gòu)型互補(bǔ)程度不同，結(jié)合力強(qiáng)弱也各異，互補(bǔ)程度越高，結(jié)合能力越強(qiáng)。1.特異性抗體分子可變區(qū)形成大小約為3nm×1.5nm×0.7nm的槽溝，其中超變區(qū)氨基酸殘基的變異性使槽溝形狀千變?nèi)f化，只有與其空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的抗原決定簇才能如楔狀嵌入，因此，抗原抗體結(jié)合反應(yīng)具有高度特異性。例如：抗白喉抗毒素只能與白喉棒狀桿菌外毒素結(jié)合，而不能與破傷風(fēng)梭菌外毒素結(jié)合，反之亦然。這種高度的反應(yīng)特異性是一切抗原抗體反應(yīng)的主體，所以在傳染病的診斷、防治等醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域都已得到了廣泛的應(yīng)用。1.特異性特異性示意圖大多數(shù)天然抗原物質(zhì)的構(gòu)成十分復(fù)雜，常含有多種抗原決定簇。如果兩種不同的抗原物質(zhì)具有部分相同或類似結(jié)構(gòu)的抗原決定簇，則可與彼此相應(yīng)的抗血清出現(xiàn)交叉反應(yīng)。例如，變形桿菌與立克次體之間有共同的抗原決定簇，故斑疹傷寒病人血清可凝集OX19變形桿菌。交叉反應(yīng)（crossreactions）抗原抗體交叉反應(yīng)示意圖以沉淀反應(yīng)為例，在加入固定量抗體的一排試管中，再依次加入一定量的遞增濃度的抗原進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著抗原濃度的增加，沉淀很快出現(xiàn)，但抗原超過一定范圍之后，沉淀速度和沉淀量隨抗原濃度增加反而降低，甚至到最后不出現(xiàn)沉淀。比例性（proportionality）：是指抗原與抗體發(fā)生可見反應(yīng)需要一定的量比關(guān)系，只有當(dāng)二者濃度比例適當(dāng)時，才形成較大的抗原抗體結(jié)合物。2.比例性沉淀反應(yīng)的速度反映了參加反應(yīng)的抗原和抗體濃度的適合程度，適合程度高反應(yīng)快，反之則慢?？乖贵w反應(yīng)比例性示意圖2.比例性通常把最迅速出現(xiàn)可見反應(yīng)時的抗原抗體的濃度比或量比稱為抗原抗體反應(yīng)的最適比（optimalratio）或稱等價點(diǎn)（equivalencepoint）。抗原與抗體比例最合適的范圍稱等價帶（equivalencezone）。在此范圍內(nèi)，抗原抗體充分結(jié)合，沉淀物形成快而多。在最適比反應(yīng)條件下，抗原抗體幾乎全部結(jié)合成復(fù)合物，上清液中基本無游離的抗原和抗體。當(dāng)抗原和抗體濃度比超過此范圍時，可見反應(yīng)的速度和復(fù)合物的量都會迅速降低，甚至不可見，上清液中可測出游離的抗原或抗體。因抗原抗體比例不合適而不出現(xiàn)可見反應(yīng)，稱帶現(xiàn)象（zonephenomenon）。如果抗體過量時，稱為前帶（prozone）；抗原過量時，稱為后帶（postzone）。在同一抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)中，不管抗原和抗體濃度如何變化，其沉淀反應(yīng)的最適比始終恒定不變。Ab關(guān)于抗原抗體結(jié)合后如何形成聚合物，曾經(jīng)有過不少解釋。結(jié)合現(xiàn)代免疫學(xué)的成就，電鏡觀察所見，仍可用Marrack（1934）提出的網(wǎng)格學(xué)說（latticetheory）加以說明。天然抗原大多是多價的，抗體至少為兩價，當(dāng)抗原與抗體在等價帶結(jié)合時，相互交叉連接成具有立體結(jié)構(gòu)的網(wǎng)格狀復(fù)合體，形成肉眼可見的沉淀物。當(dāng)抗原或抗體過剩時，由于過剩方的結(jié)合價得不到飽和，只能形成較小復(fù)合物，并存在有較多游離的抗原或抗體，不能出現(xiàn)可見反應(yīng)。但是，當(dāng)抗原或抗體為單價，不管抗原與抗體的量比關(guān)系是否合適，均不能出現(xiàn)可見反應(yīng)現(xiàn)象。

