膠質(zhì)細(xì)胞連接蛋白在神經(jīng)退行性疾病中的研究進(jìn)展

膠質(zhì)細(xì)胞連接蛋白在神經(jīng)退行性疾病中的研究進(jìn)展亓俊華，蘇一洵，易陳菊

膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中數(shù)量最多的細(xì)胞類型，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（centralnervoussystem，CNS）中和神經(jīng)元相互作用，調(diào)控CNS的多種生理及病理過程[1]。其中，星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte）是構(gòu)成血腦屏障的重要細(xì)胞類型[2]，可以形成突觸，控制離子平衡、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和清除[3-6]，還可以形成星形膠質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，為神經(jīng)元提供營養(yǎng)和支持，維持大腦穩(wěn)態(tài)[7]。少突膠質(zhì)細(xì)胞（Oligodendrocyte）由少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（Oligodendrocyteprecursorcells，OPC）分化產(chǎn)生，在CNS中形成髓鞘包裹軸突，其再生對損傷后的髓鞘修復(fù)至關(guān)重要[8]。OPC還表達(dá)炎癥因子受體，能夠遷移至損傷部位來響應(yīng)炎癥應(yīng)答，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)能力[9,10]。小膠質(zhì)細(xì)胞（Microglia）是CNS中的固有免疫細(xì)胞，生理情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞參與幾種管家功能，包括維持突觸（即消除、修剪或成熟）、神經(jīng)發(fā)生、認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)和免疫監(jiān)視[11-13]；在病理情況下，多種刺激分子能夠誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和趨化因子，觸發(fā)固有免疫應(yīng)答，損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)[14-16]。

連接蛋白（Connexin，Cx）是由四個(gè)α-螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域和2個(gè)細(xì)胞外環(huán)構(gòu)成的跨膜蛋白[17]。相鄰細(xì)胞膜上兩個(gè)Cx六聚體組成的連接子（Connexon）偶聯(lián)形成縫隙連接（gapjunction，GJ），可以直接允許小分子物質(zhì)、親水分子和離子通過[18]。連接子也可作為半通道（hemichannel，HC）開放，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外小分子物質(zhì)交換[19]。近年研究也發(fā)現(xiàn)Cx可發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號通路激活與細(xì)胞遷移等新的非通道功能[20,21]。Cx在大腦所有細(xì)胞類型中表達(dá)，如星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)以Cx43和Cx30為主[22]，少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Cx29、Cx32和Cx47[23]，原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Cx36和Cx45[24]，Cx43表達(dá)和免疫反應(yīng)性低，但是炎性因子處理的小膠質(zhì)細(xì)胞Cx43的表達(dá)和免疫反應(yīng)性顯著升高[25]。此外，膠質(zhì)細(xì)胞中還表達(dá)兩種泛連接蛋白（pannexin，Panx）—Panx1和Panx2，Panx與Cx蛋白有相似的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，但二者不具同源性。且已知Panx只能形成半通道[26]。在大多生理情況下，Cx主要作為縫隙連接發(fā)揮作用；而病理情況下，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化、氧化應(yīng)激、炎癥因子等因素能夠激活Cx半通道開放，介導(dǎo)膠質(zhì)遞質(zhì)釋放，損害神經(jīng)元功能及影響神經(jīng)元存活[27-31]。

神經(jīng)退行性疾病以神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的逐漸喪失為主要表現(xiàn)形式，常伴隨著淀粉樣蛋白沉積和大腦變性，是威脅人類健康的主要疾病[32,33]。神經(jīng)退行性疾病主要包括阿爾茲海默?。ˋlzheimer’sdisease，AD）、帕金森?。≒arkinson’sdisease，PD）和亨廷頓舞蹈?。℉untington’sdisease，HD）、肌萎縮性側(cè)索硬化癥（Amyotrophiclateralsclerosis，ALS）等[34-37]。值得注意的是，目前針對神經(jīng)退行性疾病經(jīng)典發(fā)病機(jī)制研發(fā)的治療策略無法有效地逆轉(zhuǎn)或緩解疾病發(fā)展，因此針對疾病新機(jī)制的探索尤為重要。近年來，大量的研究證實(shí)神經(jīng)退行性疾病中常伴隨膠質(zhì)細(xì)胞活化和膠質(zhì)細(xì)胞Cx表達(dá)和功能變化，揭示了膠質(zhì)細(xì)胞Cx在神經(jīng)退行性疾病中的作用。因此，本文就膠質(zhì)細(xì)胞Cx在神經(jīng)退行性疾病中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，探討靶向膠質(zhì)細(xì)胞Cx是否可以作為神經(jīng)退行性疾病新的治療策略。

