過氧化物酶體增殖物激活受體

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬II型核受體超家族成員,存在3種亞型，即PPARa、PPAR&PPARy，這三種亞型在結(jié)構(gòu)上有一定的相似性，均含DNA結(jié)合區(qū)和配體結(jié)合區(qū)等。PPAR與配體結(jié)合后被激活，與9-順視黃酸類受體形成異二聚體，然后與靶基因的啟動子上游的過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件(peroxisomeproliferatorresponseelement,PPRE)結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。PPRE由含相隔一個或兩個核苷酸的重復(fù)序列AGGTCA組成。與配體結(jié)合后，PPAR在DNA結(jié)合區(qū)發(fā)生變構(gòu)，進(jìn)而影響PPAR刺激靶基因轉(zhuǎn)錄的能力。PPAR6幾乎在所有組織中表達(dá)，濃度低于PPARa及PPARy，直至最近以前尚未找到此一核受體的選擇性配基。PPAR6是代謝綜合征(肥胖、胰島素抵抗、高血壓是與脂質(zhì)紊亂有關(guān)的共同的病態(tài)表現(xiàn))的一個新靶點(diǎn)。有不少的研究表明：GW501516可作為PPAR6的特異激動劑用于研究參考網(wǎng)址：/cjh/2003/shownews.asp?id=156/conference/preview.php?kind_id=03&cat_name=ADA2001&title_id=59219RegulationofMuscleFiberTypeandRunningEnduraneebyPPAR6plosbiology，Volume2|Issue10|October2004/plosonline/?request=get-document&doi=10.1371%2Fjournal.pbio.0020294NF-KB通路中的抑制劑好像有l(wèi).PDTC(pyrrolidinedithiocarbamate),是一種抗氧化劑，主要作用于IkB降解的上游環(huán)節(jié)(iKBa的磷酸化或IKK的活性水平)，2.Gliotoxin是一種免疫抑制劑，機(jī)制可能從多個環(huán)節(jié)阻斷NF-KB的激活，如IkB的降解，NF-KB的核移位和與DNA的結(jié)合。3.PSI(proteasomeinhibitor)。以上好像美國Sigma公司有生產(chǎn)。/bbs/thread/403317除了各種信號分子經(jīng)典的阻滯劑，如PI-3K的PD*****,也有針對核膜轉(zhuǎn)運(yùn)的阻滯，分為非特異性的和特異性的兩種。Daines等，使用detergent-sensitivefactor，非特異的阻斷STAT6/STAT6二聚體入核。詳見下列文獻(xiàn)：1，DainesMO,AndrewsRP,ChenW,El-ZayatySA,HersheyGK.DNAbindingactivityofcytoplasmicphosphorylatedSTAT6ismaskedbyaninteractionwithadetergent-sensitivefactor.JBiolChem.2003Aug15;278(33):30971-4.Epub2003May302，AndrewsRP,EricksenMB,CunninghamCM,DainesMO,HersheyGK.Analysisofthelifecycleofstat6.ContinuouscyclingofSTAT6isrequiredforIL-4signaling.JBiolChem.2002Sep27;277(39):36563-9.Epub2002Jul16Lisa等人，通過改變核定位分子nuclearlocalizationsignals(NLSs)和接頭分子adaptersofthekaryopherin-arfa/importin-arfa(Kap-arfa/Imp-arfa)family特異的阻斷inportin-beta介導(dǎo)的入核。