植物生物技術(shù)：第七章-植物原生質(zhì)體融合課件

第七章 植物原生質(zhì)體融合植物生物技術(shù)1第一節(jié) 原生質(zhì)體融合的發(fā)展和研究意義第二節(jié) 原生質(zhì)體融合的方法第三節(jié) 原生質(zhì)體融合方式第四節(jié) 體細(xì)胞雜種的篩選與鑒定第五節(jié) 體細(xì)胞雜種的遺傳分析第六節(jié) 原生質(zhì)體融合與植物遺傳改良本章主要內(nèi)容第7章植物原生質(zhì)體融合2本章教學(xué)目的與要求掌握原生質(zhì)體融合研究的意義熟悉原生質(zhì)體融合的主要方法及方式了解體細(xì)胞雜種的鑒定方法第7章植物原生質(zhì)體融合3第一節(jié)、原生質(zhì)體融合的概念和意義1、概念:原生質(zhì)體融合（Protoplast

fusion）體細(xì)胞雜交（Somatic

hybridization）是指不同種類的原生質(zhì)體不經(jīng)過有性階段，在一定條件下融合創(chuàng)造雜種的過程為了與有性雜交區(qū)別開來，原生質(zhì)體融合常常寫作“a（+）b”，其中a和b是兩個融合親本，（+）表示體細(xì)胞雜交第7章植物原生質(zhì)體融合4原生質(zhì)體融合概念的提出5（Melcher

et

al,1978）6像大多數(shù)雜種一樣，雜交株同時具有馬鈴薯和番茄的形態(tài)特征。其

中一些植株形成了“類似塊莖的生殖根”，但是沒有產(chǎn)生可結(jié)實的花、果實以及真正意義上的塊莖到目前為止“馬鈴薯—番茄”一類的體細(xì)胞雜交植物還不能產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益，但是其研究價值不可忽視7為什么“番茄—馬鈴薯”超級雜種植株沒有如科學(xué)家所想像的那樣，地上長番茄、地下結(jié)馬鈴薯？生物基因的表達(dá)不是孤立的，它們之間是相互調(diào)控、相互影響的馬鈴薯—番茄雜交植株的細(xì)胞中雖然具備兩個物種的遺傳物質(zhì)，但這些遺傳物質(zhì)的表達(dá)受到相互干擾，不能再像馬鈴薯或番茄植株中的遺傳物質(zhì)一樣有序表達(dá)，雜交植株不能地上長番茄、地下結(jié)馬鈴薯就是很自然的了82、植物原生質(zhì)體融合的發(fā)展91970年，Power首次用硝酸鈉為誘導(dǎo)劑進(jìn)行了較大規(guī)模的原生質(zhì)體誘導(dǎo)融合1972年，Carlson首次獲得粉藍(lán)煙草和郎氏煙草的細(xì)胞雜種，這也是第一個植物細(xì)胞雜種1974年，聚乙二醇誘導(dǎo)融合技術(shù)的建立并應(yīng)用于植物細(xì)胞融合1978年，Melchers獲得了第一個屬間細(xì)胞雜種番茄＋馬鈴薯1981年，Zimmerman發(fā)明了電融合儀，首次提出了電融合概念1987年，Schweiger建立了單對原生質(zhì)體電融合技術(shù)程序至今300多例植物種屬間原生質(zhì)體融合3、原生質(zhì)體融合的意義10物種間生殖隔離阻礙了物種之間的基因交流,從而給作物育種帶來很大的局限性原生質(zhì)體融合技術(shù)是實現(xiàn)基因重組的一條新途徑，目前利用細(xì)胞融合已從很多作物種、屬間，甚至科間獲得體細(xì)胞雜種，創(chuàng)造了一些自然界不存在的植物類型克服有性雜交不親和一些植物的野生材料具有很好的抗性，但與栽培品種之間存在有性雜交不親和現(xiàn)象，難以通過常規(guī)技術(shù)實現(xiàn)有益抗性的轉(zhuǎn)移。原生質(zhì)體融合不涉及到雌雄性配子，從而可以克服生殖障礙番茄薯或薯番茄盡管沒有實際價值，但其設(shè)想還是具有很深遠(yuǎn)的意義11（2 ）轉(zhuǎn)移有利的農(nóng)藝性狀，創(chuàng)造新的種質(zhì)材料作物栽培品種常常缺乏某些抗性性狀，在栽培中處于不利地位野生種中具有很多優(yōu)良的抗性，通過原生質(zhì)體融合可以將野生種的抗性轉(zhuǎn)移進(jìn)栽培種中12（3）

