PCR技術(shù)及其應(yīng)用-2014.9

PCR技術(shù)及其應(yīng)用張文舉生命科學(xué)學(xué)院1這些事件有何聯(lián)系？末代沙皇尼古拉二世1918年的流行性感冒病毒電影《侏羅紀(jì)公園》辛普森殺妻案曹操姓曹么？這些事件都運(yùn)用到了PCR技術(shù)！2DNA是最重要的生物大分子之一DNA分子經(jīng)過(guò)多個(gè)層次的包裝DNA雙螺旋3DNA及其復(fù)制半保留復(fù)制一系列因子幫助DNA的復(fù)制4復(fù)制叉5DNA聚合酶1）總是從5‘-3’端復(fù)制；2）DNA的復(fù)制需要一小段RNA作為“引物”5‘-3’端復(fù)制一段RNA作為“引物”6PCR技術(shù)的發(fā)明基因克隆的需要催生了PCR的發(fā)明1953年DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)1956年DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)1985年P(guān)CR的發(fā)明DNA聚合酶的分離“引物”的合成使極少量的DNA樣本進(jìn)行了大量的擴(kuò)增！7多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)（polymerasechainreaction，PCR）PCR技術(shù)的原理PCR技術(shù)的衍生技術(shù)實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)PCR技術(shù)的應(yīng)用81234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR技術(shù)的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR反應(yīng)過(guò)程PCR的特點(diǎn)PCR的操作步驟9PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃5’3’10PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物11PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶12PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)第1輪結(jié)束95℃第2輪開(kāi)始13PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)50℃TaqTaqTaqTaq14PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束15PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

重復(fù)30輪后230=1,073,741,8241.8530=103,550,41716PCR技術(shù)簡(jiǎn)史核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明PCR的完善1971年，Khorana提出：經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因。17PCR技術(shù)簡(jiǎn)史核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明PCR的完善但測(cè)序和引物合成的困難70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……18PCR技術(shù)簡(jiǎn)史核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明PCR的完善1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）實(shí)現(xiàn)了在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制。然而，采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過(guò)程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)19PCR技術(shù)簡(jiǎn)史核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明PCR的完善1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，特異性、真實(shí)性也較高，但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。

耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀20PCR技術(shù)的基本原理PCR反應(yīng)過(guò)程PCR的特點(diǎn)PCR的操作步驟靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞細(xì)菌、病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)拷貝簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，1～4小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體液、洗嗽液、毛發(fā)、活組織、細(xì)胞、石蠟包塊、古生物標(biāo)本等的粗提DNA21PCR技術(shù)的基本原理PCR反應(yīng)過(guò)程PCR的特點(diǎn)PCR的操作步驟標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L22PCR技術(shù)的基本原理PCR反應(yīng)過(guò)程PCR的特點(diǎn)PCR的操作步驟23設(shè)置反應(yīng)程序(1)94℃變性5min，(2)94℃變性1min，(3)52℃退火1min，(4)72℃延伸1min。

(5)72℃延伸10min。重復(fù)(2)-(4)30次24PCR結(jié)果：1、對(duì)照(無(wú)模板)；2－6、PCR產(chǎn)物（5ul樣品）PCR產(chǎn)物的電泳鑒定25（1）模板單、雙鏈DNA均可，多種來(lái)源。質(zhì)量要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般人基因組100ngDNA模板（100L）。模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。（為什么？）PCR反應(yīng)的影響因素

1)反應(yīng)體系Lambda

DNA，模板量分別為100

pg,

10pg,

1pg,

100fg

,

10fg

26（2）引物引物是與待擴(kuò)增DNA片斷兩翼互補(bǔ)的一段特異的寡核苷酸片斷。引物是PCR反應(yīng)中最關(guān)鍵的因素，因此引物序列的設(shè)計(jì)對(duì)于PCR是否成功是非常重要的。

271.引物長(zhǎng)度：

以18-24bp為宜。（為什么？）2.堿基均衡分布：

四種堿基盡可能隨機(jī)分布；G+C占40-60%，上下游引物應(yīng)基本一致。3.避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)：（為什么？）