詳見下列文獻(xiàn)：LisaM.Nelson,RobertC.Rose,andJunonaMoroianu.NuclearImportStrategiesofHighRiskHPV16L1MajorCapsidProtein.THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY.Vol.277,No.26,IssueofJune28,pp.23958-23964,2002曲古抑菌素（TSA）,可以延長NF-KB在核內(nèi)的時間，阻止NF-kB出核FK506,而非FK509,可以減少神經(jīng)鈣蛋白（calcineurin）對NF-AT的去磷酸化，使NF-AT的核定位信號無法與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合，阻止其入核針對NPC上核孔蛋白的抗體，也可干預(yù)NPC作用，使經(jīng)過NPC的入核作用受損PPAR家族簡直可以競爭近幾年的靶點(diǎn)之星了。關(guān)于響應(yīng)元件PPRE，ppar-gamma和PPAR-alpha的是一樣的，PPRE是以AGGTCANAGGTCA這樣一個AGGCTA二倍體作為基本單元的,delta的有所不同。PPAR跟激動劑結(jié)合以后，跟9-順視黃酸類X受體（RXR）組成異二聚體，分別各自結(jié)合一個AGGTCA，從而刺激靶基因轉(zhuǎn)錄。已經(jīng)上市的PPAR激動劑藥物都是gamma的，都是具有噻唑烷酮結(jié)構(gòu)的化合物，比如pioglitazone,rosciglitazone，troglitazone（因肝毒性被叫停）PPAR家族主要參與脂肪代謝，并進(jìn)一步參與糖代謝。目前研究顯示，PPAR不僅僅是II型糖尿病的靶點(diǎn)，其他相關(guān)的重要疾病有高血脂，炎癥（動脈粥樣硬化），癌癥（胃癌和脂肪癌），肥胖。這些還需要進(jìn)一步研究，特別是delta的作用。方便的研究PPAR的轉(zhuǎn)錄激活作用，特別是高通量篩選（highhighthroughputsceening）PPAR激動劑，沒有比報(bào)告基因更好的方法，可以方便而靈敏的檢測了?！痘罨疶細(xì)胞核因子（NFAT）》活化T細(xì)胞核因子（NuclearFactorofActivatedTCells,NFAT）在免疫反應(yīng)中對誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄起重要作用。NFAT蛋白在T細(xì)胞及其它類型的免疫細(xì)胞中如B細(xì)胞、NK細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞上表達(dá)［1,2］oNFAT蛋白因那些與Ca2+動員連接受體的激活而被活化，如T和B細(xì)胞的抗原識別受體、肥大細(xì)胞和嗜鹼性粒細(xì)胞的FceR等。受體的激活和Ca2+動員導(dǎo)致了許多細(xì)胞內(nèi)酶包括依賴Ca2+/鈣調(diào)蛋白的磷酸脂酶Calcineurin的活化,Calcineurin是活化T細(xì)胞核因子發(fā)揮作用的主要激活因子［1］。受激細(xì)胞誘導(dǎo)一大批與活化有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，許多基因都可能是NFAT的靶基因，這些基因編碼轉(zhuǎn)錄因子、信號蛋白、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面受體和其它效應(yīng)蛋白。免疫抑制藥物FK2506和環(huán)孢菌素A通過抑制Calcineurin可阻斷3種抗原受體通路（NFAT、NFkB和JNP）,抑制成熟淋巴細(xì)胞增殖［3］。作為Calci2neurin的底物,NFAT是FK2506和環(huán)抱菌素A主要的靶，結(jié)構(gòu)已知有4種哺乳類NFAT基因,它們編碼約含700?1000個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。在NFAT蛋白中，有兩個相鄰的非常保守的區(qū)域即NFAT同源區(qū)（NHR,約300個氨基酸殘基）［5］和DNA結(jié)合區(qū)（DBD，約270個氨基酸殘基）［6］。NHR和DBD夾在兩條多肽鏈兩端多變的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)之間［7］。NFAT1的分析表明NFAT蛋白的氨基端和梭基端都含有轉(zhuǎn)錄活化區(qū)（TAD）。