轉(zhuǎn)移胞質(zhì)基因，為研究體細(xì)胞遺傳提供途徑和材料植物的細(xì)胞質(zhì)控制著很多優(yōu)良的性狀，如線粒體控制胞質(zhì)雄性不育，葉綠體控制的抗除草劑特性有性雜交的胞質(zhì)成分主要為母系遺傳，不可能實現(xiàn)雜交親本的胞質(zhì)雜交。但原生質(zhì)體融合則可以達(dá)到此目的13本節(jié)完第二節(jié)、原生質(zhì)體融合的方法自發(fā)融合誘發(fā)融合第7章植物原生質(zhì)體融合14一、自發(fā)融合（Spontaneous

fusion

）自發(fā)融合是在酶解細(xì)胞壁過程中，有些相鄰的原生質(zhì)體彼此融合形成同核體來源于分裂旺盛細(xì)胞的原生質(zhì)體，自發(fā)融合的頻率較高小孢子來源的原生質(zhì)體融合率可高達(dá)50%-70%。實際上自然條件下受精就是一種自發(fā)融合第二節(jié)、原生質(zhì)體融合的方法15二、誘發(fā)融合主要誘發(fā)融合方式NaNO3高pH-高鈣法PEG法電融合法第二節(jié)、原生質(zhì)體融合的方法16(一)無機(jī)鹽誘導(dǎo)融合:NaNO3法1972年：Carlson誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合獲得首例雜種植株粉藍(lán)煙草和朗氏煙草體細(xì)胞雜種。NaNO3的作用：中和質(zhì)膜的負(fù)電荷，使原生質(zhì)體不再相互排斥，而緊密結(jié)合在一起不足：誘導(dǎo)頻率不高，約1%第二節(jié)、原生質(zhì)體融合的方法171973年：Keller用pH10.5的50

mM

CaCl2溶液在37℃時，誘發(fā)煙草葉肉原生質(zhì)體融合。高鈣促進(jìn)原生質(zhì)體結(jié)合，高PH可以改變質(zhì)膜表面的電荷性質(zhì)，有利于融合。優(yōu)點：雜種產(chǎn)量高，達(dá)到20-50%。不足：高pH值對細(xì)胞有毒害作用。（二）高pH-高Ca法第二節(jié)、原生質(zhì)體融合的方法18-+-PEG橋梁,使原生質(zhì)體凝聚+-PEG被洗脫-

+

+

-導(dǎo)致質(zhì)膜表面電荷重排，電荷的重排導(dǎo)致一個原生質(zhì)體的負(fù)性電荷部位與另一原生質(zhì)體的正性電荷部位相連而導(dǎo)致融合++-

-++-

-膜接觸第二節(jié)、原生質(zhì)體融合的方法（三）PEG法19Polyethylene

Glycol（聚乙二醇）PEG誘導(dǎo)小麥與玉米融合產(chǎn)生不育雜種PEG誘導(dǎo)小麥與玉米融合產(chǎn)生不育雜種2021PEG法優(yōu)點：融合頻率高可重復(fù)性強(qiáng)毒性較低誘發(fā)融合無特異性植物+植物植物+動物動物+酵母第二節(jié)、原生質(zhì)體融合的方法22PEG誘導(dǎo)融合的不足之處PEG處理后線粒體變形融合產(chǎn)物粘在融合器皿上培養(yǎng)時融合體分裂頻率不高第二節(jié)、原生質(zhì)體融合的方法23具體做法：在無菌條件下混合雙親原生質(zhì)體----滴加PEG溶液，搖勻，靜置---滴加高鈣-高pH溶液，搖勻，靜置---滴加原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌數(shù)次---離心獲得原生質(zhì)體細(xì)胞團(tuán)---篩選---再生雜合細(xì)胞1976年Kao發(fā)現(xiàn)用含高濃度Ca2+的強(qiáng)堿溶液（0.05M