3.可逆性抗原抗體反應(yīng)遵循生物大分子熱動力學(xué)反應(yīng)原則，其反應(yīng)式為：[Ab-Ag]／[Ab]·[Ag]=k1/k2=K式中各反應(yīng)項(xiàng)的單位以mol表示，k1表示反應(yīng)速度常數(shù)，k2為逆反應(yīng)速度常數(shù)，K是反應(yīng)平衡時的速度常數(shù)。由上式可知，K值是反映抗原抗體間結(jié)合能力的指示，所以抗體親和力通常以K值表示。抗原與抗體結(jié)合形成復(fù)合物后，在一定條件下，可以解離為游離的抗原與抗體，這種特性稱為抗原抗體反應(yīng)的可逆性(reversibility)?？乖贵w的結(jié)合是分子表面的非共價鍵結(jié)合，形成的復(fù)合物是不牢固的，在一定條件下可以解離，因此抗原抗體反應(yīng)形成復(fù)合物的過程是一個動態(tài)平衡?？乖贵w復(fù)合物解離取決于兩方面的因素，一是抗體對相應(yīng)抗原的親和力；二是環(huán)境因素對復(fù)合物的影響。高親和性抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原表位的空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不容易解離。反之，低親和性抗體與抗原形成的復(fù)合物較易解離。解離后的抗原或抗體均能保持未結(jié)合前的結(jié)構(gòu)、活性及特異性。在環(huán)境因素中，凡是減弱或消除抗原抗體親和力的因素都會使逆向反應(yīng)加快，復(fù)合物解離增加。如pH改變，過高或過低的pH值均可使離子間電引力消失。對親合力本身較弱的反應(yīng)體系而言，僅增加離子強(qiáng)度即可解離抗原抗體復(fù)合物；增加溫度可增加分子間的熱動能，加速已結(jié)合的復(fù)合物的解離，但由于溫度變化易致蛋白變性，所以實(shí)際工作中極少應(yīng)用。改變pH和離子強(qiáng)度是最常用的促解離方法。常用于解離抗原抗體復(fù)合物的物質(zhì)有3mol/L硫氰化鉀，7mol/L尿素，pH2.4、0.1mol/L甘氨酸等。解離后的抗原或抗體分子，仍保持原來的理化特性及生物學(xué)活性。例如，外毒素與相應(yīng)抗毒素結(jié)合，毒性被中和，但經(jīng)稀釋或凍融可使兩者解離，外毒素恢復(fù)其毒性。抗體混有SPAg抗體-SPAg抗體-SPAg分離劑一、抗原抗體結(jié)合二、分離抗體