分類NFAT1、NFAT2、NFAT3和NFAT4調(diào)節(jié)Calcineurin在NFAT活化中起著十分重要的作用。NFAT的活化有三步:脫磷酸、核易位、對DNA親和力的提高。（1）在靜止細(xì)胞中,NFAT蛋白被磷酸化，存在于胞漿，對DNA具低親和力。（2）引起Ca2+動員的刺激物導(dǎo)致NFAT的快速脫磷酸和入核;脫磷酸的NFAT對DNA的親和力增高。NFAT蛋白的活化緊隨Calcineurin的活化之后，在T細(xì)胞中，游離的Ca2+水平高,Calcineurin的活性就高,NFAT1就能在核內(nèi)保持長時間的活化狀態(tài)。如果去除Ca2+刺激物ionomycin或加了Calcineurin的抑制物環(huán)抱菌素A和FK506而使Calcineurin的活性受到抑制，則NFAT1在5?15分鐘內(nèi)恢復(fù)磷酸化狀態(tài),并回到胞漿內(nèi)，對DNA親和力大大降低［10］。用Calcineurin或鹼性磷酸酶作用于細(xì)胞提取物可引起NFAT1DNA結(jié)合力的提高［12］。這說明磷酸化的殘基直接或間接掩蓋了NFAT1中的DNA結(jié)合區(qū),而脫磷酸可能通過NFAT內(nèi)在構(gòu)象的改變，暴露這些區(qū)域使其易于被接近。除Calcineurin之外還有很多蛋白和信號通路可以調(diào)節(jié)NFAT。①TCR參與的通路:TCR交聯(lián)引起的最早結(jié)果是酪氨酸激酶包括Lck和ZAP270的活化以及包括引起Vav在內(nèi)的許多細(xì)胞內(nèi)底物的酪氨酸磷酸化丄ck和ZAP270的活化引起T細(xì)胞內(nèi)的Ca2+動員［13］，由此引起依賴NFAT的報(bào)告基因表達(dá)。②PMA激活的信號通路:已知PMA在T細(xì)胞內(nèi)的作用是激活蛋白激酶C、Ras、Raf,(1)Ras對于NFAT的功能是必不可少的，活化的Ras可以有效地代替PMA,同基礎(chǔ)的活化的Calcineurin—起為依賴NFAT的報(bào)告基因表達(dá)提供充分刺激,而顯性陰性的Ras則抑制TCR引起的NFAT活化。Ras有多種多樣的效應(yīng)蛋白如Raf、Ras、與Ras有關(guān)的GTP酶Rac和Rho。(2)Raf通路對于AP-1的誘導(dǎo)是很重要的,Raf可以激活MEK1(有雙向活性的激酶)，而MEK1又可激活MAP激酶EPK1和ERK2。在T細(xì)胞中，活化的Raf和ERK1代替PMA與ionomycin協(xié)同刺激NFAT驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄，但不如活化的Ras有效。同時，這些蛋白質(zhì)的顯性陰性形式也僅部分抑制Ras介導(dǎo)的活化。(3)另一種Ras的效應(yīng)蛋白的活性形式Rac21,可通過不含ERK的通路最大限度地激活,AP-1驅(qū)動的報(bào)告基因的表達(dá)，即使是與ionomycin或活化的MEK1聯(lián)合以后也是如此。綜上，說明T細(xì)胞中存在另一條Ras效應(yīng)蛋白通路并為最大限度地表達(dá)NFAT:AP21驅(qū)動的報(bào)告基因所需［15］。關(guān)于這條通路目前還不清楚。③與Ca2+動員有關(guān)的通路：［Ca2+］i的增加可激Calcineurin,也可導(dǎo)致其它依賴Ca2+/鈣調(diào)蛋白激酶的激活。其中，兩種有多種功能的激酶(CaMK)可以調(diào)節(jié)NFAT的活性。在T細(xì)胞中CaMKIIyB能部分抑制人Jur/ket細(xì)胞中NFAT和AP21驅(qū)動的報(bào)告基因表達(dá),且抑制活化Calcineurin加強(qiáng)IL22啟動子功能［16］。而活化的CaMKIVPGY具有相反作用，通過激活A(yù)P21大幅度地加強(qiáng)NFAT活性。CaMKIVPGy通過上調(diào)血清反應(yīng)因子(SRF)的轉(zhuǎn)錄功能和隨后的c2Fos誘導(dǎo)引起NFAT活性加強(qiáng)且不被顯性陰性形式Ras抑制。這兩種CaMKs的相反作用與它們對不同細(xì)胞內(nèi)底物的靶作用有關(guān)［17］。4功能細(xì)胞因子基因調(diào)節(jié)區(qū)中的NFAT結(jié)合部位可分為I類(GroupI)和11類(GroupII)。1類包括在該位點(diǎn)上NFAT蛋白能與AP21或其它bZIP蛋白形成協(xié)同復(fù)合體的位點(diǎn)。