發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二聚體。4.引物的兩端：（為什么？）

3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無(wú)嚴(yán)格限制。引物設(shè)計(jì)的原則：283’5’3’5’限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列啟動(dòng)子序列定點(diǎn)突變探針標(biāo)記295.引物的特異性：

引物序列應(yīng)避免在模板內(nèi)有較高相似性的系列，尤其是3’末端。可以在www.ncbi.nih/blast.cgi進(jìn)行在線比較通過(guò)OMIGA、ClustalX等軟件進(jìn)行兩兩或多序列的比較。引物序列同源性比對(duì)：30引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)常用軟件主要有：PrimerPremier5.0Oligo6primer3ThePrimerGeneratorNetPrimer311.將序列輸入軟件中（2）在表中粘貼序列（1）新序列兩個(gè)方法32選擇序列文件所在位置（2）打開(kāi)原有的序列文件33在對(duì)話框中輸入待擴(kuò)增序列點(diǎn)擊左上角的“Primer”按鈕342.設(shè)置相關(guān)參數(shù)353.得到的引物結(jié)果36Hairpin:引物自身是否會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)Dimer:同一種引物是否會(huì)形成二聚體Falseprimiring:引物在待擴(kuò)增序列中其他位置是否有配對(duì)CrossDimer:正向與反向引物間是否會(huì)形成二聚體正向和反向引物的互換正向和反向引物的評(píng)價(jià)正向和反向引物的信息每點(diǎn)擊左邊紅色的按鈕，就出現(xiàn)相應(yīng)的內(nèi)容對(duì)正向和反向引物進(jìn)行編輯37可對(duì)引物進(jìn)行增加或減少堿基用鍵盤(pán)輸入5個(gè)堿基38引物的信息改動(dòng)后引物的信息39重新回到雙引物的界面40“Edit”－“Copy”－“SensePrimer”5'CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA3'4.輸出引物序列41引物純度：公司合成引物常用的純化方式C18脫鹽、OPC純化、PAGE純化、HPLC純化。普通PCR：OPC純（>95%）較長(zhǎng)引物（大于50個(gè)堿基）：PAGE純（>95%）經(jīng)過(guò)修飾或標(biāo)記的引物：HPLC純（>99%,但價(jià)格昂貴）引物濃度：0.1-0.5mol/L，濃度過(guò)高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配，反應(yīng)特異性下降。（為什么？）42

合成內(nèi)容產(chǎn)量(OD)發(fā)貨時(shí)間(工作日)純化方式價(jià)格(￥)普通引物合成(<60base)23PAGE1.60/base2~53OPC1.30/base5~105PAGE2.20/base3OPC1.80/base205PAGE4.00/base3OPC3.20/base305PAGE5.80/base3OPC4.60/base506PAGE10.00/base4OPC8.00/base1007PAGE詢價(jià)5OPC詢價(jià)長(zhǎng)鏈合成(60~90base)25PAGE3.50/base長(zhǎng)鏈合成(90~120base)25PAGE5.00/base***生物科技有限公司的引物合成服務(wù)43（3）耐熱DNA聚合酶1）TaqDNA聚合酶（Taqpolymerase）：95℃的半壽期為40min最適溫度（72℃）時(shí)每個(gè)酶分子每秒可催化合成150個(gè)核苷酸酶活性（受多種因素影響）：5’→3’方向的聚合酶活性，5’→3’方向的外切酶活性和逆轉(zhuǎn)錄酶活性，非模板依賴性活性，可在雙鏈PCR產(chǎn)物每一條鏈的3‘端加上單核苷酸尾，使PCR產(chǎn)物的3’端突出一個(gè)單A核苷酸尾44TthDNA聚合酶：在高溫和MnCl2存在的條件下，能有效地逆轉(zhuǎn)錄RNA。用于一步法RT-PCR。VentDNA聚合酶：又稱TliDNA聚合酶，該酶耐高溫且具有3‘-5’外切酶活性的校對(duì)功能，其保真性較TaqDNA聚合酶高一倍。該酶擴(kuò)增長(zhǎng)片斷（>12kb）的功能較強(qiáng)。PfuDNA聚合酶：具有3’→5’外切酶活性的校對(duì)功能，催化DNA合成的忠實(shí)性比Taq聚合酶高12倍，但不適于>2kb的片斷擴(kuò)增。2）其他的耐熱聚合酶45（4）dNTP四種dNTP濃度應(yīng)相等dNTP濃度：100~200μmol/L