CaCl2·2H2O，pH為9或10）清洗PEG誘導(dǎo)后的原生質(zhì)體時，融合頻率得到進(jìn)一步提高，因而發(fā)展起高鈣高pH-PEG法（四）PEG結(jié)合高鈣-高pH誘導(dǎo)法第二節(jié)、原生質(zhì)體融合的方法24(五)電融合技術(shù)第二節(jié)、原生質(zhì)體融合的方法25Senda

1979年首先用此方法實現(xiàn)原生質(zhì)體融合細(xì)胞融合儀電融合儀的結(jié)構(gòu)特點：一是交變電場部分；

一是高頻直流電擊部分261.電融合法原理交流電場使原生質(zhì)體表面電荷偶極化沿著電極排列，形成串珠施加直流電場后，形成串珠的原生質(zhì)體在質(zhì)膜接觸處發(fā)生穿孔，最后形成融合的原生質(zhì)體。負(fù)極正極-+-

++-+-第二節(jié)、原生質(zhì)體融合的方法負(fù)極正極-+負(fù)極正極272.原生質(zhì)體電融合過程：原生質(zhì)體接觸質(zhì)膜融合圓球化核融合第二節(jié)、原生質(zhì)體融合的方法28無化學(xué)毒性，對細(xì)胞傷害小融合效率高重復(fù)性強(qiáng)融合技術(shù)操作簡便電參數(shù)容易精確調(diào)節(jié)第二節(jié)、原生質(zhì)體融合的方法3.

電融合優(yōu)點本節(jié)完第三節(jié)、原生質(zhì)體融合方式對稱融合（Symmetric

fusion）非對稱融合（Asymmetric

fusion）第7章植物原生質(zhì)體融合30一、對稱融合是親本原生質(zhì)體在融合前未進(jìn)行任何處理（如輻射、碘乙酰胺等）的一種融合方式。但由于它綜合雙親的全部性狀，在導(dǎo)入有利性狀的同時，也不可避免地帶入了一些不利性狀對稱融合再生模型（×表示核物質(zhì)，表示細(xì)胞質(zhì)成分）第三節(jié)、原生質(zhì)體融合方式31二、非對稱融合在融合前，對一方原生質(zhì)體進(jìn)行射線照射處理，以鈍化其細(xì)胞核（供體，Donor），另一方原生質(zhì)體（受體，Recipient）不處理或經(jīng)化學(xué)試劑（如碘乙酰胺、碘乙酸、羅丹明6-G等）處理，所以也稱供-受體融合（Donor-recipient

fusion）。第三節(jié)、原生質(zhì)體融合方式321、供體處理造成染色體的斷裂和片段化，從而使供體染色體進(jìn)入到受體后部分或全部丟失，達(dá)到轉(zhuǎn)移部分遺傳物質(zhì)或只轉(zhuǎn)移細(xì)胞質(zhì)的目的對供體的處理有以下幾種方法：射線（X、γ和UV）輻射原生質(zhì)體限制性內(nèi)切酶處理原生質(zhì)體紡錘體毒素、染色體濃縮劑處理原生質(zhì)體第三節(jié)、原生質(zhì)體融合方式332、受體的處理為了減少融合再生后代的篩選工作，利用一些代謝抑制劑（Metabolisminhibitor）處理受體原生質(zhì)體以抑制其分裂常用的抑制劑有碘乙酸（Iodoacetic