II類包括那些通常的Rel家族蛋白結(jié)合位點(diǎn)和與其相似的位點(diǎn)。NFAT通過與多種細(xì)胞因子基因調(diào)節(jié)區(qū)中多種NFAT結(jié)合部位結(jié)合引起共轉(zhuǎn)錄。NFAT蛋白的DBD可能與Rel家族蛋白的DBD三維結(jié)構(gòu)相似，并用相應(yīng)的環(huán)與DNA建立接觸［6］。NFAT蛋白在結(jié)合DNA和使轉(zhuǎn)錄活化時表現(xiàn)出與AP21協(xié)同的能力,NFAT和AP21的協(xié)同見于許多不同細(xì)胞因子的增強(qiáng)子P啟動子。在由Fos和Jun的bZIP成分，人NFAT1的RHR和含鼠IL22啟動子遠(yuǎn)端ARRE2序列DNA片段形成的一種晶體化四元復(fù)合物中,NFAT和AP21間有一延伸的接觸面,NFAT的DBD和AP21的bZIP成分結(jié)合并和DNA組成一緊密復(fù)合體,NFAT和AP21的接觸表面形成了一個能識別15個鹼基對的溝［18］。NFAT和AP21在DNA上接觸鄰近位點(diǎn)且包含兩種轉(zhuǎn)錄因子的DNA2蛋白復(fù)合體較僅含一種蛋白的復(fù)合體具有更大的穩(wěn)定性和親和力。細(xì)胞因子基因的每個調(diào)節(jié)區(qū)域包含3?5個結(jié)合NFAT的部位,總長度在200?300個鹼基對，表明有效的轉(zhuǎn)錄需包含NFAT復(fù)合體之間高度有效的協(xié)同。許多系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄激活需要一個協(xié)同的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的有序集合,包括轉(zhuǎn)錄因子、協(xié)同激活因子和核心轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)。NFAT位點(diǎn)的序列相對其它有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子位點(diǎn)的排列有很大的可變性,這就決定了其誘導(dǎo)基因表達(dá)的特異性,如NFAT和Oct蛋白在IL22和IL24啟動子上的相互作用，前一種為協(xié)同關(guān)系，后一種為爭關(guān)系。很可能特定的NFAT蛋白和在不同類型細(xì)胞中表達(dá)的協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子,或是介導(dǎo)這些轉(zhuǎn)錄因子和基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物間相互作用的細(xì)胞特異的核協(xié)同刺激因子或抑制因子決定選擇性的基因表達(dá)。NFAT1基因裂解導(dǎo)致無DNA結(jié)合活性蛋白表達(dá)［19］甚至無蛋白表達(dá)［20］。NFAT1缺陷鼠除有一定程度脾腫大外，發(fā)育和免疫正常。但某種初次和再次免疫應(yīng)答顯著增強(qiáng),在至少3種實(shí)驗(yàn)環(huán)境中有發(fā)展為TH2反應(yīng)的傾向:過敏炎癥活體模型中檢測到嗜酸性粒細(xì)胞在胸膜內(nèi)的數(shù)目增加和血漿IgE水平升高［20］;用TNP2卵白蛋白免疫接種時，血漿IgE水平升高;試管內(nèi)受IL24和抗CD3刺激的脾細(xì)胞更易向TH2表現(xiàn)型分化。在正常鼠,NFAT1的活化可以誘發(fā)某些細(xì)胞內(nèi)抑制因子或細(xì)胞表面受體表達(dá),或減弱活化效應(yīng)蛋白表達(dá),從而減弱免疫反應(yīng)強(qiáng)度,并可能限制TH2型細(xì)胞因子后期表達(dá)，而NFAT1缺陷鼠可能引起早期細(xì)胞因子的變化而改變后期細(xì)胞因子的平衡，從而改變總體反應(yīng)的類型［19］；或有另一種與NFAT1抗衡的NFAT蛋白支持TH2型細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄。綜上,NFAT1的表達(dá)和功能缺陷與過敏性疾病的發(fā)生有很密切的關(guān)系。