濃度過(guò)高，影響DNA聚合酶的活性，且易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入濃度過(guò)低則降低反應(yīng)產(chǎn)量。

UNG酶可降解dUTP替代擴(kuò)增產(chǎn)物46（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。

0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。

dNTP、EDTA等負(fù)離子的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。

Mg2+濃度過(guò)低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過(guò)高影響反應(yīng)特異性。472）循環(huán)參數(shù)變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈

95oC20-30秒(2)退火溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合，降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。48（3）延伸70-75oC，延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定（4）循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過(guò)多：擴(kuò)增效率降低，錯(cuò)誤摻入率增加49二、PCR的衍生技術(shù)

逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）

反向PCR（inversePCR）

巢氏PCR（nestingPCR）

原位PCR（insituPCR）多重PCR（multiplexPCR）多重等位基因PCR（multiplexallelePCR）

不對(duì)稱PCR（asymmertricPCR）

錨定PCR（anchoredPCR）

長(zhǎng)片段PCR（longfragmentPCR）熒光定量PCR（fluorescentquantitativePCR）50逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶活性mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增1、逆轉(zhuǎn)錄PCR

(reversetranscription-PCR,RT-PCR)

51影響因素（1）模板對(duì)RT-PCR的影響對(duì)RNA制品的純度和完整性要求都極為嚴(yán)格（2）逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)RT-PCR的影響MLV逆轉(zhuǎn)錄酶能合成大于2kb的較長(zhǎng)cDNA，但對(duì)熱的穩(wěn)定性較AMV逆轉(zhuǎn)錄酶差。（3）逆轉(zhuǎn)錄引物對(duì)RT-PCR的影響隨機(jī)引物：原核細(xì)胞多用oligo(dT)：真核細(xì)胞多用基因特異性的引物（GSP）：特異性強(qiáng)，廣譜性低52例子：S.pn的轉(zhuǎn)化對(duì)PsaA基因mRNA表達(dá)的影響a、RNA的提取：野生型和轉(zhuǎn)化缺陷型S.pn都誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后，采用Qiagen試劑盒進(jìn)行總RNA提取。b、cDNA的制備：取RNA2μl，隨機(jī)引物1μl，DEPC水9μl，混勻后，70℃變性5min，立即置于冰上。然后順序加入逆轉(zhuǎn)錄buffer5μl，dNTP1.5μl,RNasin0.5μl,DEPC水5μl,逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV1μl?；靹蚝笥?7℃，1小時(shí)，得到cDNA。c、PCR擴(kuò)增:

PsaA的引物3μL，cDNA1μL，Tagplus酶0.2μL，共30μL體系。循環(huán)參數(shù)：94℃30秒，55℃40秒，72℃45秒，循環(huán)30次。用16srRNA的PCR產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)物，2%瓊脂糖電泳。53

電泳結(jié)果用軟件Quantity-one3.2進(jìn)行半定量比較，結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)分析16S(463bp)PsaA(254bp)圖2，2號(hào)菌株及其轉(zhuǎn)化缺陷菌株在加入CSP后的不同時(shí)間PsaAmRNA的表達(dá)。

1234567圖1，2號(hào)菌株及其轉(zhuǎn)化缺陷菌株在加入CSP后的不同時(shí)間PsaA的RT-PCR電泳圖。line1:Marker2.line2-4:0min,10min,20minafterS.pneumoniaeNo.2wasaddedCSP.line5-7:0min,10min,20minafterS.pneumoniaeNo.2dwasaddedCSP.