acid，IA）、碘乙酰胺（Iodoacetamide，IOA）和羅丹明6-G（Rhodamin

6-G，R-6-G）受IA、R-6-G和IOA處理的細(xì)胞和未受代謝抑制劑處理的細(xì)胞發(fā)生融合后，代謝上就會得到互補(bǔ)，從而能夠正常地生長第三節(jié)、原生質(zhì)體融合方式343、非對稱融合方式“供體-受體”系統(tǒng)“胞質(zhì)體-原生質(zhì)體”融合“小原生質(zhì)體-原生質(zhì)體”融合胞質(zhì)體（Cytoplast，無細(xì)胞核，只有細(xì)胞質(zhì)）小原生質(zhì)體（Miniprotoplast，具備完整細(xì)胞核但只含部分細(xì)胞質(zhì)）微小原生質(zhì)體（Microprotoplast，只有1條或幾條染色體的原生質(zhì)體）第三節(jié)、原生質(zhì)體融合方式3536三、 融合產(chǎn)物對稱融合和非對稱融合再生的體細(xì)胞雜種均能夠獲得對稱雜種、非對稱雜種和胞質(zhì)雜種三種情況。對稱雜種（Symmetric

hybrid）指雜種中具有融合雙親全部的核遺傳物質(zhì)。非對稱雜種（Asymmetric

hybrid）指雙親或其中一方的核遺傳物質(zhì)出現(xiàn)了丟失。胞質(zhì)雜種（Cybrid）是非對稱雜種的一種，指融合一方的核物質(zhì)完全丟失，并且具有雙方的細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)。異質(zhì)雜種（Alloplasmic

hybrid），指雜種的細(xì)胞核來源于一方，而細(xì)胞質(zhì)來自于另一方第三節(jié)、原生質(zhì)體融合方式本節(jié)完第四節(jié)、體細(xì)胞雜種的篩選和鑒定一、體細(xì)胞雜種的篩選在融合群體中，含有異源融合子、同源融合子、未融合的原生質(zhì)體互補(bǔ)選擇法機(jī)械分離雜種細(xì)胞法雙熒光標(biāo)記選擇法第7章植物原生質(zhì)體融合37（一）互補(bǔ)法篩選利用2個親本對培養(yǎng)基、抗代謝物、或溫度等的敏感性存在著天然的互補(bǔ)性進(jìn)行選擇叫互補(bǔ)法選擇。也可以利用隱性基因的互補(bǔ)性進(jìn)行選擇。1、激素自養(yǎng)型篩選2、營養(yǎng)缺陷型突變互補(bǔ)3、利用對抗代謝物質(zhì)的敏感性互補(bǔ)進(jìn)行篩選第四節(jié)、體細(xì)胞雜種的篩選和鑒定381、激素自養(yǎng)型篩選第四節(jié)、體細(xì)胞雜種的篩選和鑒定39粉藍(lán)煙草和郎氏煙草的野生型葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體是激素異養(yǎng)型細(xì)胞，原生質(zhì)體不分裂；雜種細(xì)胞是激素自養(yǎng)型細(xì)胞，且在沒有激素的培養(yǎng)基上可以旺盛分裂；使融合產(chǎn)物在不含激素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能夠產(chǎn)生細(xì)胞團(tuán)的就是融合的原生質(zhì)體2、營養(yǎng)缺陷型突變互補(bǔ)硝酸還原酶的蛋白突變體和輔因子突變體，突變體不能利用硝態(tài)氮，只能利用銨態(tài)氮。兩者的突變位點不同，原

生質(zhì)體融合后，硝酸還原

酶恢復(fù)，可以利用硝態(tài)氮。第四節(jié)、體細(xì)胞雜種的篩選和鑒定40413、利用對抗代謝物質(zhì)的敏感性互補(bǔ)進(jìn)行篩選Petunia