可逆性示意圖抗體4.敏感性抗原抗體反應(yīng)具有高度的敏感性，不僅可以定性，而且可以定量。其敏感度大大超過目前所有化學(xué)方法，因反應(yīng)種類不同而異。在測定血清中某一物質(zhì)的含量時，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml，酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5～10μg/ml，免疫測定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿?？乖贵w反應(yīng)的過程可分為兩個階段：第一階段為抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的階段，抗原決定簇和相應(yīng)抗體Ig的Fab段的高變區(qū)相互吸引而特異結(jié)合。此階段反應(yīng)快，僅需幾秒至幾分鐘，但不出現(xiàn)可見反應(yīng)；第二階段為可見反應(yīng)階段，這一階段抗原抗體復(fù)合物在適當(dāng)溫度、pH、電解質(zhì)和補(bǔ)體影響下，出現(xiàn)沉淀、凝集、細(xì)胞溶解、補(bǔ)體結(jié)合介導(dǎo)的肉眼可見的反應(yīng)，此階段反應(yīng)慢，可歷時數(shù)分鐘、數(shù)小時乃至數(shù)天。但若為單價抗體或半抗原，則不出現(xiàn)可見反應(yīng)。在血清學(xué)反應(yīng)中，以上兩階段往往不能嚴(yán)格分開，往往第一階段反應(yīng)還未完全完成，即開始第二階段反應(yīng)。且受反應(yīng)條件（如溫度、pH、電解質(zhì)、抗原抗體比例等）的影響。5.階段性三、影響抗原抗體反應(yīng)的因素影響抗原抗體反應(yīng)的因素很多，主要有兩個方面：一方面是抗原抗體本身的因素；另一方面是反應(yīng)環(huán)境因素。1.反應(yīng)物自身因素抗原抗體反應(yīng)中，抗原和抗體是反應(yīng)的主體，所以它們的特性直接影響其結(jié)合情況。（一）抗原抗原的理化性狀、表位的種類和數(shù)目等均可影響抗原抗體反應(yīng)的結(jié)果。例如，顆粒性抗原與相應(yīng)的抗體反應(yīng)后出現(xiàn)凝集現(xiàn)象；可溶性抗原與相應(yīng)的抗體反應(yīng)后出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象；單價抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)后不出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象；血細(xì)胞與IgG類抗體反應(yīng)不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。（二）抗體抗體對抗原抗體反應(yīng)的影響主要有以下三個方面：1．來源不同動物來源的免疫血清，其反應(yīng)性存在差異。如家兔等大多數(shù)動物的免疫血清，由于具有較寬的等價帶，與相應(yīng)抗原結(jié)合易出現(xiàn)可見的抗原抗體復(fù)合物。馬、人的免疫血清等價帶較窄，抗原不足或過剩，均易形成可溶性復(fù)合物。而單克隆抗體一般不用于沉淀或凝集反應(yīng)。2．濃度抗體的濃度是相對于抗原而言的，兩者濃度合適時才易出現(xiàn)可見的反應(yīng)結(jié)果，所以在試驗(yàn)前應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，滴定抗原抗體最佳反應(yīng)濃度。3．特異性與親和力特異性與親和力是影響抗原抗體反應(yīng)的關(guān)鍵因素，它們共同影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度。試驗(yàn)試劑應(yīng)盡可能選擇高特異性、高親和力的抗體，以保證試驗(yàn)的可靠性。