另外，編碼所有4種NFAT蛋白的mRNA在睪丸和P或卵巢中及在骨骼或心肌細(xì)胞中均有表達(dá),這表明NFAT可能在生殖和肌肉發(fā)育及其功能發(fā)展中起作用?！?90鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和NFAT在T細(xì)胞活化中的作用》T淋巴細(xì)胞活化機(jī)制是現(xiàn)代免疫學(xué)重要命題之一，從TCR接受APC提供的抗原信息到T細(xì)胞基因活化并開始增殖或產(chǎn)生細(xì)胞因子是一個復(fù)雜而精細(xì)的過程，其間涉及諸多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的相互作用。已知NFAT是T細(xì)胞基因活化的關(guān)鍵信號元件之一，而NFAT作用的發(fā)揮又依賴于CaN的作用。近年來有關(guān)CaN和NFAT在T淋巴細(xì)胞激活過程中的作用及其機(jī)理得到了廣泛研究,并取得較大進(jìn)展,現(xiàn)簡要綜述如下。一、 鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶CaN是目前所知的唯一依賴于Ca2+.鈣調(diào)素的Ser.Thr磷蛋白磷蛋白酸酶，在分類上屬于磷蛋白磷酸酶22B(PP22③,70年代末80年代初由加拿大籍華人王學(xué)荊教授，美籍華人張槐耀教授及美國的Klee教授的實(shí)驗(yàn)室分別在豬腦中發(fā)現(xiàn)并純化成功,由于它結(jié)合CaM并且在動物神經(jīng)元中大量存在,Klee將其命名為Calcineurin,我們將它漢譯為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶。CaN是一個由61KD的A亞基和19KD的B亞基組成的異二聚體,A亞基(CaNA)為催化亞基與CaM結(jié)合；B亞基(CaN②為調(diào)節(jié)亞基,與Ca2+結(jié)合。生物化學(xué)和遺傳學(xué)研究表明,CaNA由5個不同結(jié)構(gòu)域組成:N2末端區(qū),催化區(qū),CaNB結(jié)合區(qū)，CaM結(jié)合區(qū)及自抑制區(qū)(auto2inhibitory,AI);CaNB結(jié)合4個Ca2+，與CaM的序列有33235%的同源性，其二級結(jié)構(gòu)與CaM很相似°CaN的磷酸酶活性由Ca2+結(jié)合CaNB和CaM結(jié)合CaNA激活。此外,CaN的活性還需要二價金屬離子如Mn2+和Ni2+的存在［1］。CaN是保守蛋白,廣泛分布于真核生物中,從大鼠,小鼠,豬,蛙,魚和雞的腦勻漿中以及人和兔的非神經(jīng)組織中均檢出了CaN,在原生動物門的草履蟲中也有發(fā)現(xiàn)［2］。非神經(jīng)組織中的CaN含量僅為神經(jīng)組織中的162021610。免疫組織化學(xué)定位實(shí)驗(yàn)證明,CaN主要存在于突觸密度區(qū)和樹突密度區(qū),且酶量的變化與突觸形成有關(guān)。亞細(xì)胞定位研究表明，CaN在細(xì)胞漿和膜組分中的含量較高［3］。由此可見，CaN對腦的功能，尤其對突觸活動具有重要作用。CaN能催化多種SeroThr殘基已磷酸化的蛋白進(jìn)行脫磷酸化，并具有顯著的底物特異性，不同來源的CaN在底物特異性上并無差別。已知的CaN底物蛋白包括活化T細(xì)胞核因子(NFAT)、酪蛋白(casein)、組蛋白(histone)、魚精蛋白(protamine)、卵黃高磷蛋白(phosvitin)、依賴于cAMP的蛋白激酶2的調(diào)節(jié)亞基、MAP22、tau蛋白以及四種哺乳動物腦內(nèi)磷蛋白如DARRP232、G2底物、蛋白K2F和突觸素I(SynapsinI］此外，CaN還能作用于一些非蛋白類底物，主要是烯醇磷酸化合物，如PNPP、phosphotyrosine等。與蛋白類底物比較，在酶動力學(xué)上，它們與CaN反應(yīng)時均具有較高的Km和Vmax。1991年，Liu等［4］發(fā)現(xiàn)免疫抑制劑環(huán)抱菌素A(CyclosporinA,CsA)和FK506與其各自的胞內(nèi)受體Cyclophilin(CyP)和FK5062bind2ingprotein12(FKBP12)結(jié)合后，抑制細(xì)胞因子如IL22的表達(dá)，從而抑制T細(xì)胞分泌顆粒的胞吐作用。CyP和FKBP12具有異構(gòu)酶活性。