花生連作紅壤芽孢桿菌菌群的影響及微生態(tài)制劑的作用

花生連作紅壤芽孢桿菌菌群的影響及微生態(tài)制劑的作用

花生是中國(guó)南方低山和紅色地帶最重要的油資源和作物。有研究表明花生連作2年,可導(dǎo)致花生減產(chǎn)8%~10%;連作3年則減產(chǎn)25%~30%;連作4年以上可導(dǎo)致減產(chǎn)50%以上。長(zhǎng)期以來(lái)研究者從不同角度對(duì)作物連作的障礙原因進(jìn)行了分析,多數(shù)學(xué)者分析認(rèn)為連作后的土壤微生物區(qū)系變化是引起作物減產(chǎn)的重要原因。大量研究結(jié)果表明,隨著花生連作年限的增加,土壤真菌數(shù)量顯著增加,細(xì)菌和放線(xiàn)菌數(shù)量明顯減少。同時(shí)還有其他研究結(jié)果顯示,土壤微生物多樣性亦隨著連作年限的增加而降低。而芽孢桿菌(Bacillus)在土壤生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)著重要地位,現(xiàn)已證明在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥、衛(wèi)生、環(huán)保等領(lǐng)域都發(fā)揮著重要作用,尤其是作為生物菌劑在生物防治和促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值,目前已有許多關(guān)于芽孢桿菌作為生物菌劑的研究。本試驗(yàn)采用基于l6SrDNA的PCR-RFLP方法,對(duì)花生連作紅壤中可培養(yǎng)的芽孢桿菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行了研究,分析了花生連作對(duì)紅壤芽孢桿菌菌群的影響趨勢(shì),并將分離的芽孢桿菌作為生物防治菌劑施用于供試土壤,探究了微生態(tài)制劑對(duì)當(dāng)?shù)剡B作花生的產(chǎn)量及品質(zhì)影響,為推廣生物防治菌劑以解除當(dāng)?shù)鼗ㄉB作危害提供了研究參考。1材料和方法1.1固定時(shí)間mm研究區(qū)域位于江西省鷹潭市余江縣劉家站,該地區(qū)為中亞熱帶溫暖濕潤(rùn)的季風(fēng)氣候,年均溫17.8℃,年均降雨量1785mm,主要集中在4—6月。采集連續(xù)2年種植花生的土壤,共3個(gè)小區(qū),每個(gè)小區(qū)面積為1.1hm2(90m×120m)。按照五點(diǎn)采樣法采集相鄰5個(gè)地點(diǎn)的土壤樣品,采樣深度為0~15cm,混合、封裝帶回,重復(fù)3次。除去石塊和植物根系等雜物,4℃冰箱中保存。土壤理化性質(zhì)見(jiàn)表1(試驗(yàn)結(jié)果由中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所提供)。1.2pcr試劑限制性?xún)?nèi)切酶HhaI和XspI購(gòu)于大連寶生物工程有限公司,丙酰胺、過(guò)硫酸胺、四甲基已二胺均購(gòu)自上海生工生物公司,Taq酶等PCR試劑購(gòu)自上海申能博彩公司,16S通用引物由上海英駿生物公司合成。1.3測(cè)試方法1.3.1計(jì)算和分離芽桿菌1.3.2參考文獻(xiàn),通用引物16SrDNA的擴(kuò)增體系和方法見(jiàn)參考文獻(xiàn),通用引物參考文獻(xiàn)[20-21]。所得PCR產(chǎn)物通過(guò)0.75%的瓊脂糖電泳,EB染色后紫外分析儀檢測(cè)。1.3.3細(xì)菌種間分類(lèi)、分離限制性?xún)?nèi)切酶HhaI和XspI都是四堿基的酶,酶切位點(diǎn)豐富,可直接應(yīng)用于對(duì)某些細(xì)菌的種間分類(lèi)分析。酶切體系為:10×酶切緩沖液1μl,PCR產(chǎn)物2μl,HhaI酶或XspI酶0.5μl,無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)至10μl,37℃水浴過(guò)夜。1.3.4剝膠銀染的染色酶切產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分開(kāi),室溫條件下,恒流30mA,約3h分離。