***542、反向PCR(inversePCR)

用反向的引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。應(yīng)用：（1）用于測(cè)序的DNA大片段的克隆（2）獲得啟動(dòng)子序列（3）小質(zhì)粒的定點(diǎn)突變（4）鑒定插入失活基因或體內(nèi)誘導(dǎo)基因55已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶反向PCR示意圖56轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后，提取質(zhì)粒，采用質(zhì)粒引物即可直接對(duì)X片斷進(jìn)行擴(kuò)增后測(cè)序，得到X基因序列信息。（10/64）EGFPXdw序列Xdw序列質(zhì)粒引物質(zhì)粒引物質(zhì)粒引物例子：S.pn體內(nèi)誘導(dǎo)基因序列的獲得573、多重PCR(multiplexPCR)

用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。電泳引物58圖1第1、2、3組引物多重PCR電泳圖

1：正常對(duì)照；2：DL2000marker；3~10：檢出的缺失型患者杜氏/貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥一種常見(jiàn)的致死性神經(jīng)-肌肉系統(tǒng)的X連鎖隱性遺傳病，其基因突變中缺失最常見(jiàn)，約占55%~65%，缺失分布的位點(diǎn)較多，隨地域及民族的差異而有不同特點(diǎn)594、突變PCR（1）隨機(jī)突變：應(yīng)用：構(gòu)建突變體文庫(kù)，繼而可從中篩選出具有特殊性質(zhì)的突變個(gè)體策略：易錯(cuò)PCR（error-pronePCR）。利用TaqDNA聚合酶等耐熱DNA聚合酶不具有3′→5′校對(duì)功能的特性，在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中可能摻入錯(cuò)誤的核苷酸，從而產(chǎn)生隨機(jī)錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物。加入次黃嘌呤核苷酸并限制某一種核苷酸的用量，從而促進(jìn)DNA聚合酶選擇其它3種核苷酸或次黃嘌呤核苷酸，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生突變。60（2）定點(diǎn)突變（1）5‘端引入突變：通過(guò)修飾上游引物的5’端，即可引入標(biāo)記的堿基、限制性酶切位點(diǎn)、啟動(dòng)子序列等。（2）序列中的單位點(diǎn)突變：采用重疊延伸PCR(OverlapExtensionPCR，OEPCR)61（A）為5‘端引入突變（B）為單堿基突變62例子：S.pn的ply146aa缺失的突變序列構(gòu)建S.Pn的ply為一細(xì)胞毒性分子，其146位aa缺失后毒性大大減弱。構(gòu)建突變體作為疫苗：首先設(shè)計(jì)4個(gè)引物：（M1和M2完全重疊）P1:5’-CGGGATCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3’BamHIP2:5’-CCGCTCGAGCAAGCATTCTCCTCTCCTAGTC-3’XhoIM1:5’-GGTCAATAATGTCCCAAGAATGCAGTATG-3’M2:5’-CATACTGCATTCTTGGGACATTATTGACC-3’63突變位點(diǎn)M2M1P2P15’5’5’3’3’5’為酶切位點(diǎn)序列以基因組DNA為模板，以P1和M1為引物擴(kuò)增出ply上游片斷，以P2和M2為引物擴(kuò)增出ply下游片斷以上下游片斷為模板，以P1和P2為引物，擴(kuò)出全長(zhǎng)酶切后克隆到質(zhì)粒中保存64（3）多位點(diǎn)突變策略：多次重疊PCR關(guān)鍵：重疊引物的設(shè)計(jì)（每對(duì)突變引物需要部分重疊，方向相反）。655、原位PCR(InSituPCR)原位PCR是由Hasse等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來(lái)擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段，在不破壞細(xì)胞的前提下，利用一些特定的檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。適用于檢測(cè)病理切片中含量較少的靶序列。66操作步驟1.細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進(jìn)入2.PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段3.原位雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物A.陽(yáng)性對(duì)照B.陰性對(duì)照C.原位檢測(cè)mRNA表達(dá)67三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)

通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程；結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量。68如何定量？Ct值的概念Ct值的定義：PCR擴(kuò)增過(guò)