在體外,CsA2CyP或FK5062FKBP12復(fù)合物在Ca2+存在下特異結(jié)合并抑制CaN酶活。通過對CsA和FK506類似物的研究表明，CaN磷酸酶活力的抑制與T細(xì)胞抑制具有極好的相關(guān)性，由此提示CaN是TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的一個關(guān)鍵酶。二、 活化T細(xì)胞核因子(NFAT)NFAT是T淋巴細(xì)胞受抗原刺激后產(chǎn)生細(xì)胞因子如IL22所需的轉(zhuǎn)錄因子，在免疫應(yīng)答期間細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著重要作用，其分子量約為120KD。在細(xì)胞核內(nèi)，它通過作用于一些細(xì)胞因子基因啟動子中的順式作用元件而調(diào)控細(xì)胞因子的基因表達(dá)。目前已報(bào)道的NFAT家族有4個成員，即NFAT1(NFATp),NFATc,NFAT3和NFAT4(NAFTxoNFATc3)。根據(jù)相似性程度,NFAT蛋白可分為3個結(jié)構(gòu)域。①長約400個氨基酸殘基的N端結(jié)構(gòu)域，它是由9個保守結(jié)構(gòu)基元(motif)的同源片段組成的、中等相似(23?35%相似)的序列，稱為NFAT同源區(qū)(NHR)[5],并包括3個保守SP框(SPBOX)的拷貝；②約300個氨基酸殘基的中央結(jié)構(gòu)域，它是NFAT中相似性最高(66?73%相似)的序列，與轉(zhuǎn)錄因子Rel家族的DNA結(jié)合區(qū)有微弱聯(lián)系，故被稱為Rel相似區(qū)(RSD)[6];③長約250?350個氨基酸殘基的C端結(jié)構(gòu)域，除一個存在于每一NFAT剪接突變體中的長約15個氨基酸的序列外，此區(qū)相似性最低。NFAT1的DNA結(jié)合能力依賴于其中央結(jié)構(gòu)域RSD。對NFATx的一個剪接突變體NFATx1的研究也得到類似結(jié)果，缺乏SRD突變體均不能結(jié)合DNA。NFAT的最大量表達(dá)至少需要2個信號即PKC激活和Ca2+濃度上升，而NFAT任一結(jié)構(gòu)域的缺失均降低其受PMA和Ca2+載體A23187誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活化能力，這說明在NFAT的N端和C端均存在完整轉(zhuǎn)錄活化所需的序列。但有趣的是，轉(zhuǎn)染缺失N端NFATx1的突變體pME2XAN時，僅PMA刺激即可導(dǎo)致明顯的NFAT活力(但只有PMA2A23187聯(lián)合刺激時的1.3),且該活力不受CsA的抑制。這說明NFATx1包含一個受Ca2+2CaN依賴性途徑調(diào)控的N端抑制區(qū)。這個受CaN調(diào)節(jié)N端抑制區(qū)被稱為CRI結(jié)構(gòu)域(calcineurin2regulatoryinhibitorydomain)。NAFT家族成員在T細(xì)胞發(fā)育的不同階段有不同的調(diào)節(jié)作用[7]。NFATx的mRNA在所有T細(xì)胞亞群中都有表達(dá)，而在雙陽性(CD4+CD8+)胸腺細(xì)胞中表達(dá)最高。相反,NFAT1的mRNA主要在成熟的CD4+的單陽性細(xì)胞中表達(dá)。NFATc的mRNA在所有T亞群中均很低，但沸波酯等可強(qiáng)烈誘導(dǎo)其表達(dá)。即PKC激活和Ca2+濃度上升，而NFAT任一結(jié)構(gòu)域的缺失均降低其受PMA和Ca2+載體A23187誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活化能力，這說明在NFAT的N端和C端均存在完整轉(zhuǎn)錄活化所需的序列。但有趣的是，轉(zhuǎn)染缺失N端NFATx1的突變體pME2X△N時，僅PMA刺激即可導(dǎo)致明顯的NFAT活力(但只有PMA2A23187聯(lián)合刺激時的103),且該活力不受CsA的抑制。這說明NFATx1包含一個受Ca2+2CaN依賴性途徑調(diào)控的N端抑制區(qū)。這個受CaN調(diào)節(jié)N端抑制區(qū)被稱為CRI結(jié)構(gòu)域(calcineurin2regulatoryinhibitorydomain)。