1膠質(zhì)細(xì)胞Cx在AD中的作用

AD以進(jìn)行性記憶喪失、行為缺陷和顯著的人格改變?yōu)橹饕R床特征，是癡呆的主要類型[38]。淀粉樣斑塊沉積（amyloid-βplaques，Aβ）、神經(jīng)原纖維纏結(jié)（Neurofibrillarytangles，NFTs）、神經(jīng)元死亡和突觸丟失是AD的主要病理特征[39]。值得注意的是，膠質(zhì)細(xì)胞活化常伴隨Aβ斑塊出現(xiàn)，同時(shí)Cx的表達(dá)和功能也發(fā)生改變。AD患者大腦組織切片中發(fā)現(xiàn)Aβ斑塊附近的星形膠質(zhì)細(xì)胞的Cx43和Cx30呈斑點(diǎn)狀密集分布，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cx43和Panx1表達(dá)增加[40,41]。此外，在大于4月齡的APPswe/PS1dE9（APP/PS1）小鼠大腦皮質(zhì)和海馬Aβ斑塊周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43和Cx30的免疫反應(yīng)性隨Aβ沉積增加而增強(qiáng)[40]。相似的，在大于6月齡的5xFAD小鼠大腦皮質(zhì)和丘腦Aβ斑塊周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43免疫反應(yīng)性也顯著增強(qiáng)，盡管Cx43mRNA表達(dá)明顯降低[42]；另外，5xFAD小鼠中Aβ斑塊周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx30免疫反應(yīng)性增強(qiáng)，但是海馬體Cx30蛋白總表達(dá)水平和同齡對照組小鼠相比沒有明顯變化[42]。

大量研究證實(shí)AD中膠質(zhì)細(xì)胞Cx半通道的異常開放可能導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙。體外通過溴化乙啶（ethidiumbromide，EtBr）攝入實(shí)驗(yàn)檢測到Aβ25-35處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和活體海馬腦片Cx43表達(dá)增加，Cx43半通道被激活，使ATP和谷氨酸釋放到細(xì)胞外，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[43]。筆者也在9月齡APP/PS1小鼠活體腦片中Aβ斑塊附近檢測到星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和Cx43半通道異常開放，但是縫隙連接通訊沒有發(fā)生改變。利用Cx43半通道阻斷劑或條件性敲除星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43可顯著降低APP/PS1小鼠活體海馬腦片星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)鈣濃度[Ca2+]i和膠質(zhì)遞質(zhì)（ATP、谷氨酸）的釋放，減輕了海馬神經(jīng)元損傷[44]。這些研究揭示了Cx半通道可能是AD的潛在治療靶點(diǎn)。并且，筆者在前期工作中發(fā)現(xiàn)波爾定堿（Boldine）能夠通過血腦屏障，特異性抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43半通道活性而不改變縫隙連接功能，APP/PS1小鼠長期口服波爾定堿可以降低星形膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i水平和ATP/谷氨酸釋放，緩解海馬神經(jīng)元損傷[45]。此外，大麻素也可以抑制Aβ誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和活體腦片Cx43半通道活性和谷氨酸/ATP的釋放，降低神經(jīng)元損傷[46]。腹腔注射甘草次酸衍生物INI-0602，一種新的Cx半通道阻斷劑，能夠更好地通過血腦屏障，可顯著改善APP/PS1小鼠的認(rèn)知功能[47]。綜上所述，AD中Aβ斑塊附近Cx43與Cx30表達(dá)上調(diào)，半通道開放增加，通過膠質(zhì)遞質(zhì)的釋放導(dǎo)致神經(jīng)元退行性變，而抑制膠質(zhì)細(xì)胞半通道可減少海馬神經(jīng)元損傷。然而，Cx在AD病理中的表達(dá)與定位的調(diào)控機(jī)制尚不明確。半通道抑制劑是否可以挽救AD認(rèn)知功能，仍需進(jìn)一步研究。

2膠質(zhì)細(xì)胞Cx在PD中的作用

PD以大腦紋狀體和黒質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元（dopaminergicneurons，DAneurons）進(jìn)行性丟失、突觸核蛋白（α-synuclein）形成的路易小體（Lewybodies）、慢性神經(jīng)炎癥為主要病理特征[48,49]。此外，PD患者標(biāo)本以及動物模型的黑質(zhì)中也檢測到星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[50,51]。不同PD動物模型中均可觀察到Cx表達(dá)與功能的變化。早期研究發(fā)現(xiàn)魚藤酮（Rotenone）誘導(dǎo)PD大鼠模型中基底核Cx43總蛋白及絲氨酸磷酸化水平都升高，并在體外處理中增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接通訊[52]。而在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）誘導(dǎo)的PD小鼠模型中，可觀察到紋狀體星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cx43和Cx30表達(dá)升高[51]，Cx43半通道激活，[Ca2+]i水平增加[53]。相似的，體外α-synuclein處理能夠增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43半通道和Panx1半通道開放，導(dǎo)致[Ca2+]i升高，膠質(zhì)遞質(zhì)釋放，激活炎癥通路，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡[54]。而另一方面，LPS誘導(dǎo)的PD小鼠中腦總Cx43表達(dá)降低，但Cx43絲氨酸368磷酸化水平增加2倍[55]。