parodii矮牽牛Petunia

hybrida矮牽牛在MS

培養(yǎng)基中可以形成肉眼可見的愈傷組織團(tuán)在MS

培養(yǎng)基中只形成很小的細(xì)胞團(tuán)，不能進(jìn)行生長加入1μg/L放線菌素-D，原生質(zhì)體完全不能分裂加入1μg/L放線菌素-D，原生質(zhì)體的分裂不受影響在加入1μg/L放線菌素-D的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能夠進(jìn)行生長的愈傷組織即為體細(xì)胞雜種原生質(zhì)體融合第四節(jié)、體細(xì)胞雜種的篩選和鑒定（二）機(jī)械法篩選利用葉肉細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞原生質(zhì)體的天然色澤標(biāo)記進(jìn)行選擇。油菜葉肉細(xì)胞的原生質(zhì)體與擬南芥的培養(yǎng)細(xì)胞的原生質(zhì)體融合，培養(yǎng)3-5天后，在顯微鏡下用微吸管將融合產(chǎn)物（4-8個細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)）轉(zhuǎn)移，進(jìn)行微室培養(yǎng)。第四節(jié)、體細(xì)胞雜種的篩選和鑒定42異硫氰酸熒光素（FITC）：綠色異硫氰酸羅丹明（RITC）：紅色（三） 雙熒光標(biāo)記選擇法第四節(jié)、體細(xì)胞雜種的篩選和鑒定43二、體細(xì)胞雜種植株的鑒定形態(tài)學(xué)鑒定

細(xì)胞學(xué)鑒定

分子標(biāo)記鑒定熒光原位雜交鑒定蛋白質(zhì)電泳分析第四節(jié)、體細(xì)胞雜種的篩選和鑒定44（一）、形態(tài)學(xué)鑒定雜種在形態(tài)上往往介于雙親之間，包括株型、葉形、花器官等第四節(jié)、體細(xì)胞雜種的篩選和鑒定45柑桔異源融合子46（二）、細(xì)胞學(xué)鑒定：染色體觀察：染色體數(shù)目是雙親之和，或少1至幾條染色體；細(xì)胞融合可以創(chuàng)造非整倍體、代換系、染色體片段置換系等材料第四節(jié)、體細(xì)胞雜種的篩選和鑒定47流式細(xì)胞儀倍性分析：利用細(xì)胞倍性檢測儀可以粗略地分析雜種細(xì)胞的倍性，一般與雙親對照分析，測出的雜種的DNA含量基本是雙親之和。第四節(jié)、體細(xì)胞雜種的篩選和鑒定48（三）、分子標(biāo)記鑒定：最有效的檢測手段，能檢測出遺傳物質(zhì)的細(xì)小重組第四節(jié)、體細(xì)胞雜種的篩選和鑒定P1

P249P1P2（四）、熒光原位雜交（FISH）鑒定：鑒定異源染色體的重組情況，將重組片段定位在染色體上。第四節(jié)、體細(xì)胞雜種的篩選和鑒定50(五)、蛋白質(zhì)電泳分析：從基因表達(dá)產(chǎn)物判斷真假雜種，一般應(yīng)有雙親作對照，可以對多種蛋白作分析第四節(jié)、體細(xì)胞雜種的篩選和鑒定51本節(jié)完第五節(jié)、體細(xì)胞雜種的遺傳分析一、體細(xì)胞雜種的遺傳特性:（一）

細(xì)胞分裂與染色體丟失對稱融合中，核同步分裂并融合，雜種具有雙親的核物質(zhì)核同步分裂并融合，但出現(xiàn)染色體丟失，得到非對稱雜種細(xì)胞分裂而核不融合，細(xì)胞分裂幾次以后即停止生長從而導(dǎo)致死亡細(xì)胞分裂而核不融合，再生植株分離，得到胞質(zhì)雜種，異質(zhì)雜種或親本核不融合而分別分裂，形成具多核體的雜種，可能發(fā)生基因組間和基因組內(nèi)重組核不融合，其中一方被排除，得到胞質(zhì)雜種或異質(zhì)雜種第7章植物原生質(zhì)體融合522、基因轉(zhuǎn)移與性狀表達(dá)由于染色體的部分丟失，常常使某個親本的部分或個別基因與另一親本的染色體發(fā)生整合，其結(jié)果是實現(xiàn)了親本間的基因轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)移通常是在后代中某些性狀得以表達(dá)，有時由于基因的重組也可能產(chǎn)生雙親均沒有的新性狀第五節(jié)、體細(xì)胞雜種的遺傳分析533、體細(xì)胞雜種遺傳上的不穩(wěn)定性親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近：關(guān)系越遠(yuǎn)，染色體丟失越嚴(yán)重融合親本的倍性：倍性差異越大，染色體丟失越嚴(yán)重射線的處理