NAFT家族成員在T細(xì)胞發(fā)育的不同階段有不同的調(diào)節(jié)作用[7]。NFATx的mRNA在所有T細(xì)胞亞群中都有表達(dá)，而在雙陽性(CD4+CD8+)胸腺細(xì)胞中表達(dá)最高。相反,NFAT1的mRNA主要在成熟的CD4+的單陽性細(xì)胞中表達(dá)。NFATc的mRNA在所有T亞群中均很低，但沸波酯等可強(qiáng)烈誘導(dǎo)其表達(dá)。三、CaN和NFAT在T細(xì)胞激活中的作用APC提供的抗原一MHC復(fù)合體與T細(xì)胞表面TCR蛋白結(jié)合代表著T細(xì)胞活化過程中的主信號。而APC膜分子B7與T細(xì)胞表面的CD28分子結(jié)合為T細(xì)胞活化所必需，稱為協(xié)同刺激信號。這些細(xì)胞一細(xì)胞間的相互作用相當(dāng)復(fù)雜,一方面包括大量的膜受體與其配體(或稱反受體,counter2receptor)相互作用;另一方面諸多自泌的或旁泌的細(xì)胞因子與其特異膜受體相互作用。主信號通過磷脂酰肌醇通路,首先活化磷脂酶C(PLC),PLC使4,5二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)斷裂成1,4,5三磷酸肌醇(IP3)和二酰肌甘油(DAG)。IP3引起鈣從鈣庫中釋放到細(xì)胞溶質(zhì)中，通過CaN和CaM活化NFAT、NFJB、AP21和0ct21等核因子，使IL2基因表達(dá)。DAG則通過活化PKC而激活上述的核因子。對于大部分T細(xì)胞而言,IL22都是自泌性生長因子,也是活化T細(xì)胞進(jìn)入增殖和分化階段的重要條件。T細(xì)胞的增長由IL22控制,IL22表達(dá)升高，則促進(jìn)T細(xì)胞活化。有證據(jù)表明,IL22的表達(dá)依賴于NFAT的表達(dá)，而NFAT的活化又與脫磷酸化有關(guān)。存在于胞漿中的NFAT亞基自身磷酸化，是CaN的作用底物，且CaN催化的脫磷酸化作用受CsA和FK506的抑制。1992年,0'Keefe等證明[8],在轉(zhuǎn)染CaN的細(xì)胞中，在PMA和Ca2+載體刺激下,IL22驅(qū)動的基因表達(dá)提高約2倍，而過表達(dá)組成型活躍的CaN突變體(去掉自抑制區(qū)和CaM結(jié)合區(qū))的細(xì)胞中,僅PMA存在即提高約150倍,這說明活躍的CaN可代替基因表達(dá)對Ca2+載體的需要。Clipstone等[9]也獲得類似的結(jié)果。由此可見,CaN的過表達(dá)產(chǎn)生對CsA和FK506的抵抗作用，同時提高NFAT和NFIL22A依賴性轉(zhuǎn)錄，提高了Ca2+和PKC刺激下T細(xì)胞的活化。CaN在此過程中起關(guān)鍵作用，即CaN是T細(xì)胞活化的關(guān)鍵酶。新近的研究證明［10］,Tp122激酶也可激活NFAT而誘導(dǎo)IL22表達(dá)，這種激活作用依賴于CaNoNFAT通路和MAPK(mitogen2activatedproteinkinase)通路。對NFAT4.x1［11］和NFAT1的研究發(fā)現(xiàn)，在SDS2PAGE中，此兩種NFAT的遷移變化與其N端結(jié)構(gòu)域有關(guān)，說明NFAT的N端可能是其(脫)磷酸化位點(diǎn)；而免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)也均發(fā)現(xiàn)N端NFAT結(jié)構(gòu)域是CaN靶位點(diǎn)。NFAT的CaN靶位點(diǎn)是一段短的保守序列，其中一個氨基酸殘基改變都會影響CaN介導(dǎo)的脫磷酸化和核轉(zhuǎn)位作用［12］。Lou等［13］發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞受刺激時，CaN結(jié)合N端NFAT1(1?415),NFAT1被磷酸化并隨之進(jìn)入細(xì)胞核；而對于NFATx1,CaN不僅結(jié)合其氨基端，且通過多個NFATxl停靠位點(diǎn)而結(jié)合。NFATxl中包含CaN活性靶的146?310區(qū)段的序列已被確定。此外，CaN與NFATx1氨基端結(jié)合，可使NFATx1的CRI特定氨基酸脫磷酸化，CRI的抑制活力喪失，從而活化NFATx1轉(zhuǎn)錄。