Cx的通道功能在PD中可能介導(dǎo)了多巴胺能神經(jīng)元的死亡。腹腔注射Cx43半通道阻斷劑TAT-Gap19可以抑制MPTP誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元死亡和小膠質(zhì)細(xì)胞激活[53]。同樣的，在LPS誘導(dǎo)PD模型中，Cx43通道抑制劑Gap27能降低多巴胺能神經(jīng)元的喪失，恢復(fù)多巴胺及代謝物的水平，同時(shí)Gap27還能抑制LPS誘導(dǎo)的黑質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，降低炎癥因子水平[55]。以上研究證實(shí)了靶向Cx43的通道功能是PD的潛在治療靶點(diǎn)。然而，Cx縫隙連接功能與半通道功能在PD中的作用還需進(jìn)一步研究，并且，Cx的非通道功能可能在PD中起到延緩疾病的作用：MPTP模型小鼠中Cx30的敲除可能通過細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)性激活，導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元死亡增加[51]。

3膠質(zhì)細(xì)胞Cx在其他退行性疾病中的作用

ALS以CNS中運(yùn)動神經(jīng)元進(jìn)行性丟失和進(jìn)行性麻痹為主要病理特征，神經(jīng)炎癥、膠質(zhì)細(xì)胞活化和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積累共同驅(qū)動了進(jìn)行性運(yùn)動神經(jīng)元的丟失[64]。ALS患者腦脊液、運(yùn)動皮質(zhì)和脊髓、ALS模型SOD1G93A小鼠脊髓和CTB-Sap誘導(dǎo)的ALS小鼠脊髓中都檢測到了星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43和GFAP表達(dá)增加[64-66]。另一種ALS模型mSOD1-Tg小鼠在發(fā)病前Cx的表達(dá)無明顯差異，但到18周齡，脊髓前角星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP、Cx43、Cx30和AQP4的免疫反應(yīng)性明顯增強(qiáng)。與之相反，20周齡脊髓前角中少突膠質(zhì)細(xì)胞Cx47和Cx32蛋白和mRNA水平都顯著降低[67]。此外，體外培養(yǎng)的SOD1G93A小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和Cx43表達(dá)增加，并且伴隨著縫隙連接和半通道功能增強(qiáng)[65]。半通道阻斷劑Gap26和Gap19可以保護(hù)運(yùn)動神經(jīng)元免于遭受SOD1G93A小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的損害[65]。Cx43半通道阻斷劑Gap19和托納博沙（tonabersat）能夠通過抑制ATP釋放，降低運(yùn)動神經(jīng)元的死亡。特異性敲除星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43的SOD1G93A小鼠脊髓中膠質(zhì)細(xì)胞活化受到抑制，疾病終末期頸髓運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)量得到維持[66]。INI-0602可顯著延長SOD1G93A和SOD1G37R小鼠壽命。，緩解疾病癥狀，同時(shí)還能夠減少SOD1G93A小鼠腰髓中神經(jīng)元損傷和膠質(zhì)細(xì)胞活化[47]，以上研究提示靶向Cx43半通道或許是ALS的重要治療策略。此外，SOD1G93A小鼠脊髓中也檢測到了Panx1的表達(dá)增高，但是Panx1在ALS發(fā)展中的功能尚未闡明[68]。

HD是一種常染色體顯性神經(jīng)退行性疾病，具有運(yùn)動、認(rèn)知和精神障礙三聯(lián)征[69,70]。在正常人和HD患者的大腦蒼白球中，Cx43均勻分布在神經(jīng)纖維，而尾狀核中Cx43密度增加，集中在HD斑塊處。此外，免疫染色檢測到HD尾狀核中GFAP表達(dá)顯著升高，退行性神經(jīng)元周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞高度活化，Cx43表達(dá)增加[71]。然而，近年來Cx半通道在HD中的作用研究相對較少，作用機(jī)制尚待發(fā)掘。

4小結(jié)

膠質(zhì)細(xì)胞Cx在神經(jīng)退行性疾病中表達(dá)與功能有廣泛的變化。在AD、PD和ALS中的研究證實(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43可作為半通道激活開放，通過膠質(zhì)遞質(zhì)釋放造成神經(jīng)元退行性