再剝膠銀染(包括染色、顯色兩個(gè)步驟),最后掃描儀掃描、保存圖片。每100ml8%的PAGE膠中各物質(zhì)含量分別為:52.7ml的水,20.0ml的5×TBE,0.7ml的10%APs,60μl的TEMED,26.6ml的30%丙烯酰胺。1.3.5同一基因型質(zhì)構(gòu)類(lèi)型以基因片段多態(tài)圖譜為基礎(chǔ)進(jìn)行聚類(lèi),根據(jù)不同圖像間的相似性將所有的圖譜聚合成一個(gè)聚類(lèi)樹(shù)。通過(guò)聚類(lèi)分析而被聚合到一起的具有相同基因圖譜的基因,被認(rèn)為是同一基因型。每一個(gè)基因型稱(chēng)為一個(gè)操作分類(lèi)單位(operationaltaxonomicunits,OTUs)或稱(chēng)為唯一基因型。多樣性指數(shù)計(jì)算的方法參考文獻(xiàn)進(jìn)行,16SrDNA克隆文庫(kù)的庫(kù)容(CoverageC)值的計(jì)算公式參見(jiàn)文獻(xiàn)。1.3.6srrna同源性比對(duì)3個(gè)土壤樣品的優(yōu)勢(shì)菌群由上海英駿生物公司完成測(cè)序工作,測(cè)出的16SrDNA基因序列在NCBI網(wǎng)站中比對(duì)同源性并提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),登錄號(hào)為:JF495459~JF495465。根據(jù)NCBI同源性比對(duì)的結(jié)果,從核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中下載同源性高的16SrDNA序列以及不同分類(lèi)來(lái)源的代表性16SrDNA序列,用BioEdit將序列轉(zhuǎn)換為FASTA格式。以上FASTA格式文件用ClustalX進(jìn)行多序列比對(duì)后,用MEGA進(jìn)行分析比對(duì),最后通過(guò)鄰接法(neighbor-joining)生成系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。1.4微生態(tài)制劑隨機(jī)選擇其中一個(gè)連作小區(qū)PCC2進(jìn)行生防試驗(yàn)?？莶菅挎邨U菌是目前研究報(bào)道較多的一類(lèi)芽孢桿菌,廣泛存在于土壤、湖泊、海洋和動(dòng)植物的體表,由于其無(wú)致病性,并可以分泌多種酶和抗生素,而且還具有良好的發(fā)酵基礎(chǔ),所以用途十分廣泛。而施用光合細(xì)菌作為微生物菌肥可以增加生物固氮作用,提高作物根際固氮效應(yīng),增進(jìn)土壤肥力。微生態(tài)制劑施肥方案為:處理1為芽孢桿菌;處理2為光合細(xì)菌;處理3為芽孢桿菌+光合細(xì)菌;處理4為滅菌后的制劑(LB液態(tài)培養(yǎng)基)。所有處理小區(qū)預(yù)先施入尿素0.75kg,鈣鎂磷肥1.46kg,有機(jī)肥5.4kg作為基肥。微生態(tài)制劑為液體菌劑,菌劑總密度為1010cell/ml,分別于苗期和花期噴施花生,每次施用量75L/hm2。其中枯草芽孢桿菌分離來(lái)自于原連作花生土壤;光合細(xì)菌是購(gòu)買(mǎi)的菌劑粉末(江蘇綠科生物技術(shù)有限公司)。花生供試品種為江西省鷹潭市常規(guī)品種贛花5號(hào)。微生物制劑小區(qū)設(shè)計(jì):試驗(yàn)小區(qū)共設(shè)置16個(gè),分別為4個(gè)處理4個(gè)重復(fù),隨機(jī)排列。每個(gè)小區(qū)面積35m2(5m×7m),并設(shè)置保護(hù)行,小區(qū)與小區(qū)之間分割溝的寬度為40~50cm。九月初花生收獲后分別測(cè)定其產(chǎn)量、株高、根長(zhǎng)、飽果率、百果重,每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)均要測(cè)量。整理并處理相關(guān)數(shù)據(jù)。2結(jié)果2.1芽孢桿菌數(shù)量從圖1可以看出,該地區(qū)連作土壤中的芽孢桿菌數(shù)量為2.0×105~2.3×105cfu/g干土,平均值為2.1×105cfu/g干土。