CRI圖譜已在著手進(jìn)行，現(xiàn)已確定SP框前的約60對NFAT4ox1［11］和NFAT1的研究發(fā)現(xiàn)，在SDS2PAGE中，此兩種NFAT的遷移變化與其N端結(jié)構(gòu)域有關(guān)，說明NFAT的N端可能是其(脫)磷酸化位點(diǎn)；而免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)也均發(fā)現(xiàn)N端NFAT結(jié)構(gòu)域是CaN靶位點(diǎn)。NFAT的CaN靶位點(diǎn)是一段短的保守序列，其中一個氨基酸殘基改變都會影響CaN介導(dǎo)的脫磷酸化和核轉(zhuǎn)位作用［12］。Lou等［13］發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞受刺激時，CaN結(jié)合N端NFAT1(1-415),NFAT1被磷酸化并隨之進(jìn)入細(xì)胞核；而對于NFATx1,CaN不僅結(jié)合其氨基端，且通過多個NFATx丨?？课稽c(diǎn)而結(jié)合。NFATx丨中包含CaN活性靶的146?310區(qū)段的序列已被確定。此外，CaN與NFATx1氨基端結(jié)合，可使NFATx1的CRI特定氨基酸脫磷酸化，CRI的抑制活力喪失，從而活化NFATx1轉(zhuǎn)錄。CRI圖譜已在著手進(jìn)行，現(xiàn)已確定SP框前的約60個殘基。此區(qū)缺失時，對Ca2+傳遞的依賴性可部分被克服。NFAT1c也有類似情況［14］。NFAT1活化的早期事件包括其迅速脫磷酸化、與DNA上NFAT位點(diǎn)親和力增強(qiáng)及進(jìn)入核內(nèi)，這三個過程都與CaN有關(guān)，因?yàn)樗鼈兙鼙籆sA和FK506阻斷。CaN與NFAT4.x1的N末端結(jié)合并與之形成復(fù)合物轉(zhuǎn)移到核內(nèi),而入核運(yùn)輸必然發(fā)生在DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄活化之前。NFATx.4以依賴于CaN的方式轉(zhuǎn)移至核內(nèi)［13］。持續(xù)高濃度的Ca2+,而非瞬時的Ca2+脈沖對于維持NFAT停留在核內(nèi)是必須的。在核內(nèi),NFAT依賴于Ca2+,誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化和增殖所需的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄［15］°T細(xì)胞應(yīng)答被認(rèn)為是依賴于一個域值量TCR的活化［16］,此域值與Ca2+遷移持續(xù)時間有關(guān)。僅當(dāng)一特定域值的Ca2+持續(xù)運(yùn)動，結(jié)合并活化CaN,后者使NFAT的CRI功能喪失時,NFAT蛋白才與之應(yīng)答而參與此調(diào)控。此時,控制可遷移Ca2+的數(shù)量和持續(xù)時間可決定NFAT蛋白是否具有轉(zhuǎn)錄活化能力。個殘基。此區(qū)缺失時，對Ca2+傳遞的依賴性可部分被克服。NFAT1c也有類似情況［14］。NFAT1活化的早期事件包括其迅速脫磷酸化、與DNA上NFAT位點(diǎn)親和力增強(qiáng)及進(jìn)入核內(nèi)，這三個過程都與CaN有關(guān)，因?yàn)樗鼈兙鼙籆sA和FK506阻斷oCaN與NFAT4ox1的N末端結(jié)合并與之形成復(fù)合物轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，而入核運(yùn)輸必然發(fā)生在DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄活化之前。NFATxo4以依賴于CaN的方式轉(zhuǎn)移至核內(nèi)［13］。持續(xù)高濃度的Ca2+,而非瞬時的Ca2+脈沖對于維持NFAT停留在核內(nèi)是必須的。在核內(nèi),NFAT依賴于Ca2+,誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化和增殖所需的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄［15］。T細(xì)胞應(yīng)答被認(rèn)為是依賴