電解質(zhì)：生理鹽水或緩沖液酸堿度：pH6～pH9溫度：15℃～40℃，37℃最適2.環(huán)境因素抗原與抗體發(fā)生結(jié)合后，由親水膠體變?yōu)槭杷z體的過程中，需有電解質(zhì)參與才能進(jìn)一步使抗原抗體復(fù)合物表面失去電荷，水化層破壞，復(fù)合物相互靠攏聚集，形成大塊的凝集或沉淀。若無電解質(zhì)參加，則不出現(xiàn)可見反應(yīng)。為了促使沉淀物或凝集物的形成，常用0.85％氯化鈉或各種緩沖液作為抗原及抗體的稀釋液及反應(yīng)液。由于氯化鈉在水溶液中解離成Na+和Cl-，可分別中和復(fù)合物上羧基和氨基的電荷，使復(fù)合物顆粒的電荷下降，有利于復(fù)合物間相互聚集，當(dāng)電勢降至臨界電勢（12～15mV）以下時，則能促使抗原抗體復(fù)合物從溶液中析出，形成可見的沉淀物或凝集物。但電解質(zhì)的濃度不宜過高，否則會出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象。(一)電解質(zhì)血細(xì)胞與IgG類抗體反應(yīng)不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。蛋白質(zhì)具有兩性電離性質(zhì)，因此每種蛋白質(zhì)都有固定的等電點(diǎn)?？乖贵w反應(yīng)必須在合適的pH環(huán)境中進(jìn)行，pH過高或過低都將影響抗原與抗體的理化性質(zhì)?？乖贵w反應(yīng)一般在pH為6～9進(jìn)行。例如當(dāng)pH達(dá)到或接近顆粒性抗原的等電點(diǎn)時，即使無相應(yīng)抗體存在，也會引起抗原非特異性的凝集（自凝），造成假陽性反應(yīng)。（二）酸堿度抗原抗體反應(yīng)必須在合適的溫度中進(jìn)行，一般以15～40℃為宜，最佳反應(yīng)溫度為37℃，在此范圍內(nèi)，溫度升高可加速分子運(yùn)動，抗原與抗體碰撞機(jī)會增多，使反應(yīng)加速。但若溫度高于56℃時，可導(dǎo)致已結(jié)合的抗原抗體再解離，甚至變性或破壞；溫度越低結(jié)合速度越慢，但結(jié)合牢固，更易于觀察。某些特殊的抗原抗體反應(yīng)，對溫度有一些特殊的要求，例如冷凝集素在40℃左右與紅細(xì)胞結(jié)合最好，20℃以下反而解離。此外，適當(dāng)振蕩和攪拌也能促進(jìn)抗原抗體分子的接觸，加速反應(yīng)，其作用與反應(yīng)物粒子大小成正比。

（三）溫度四、抗原抗體反應(yīng)類型隨著免疫學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，在原有經(jīng)典免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上，新的免疫學(xué)測定方法不斷出現(xiàn)，使免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)更特異、更敏感和更穩(wěn)定。目前根據(jù)抗原和抗體性質(zhì)的不同和反應(yīng)條件的差別，抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果不同，以及反應(yīng)時參與的其他條件不同，可將抗原抗體反應(yīng)分為五種類型①顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合所產(chǎn)生的凝集反應(yīng)(agglutination)；②可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合所產(chǎn)生的沉淀反應(yīng)(pre-cipitation)；③抗原抗體結(jié)合后激活補(bǔ)體所致的細(xì)胞溶解反應(yīng)(cytolysis)，細(xì)菌抗原表現(xiàn)為溶菌反應(yīng)，紅細(xì)胞抗原表現(xiàn)為溶血反應(yīng)；④細(xì)菌外毒素或病毒與相應(yīng)抗體結(jié)合所致的中和反應(yīng)(neutralization);⑤免疫標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)等。

第三節(jié)常見免疫分析方法一、免疫沉淀二、凝集反應(yīng)三、免疫標(biāo)記四、免疫定位分析一、免疫沉淀沉淀反應(yīng)（precipetaiton）是可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合所出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。沉淀現(xiàn)象可分為液相沉淀試驗(yàn)?zāi)z擴(kuò)散試驗(yàn)?zāi)z免疫電泳試驗(yàn)1.液相內(nèi)沉淀試驗(yàn)

環(huán)狀沉淀絮狀沉淀免疫濁度沉淀環(huán)狀沉淀試驗(yàn)

先將抗血清加入內(nèi)徑1.5～2mm小玻管中，約裝1/3高度，再用細(xì)長滴管沿管壁滴加抗原液

因抗血清蛋白濃度高，比重較抗原大，所以兩液交界處可形成清晰的界面，此處抗原抗體反應(yīng)生成的沉淀在一定時間內(nèi)不下沉

一般在室溫放置1-5min，在兩液交界處呈現(xiàn)白色環(huán)狀沉淀則為陽性反應(yīng)用于鑒定微量抗原，如法醫(yī)學(xué)中鑒定血跡，流行病學(xué)用于檢查媒介昆蟲體內(nèi)的微量抗原等只能定性