2.2pcr產(chǎn)物的鑒定直接以菌體為模板擴(kuò)增的16SrDNA基因片段約為1500bp,PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶HhaI及XspI酶切,酶切產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳后得到的圖譜如圖2。2.3土壤芽孢桿菌群落結(jié)構(gòu)從3種土壤樣品中共隨機(jī)挑選了147株單菌落,采用HhaI和XspI聯(lián)合酶切,經(jīng)過(guò)歸類(lèi),共得到了9個(gè)OTUs,分別以大寫(xiě)的英文字母命名(A~J)。每個(gè)文庫(kù)的類(lèi)型和所占比例如圖3所示。從圖3明顯可以看出:A為3種樣品均有相同的優(yōu)勢(shì)OTUs,在3個(gè)連作土樣的比例都占到50%左右,類(lèi)型B、C也是所有土樣中的數(shù)量較大的菌群,即為所有土樣中的優(yōu)勢(shì)或次優(yōu)勢(shì)菌群。D、E兩種類(lèi)型未能從PCC2土樣中檢測(cè)到,類(lèi)型H沒(méi)有從PCC1土樣中檢測(cè)到,F和G只出現(xiàn)了某一種土樣中,為單一克隆。從表2可以看出:3個(gè)文庫(kù)的庫(kù)容值都較高,均超過(guò)95%,表明所建立的基因文庫(kù)能夠比較完整地反映土壤芽孢桿菌群落結(jié)構(gòu)。各類(lèi)多樣性指數(shù)數(shù)值顯示3個(gè)土壤樣品的多樣性相似度較高?？傮w而言,供試連作土壤樣品的多樣性指數(shù)為PCC1>PCC3>PCC2。從均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)來(lái)看,文庫(kù)的均勻程度都較高,其中樣品2的均勻度最高。說(shuō)明3個(gè)土壤樣品中的芽孢桿菌群落很好地適應(yīng)了當(dāng)?shù)氐耐寥拉h(huán)境,沒(méi)有受到其他條件的作用使其發(fā)生單一化。2.4重組菌群分析選擇7種OTUs進(jìn)行測(cè)序,這7種OTUs的數(shù)量與其來(lái)源培養(yǎng)平板的酶切菌落數(shù)量比例>5%以上,被定義為優(yōu)勢(shì)菌群。7種OTUs所代表的菌經(jīng)16SrDNA擴(kuò)增、純化、轉(zhuǎn)化后的克隆被送上海英駿生物公司完成測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),獲得相應(yīng)的登錄號(hào),分別是JF495459~JF495465,利用Mega4.0生物軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)。從圖4可以看出,這些優(yōu)勢(shì)菌群分別是短小芽孢桿菌(B.pumilus)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、高地芽孢桿菌(B.altitudinis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、臘質(zhì)芽孢桿菌(B.cereus)及類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillussp.)。其中短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、高地芽孢桿菌在3種土樣的檢出率均很高,短小芽孢桿菌是所有土樣的主要類(lèi)型,均占50%以上,且數(shù)量相差不大。PCC2的枯草芽孢桿菌檢出率明顯低于其他2種土樣,而高地芽孢桿菌的數(shù)量是其他2種土樣的兩倍,這兩類(lèi)芽孢桿菌也是所有土壤樣品的重要類(lèi)型。解淀粉芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌未從PCC2中檢出;臘質(zhì)芽孢桿菌存在于PCC2和PCC3中,數(shù)量很少;類(lèi)芽孢桿菌屬的這類(lèi)菌在PCC2土樣中占10%,但其他兩個(gè)土樣并未檢測(cè)到。