環(huán)狀沉淀實(shí)驗(yàn)2.凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)最常用的凝膠為瓊脂糖可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴(kuò)散，形成濃度梯度，在抗原與抗體濃度比例恰當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)

單向擴(kuò)散試驗(yàn)分為雙向擴(kuò)散試驗(yàn)

單向擴(kuò)散試驗(yàn)

原理：在瓊脂膠中混入一定量抗體，使待測的抗原溶液從局部向瓊脂內(nèi)自由擴(kuò)散，在一定區(qū)域內(nèi)形成可見的沉淀環(huán)技術(shù)要點(diǎn)：制板：將已知抗體或抗血清混入0.9％瓊脂糖內(nèi)（約50℃），未凝固前傾注成平板打孔：凝固后在瓊脂板上打孔（一般直徑約3～5mm）加樣：孔中加入待檢抗原和不同濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品溫培：放室溫或37℃讓其向四周擴(kuò)散結(jié)果：24～48h后觀察周圍是否出現(xiàn)沉淀環(huán)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，查含量沉淀環(huán)直徑或面積的大小與抗原量相關(guān)，但不是直線相關(guān)，而是對數(shù)關(guān)系單向瓊脂免疫擴(kuò)散法作為抗原的定量方法

雙向擴(kuò)散試驗(yàn)

在瓊脂內(nèi)抗原和抗體各自向?qū)Ψ綌U(kuò)散，在最恰當(dāng)?shù)谋壤幮纬煽乖贵w沉淀線觀察沉淀線的位置、形狀以及對比關(guān)系，可作出對抗原或抗體的定性分析

基本步驟在瓊脂板上相距3～5mm打一對孔，或者打梅花孔、雙排孔、三角孔等在相對的孔中加入抗原或抗體

置室溫或37℃18～24h后，凝膠中各自擴(kuò)散的抗原和抗體可在濃度比例適當(dāng)處形成可見的沉淀線

1．抗原或抗體的存在與否以及相對含量的估計(jì)沉淀線的形成是根據(jù)抗原抗體兩者比例所致，沉淀線如果靠近抗原孔，則表示抗體含量較大；沉淀線如果靠近抗體孔，則表示抗原含量較大；不出現(xiàn)沉淀線則表明無對應(yīng)的抗體或抗原或者過量。

沉淀線形狀、位置與抗原抗體分子量及濃度的關(guān)系2．抗原或抗體相對分子量的分析

抗原或抗體在瓊脂內(nèi)自由擴(kuò)散，其速度受分子量的影響。分子量小者擴(kuò)散快，反之則較慢。由于慢者擴(kuò)散圈小，局部濃度則較大，形成的沉淀線彎向分子量大的一方；如果兩者分子量大致相等，則形成直線。3．抗原性質(zhì)的分析

兩種受檢抗原的性質(zhì)可完全相同、部分相同或完全不同。三種情況在雙向擴(kuò)散試驗(yàn)中表現(xiàn)如圖所示，A兩條沉淀線互相吻合相連，表明抗體與兩個抗原中的相同表位結(jié)合而沉淀，兩個抗原相同，C沉淀線呈部分相切，說明兩個抗原之間有部分相同；B兩條沉淀線交叉而過，說明兩個抗原完全不同。4．抗體效價的滴定

雙向擴(kuò)散試驗(yàn)是抗血清抗體效價滴定的常規(guī)方法。固定抗原的濃度，稀釋抗體；或者抗原和抗體雙方皆作不同的稀釋，經(jīng)過自由擴(kuò)散，形成沉淀線，以出現(xiàn)沉淀線最高的抗體稀釋度為該抗體的效價。5．抗原或抗體純度鑒定

用混合抗原或抗體鑒定抗體或抗原，出現(xiàn)一條沉淀線說明待測抗原或抗體純，出現(xiàn)多條沉淀線說明不純。

雙向擴(kuò)散試驗(yàn)簡單易行，用途廣泛，但該技術(shù)靈敏度低