2.5微生物菌劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響表3的結(jié)果顯示,施用光合細(xì)菌和枯草芽孢桿菌能夠在一定程度上提高花生的產(chǎn)量,與對(duì)照(處理4)相比,分別提高了18.58%、10.34%、32.14%,增長(zhǎng)效果是兩種菌劑混施>施用芽孢桿菌>施用光合細(xì)菌,但各處理間差異不顯著。施用微生物菌劑對(duì)株高也有一定的促進(jìn)作用,分別依順序比對(duì)照高出0.57cm、1.86cm、0.17cm。光合細(xì)菌和芽孢桿菌混施還對(duì)花生的飽果率有一定的提高作用,比對(duì)照提高了3.1%。3芽孢桿菌在不同地理位置花生土壤中的分布情況本研究對(duì)鷹潭地區(qū)花生連作紅壤的芽孢桿菌種群與多樣性進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)連作土壤的芽孢桿菌數(shù)量較豐富,范圍在2.0×105~2.3×105cfu/g干土,平均值為2.1×105cfu/g干土?？倲?shù)量與Garbeva等報(bào)道的相近,但比唐志燕等報(bào)道的研究低。龔國(guó)淑采用“直接法-麥芽汁”分離芽孢桿菌得到21個(gè)種,本研究的分型結(jié)果顯示3種土樣的總體種類(lèi)并不多,147株單菌株歸屬于9個(gè)種,且有3個(gè)OUTs只出現(xiàn)在某一種土壤樣品中。目前還未發(fā)現(xiàn)一種能真正測(cè)定土壤中芽孢桿菌的實(shí)際數(shù)量和類(lèi)群的有效方法,分子生物學(xué)方法結(jié)合常規(guī)分離法雖然簡(jiǎn)便快捷,但獲得芽孢桿菌種群數(shù)量有限,不利于全面反映該地區(qū)的實(shí)際情況,不過(guò)可以反映芽孢桿菌在微生物群體中的相對(duì)比例。張華勇等分析了不同生態(tài)下紅壤中的芽孢桿菌,發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌、蠟質(zhì)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌在林地、旱地、水田中比較常見(jiàn),沒(méi)有報(bào)道其數(shù)量狀況。但不同土壤類(lèi)型、水熱條件下的微生物種群差異較大。而劉國(guó)紅在調(diào)查我國(guó)15個(gè)省15份土樣中芽孢桿菌情況時(shí)發(fā)現(xiàn),江西鷹潭貴溪的林地中優(yōu)勢(shì)種群為蠟狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌,常見(jiàn)種群為簡(jiǎn)單芽孢桿菌、短小芽孢桿菌。本研究的數(shù)據(jù)表明實(shí)驗(yàn)地域連作花生土壤中的3種主要的優(yōu)勢(shì)芽孢桿菌類(lèi)型為短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和高地芽孢桿菌,常見(jiàn)類(lèi)型為蠟狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌,一定程度上印證和補(bǔ)充了張華勇等和劉國(guó)紅的研究結(jié)論。采用微生物制劑解除作物連作障礙的研究是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一,有研究表明枯草芽孢桿菌在芽孢形成初期分泌各種抗菌物質(zhì),對(duì)病原真菌有特異性的防治作用,從而能有效地防治植物病蟲(chóng)害;同時(shí)用芽孢桿菌制成的生物菌劑克服了傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥污染環(huán)境、危害人畜、易產(chǎn)生抗性等缺點(diǎn),具有選擇性強(qiáng)、安全、原料簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。早在1879年,拜耳前身公司生產(chǎn)的一種菌肥,使用的就是枯草芽孢桿菌。光合細(xì)菌由于其自身富含的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì),以及可以進(jìn)行光合作用、有氧呼吸、發(fā)酵及固氮、固碳