五子衍宗湯對(duì)環(huán)磷酰胺致小鼠生精障礙的保護(hù)作用

五子衍宗湯對(duì)環(huán)磷酰胺致小鼠生精障礙的保護(hù)作用

五子衍宗湯由枸杞、兔蠶絲、五味子、覆盆子和香蕉籽組成。具有補(bǔ)腎益精、補(bǔ)精補(bǔ)髓的功效。主要用于腎衰竭、陽(yáng)痿、早泄和長(zhǎng)期不育。它通常用于治療男性不育。然而，五子衍宗湯是否對(duì)抗旱藥物引起的生精障礙的藥理作用尚不清楚。1材料和方法1.1樣品的提取五子衍宗湯由枸杞子、菟絲子、覆盆子、車前子、五味子組成,全部生藥經(jīng)三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院汪鋆植教授鑒定為正品。按照傳統(tǒng)方法煎藥,濃縮至粉末,提取率為18.8%,臨用前配成相應(yīng)濃度的溶液;注射用環(huán)磷酰胺,規(guī)格為0.2g,批號(hào)08121021,江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及生產(chǎn)許可證BalB/c種雄性小鼠,SPF級(jí),8~9周齡,22g~25g,湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(鄂)2008-0005。1.3酚紅素f-1.3.4%的酚紅Bouins液:苦味酸飽和水溶液750mL,甲醛250mL,冰醋酸50mL。精子營(yíng)養(yǎng)液:BWW(NaCl0.554g/L、KCl0.0356g/L、CaCl20.025g/L、KH2PO40.0162g/L、MgSO4·7H2O0.0294g/L、NaHCO30.210g/L、NaPyr0.003g/L、Nalac0.370g/L、Glucose0.100g/L、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的酚紅1.0mL、青霉素10000U、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的BSA。其余藥品均為分析純。1.4多功能顯微及圖像分析系統(tǒng)SQIAS-2000彩色精液質(zhì)量圖文分析儀,武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司;DMR型多功能顯微鏡及圖像分析系統(tǒng),德國(guó)Leica公司;H-7500型透射式電子顯微鏡,德國(guó)Leica公司;ULTRACUTR型超薄切片機(jī),奧地利萊卡公司;JA2003型電子分析天平,上海天平儀器廠。1.5方法1.5.1連續(xù)注射環(huán)磷酰胺水解反應(yīng)32只BalB/c雄性小鼠,隨機(jī)分為4組,依次為空白對(duì)照組、模型組、五子衍宗湯低劑量組、五子衍宗湯高劑量組。除空白對(duì)照組外,其余小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg,連續(xù)注射7d,空白對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。空白對(duì)照組和模型組每天灌服1%羧甲基纖維素鈉0.2ml,五子衍宗湯低劑量組給予五子衍宗湯2g/kg,五子衍宗湯高劑量組給予五子衍宗湯4g/kg,各組小鼠連續(xù)給藥35d。1.5.2大鼠生殖器官的重量測(cè)量1.5.3精子濃度的測(cè)定將盛有6ml精子營(yíng)養(yǎng)液的試管置于恒溫水浴箱預(yù)熱至37℃,取單側(cè)附睪去除脂肪,剪碎放入試管中搖勻,37℃保溫10min~15min,使精子充分游離,接著取1滴滴入牛鮑氏血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上,計(jì)算每毫升精子數(shù)。用微量移液器吸取10μl精子懸液,利用SQIAS-2000彩色精液質(zhì)量圖文分析儀進(jìn)行精子活率測(cè)定。1.5.4獨(dú)立液液的制備取單側(cè)睪丸去除包膜、剪碎,置于3mlpH7.4的PBS試管中,于漩渦震蕩混合器上混合3min,組織細(xì)胞液用200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾于試管內(nèi),1500r/min離心5min,棄上清將沉淀懸浮后加3mlPBS,混勻1min,同樣條件重復(fù)洗滌2次,制成單細(xì)胞懸液。PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至106~107個(gè)/ml4℃、70%乙醇固定2h后,低速短時(shí)離心去除固定液,PBS洗2遍,加40μg/ml的RNA酶400μl,于37℃水浴30min,加入100μlPI染液混勻,4℃避光染色30min即可上機(jī)進(jìn)行檢測(cè),計(jì)算出不同倍體細(xì)胞的百分比。1.5.5睪丸組織內(nèi)精原細(xì)胞與各級(jí)生精細(xì)胞的分布取單側(cè)睪丸石臘切片,HE染色,光鏡觀察睪丸組織內(nèi)精原細(xì)胞與各級(jí)生精細(xì)胞的分布情況。環(huán)氧樹(shù)脂包埋,做超微切片,電鏡觀察睪丸組織內(nèi)曲細(xì)精管及各級(jí)生精細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。1.5.6統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0軟件處理,實(shí)驗(yàn)各個(gè)指標(biāo)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,各組均數(shù)之間比較進(jìn)行one-wayANOVA檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1五子衍宗湯對(duì)大鼠睪丸和附件的影響表1顯示,模型組小鼠睪丸重量和附睪重量顯著低于空白對(duì)照組,五子衍宗湯低、高劑量均可增加小鼠的睪丸及附睪重,但無(wú)顯著性差異。2.2水平空白對(duì)照組表2顯示,模型組小鼠精子密度、精子活率顯著低于空白對(duì)照組。五子衍宗湯低、高劑量均可顯著增加生精障礙小鼠的精子密度。五子衍宗湯低、高劑量對(duì)生精障礙小鼠的精子活率也有一定的提升作用。2.3細(xì)胞配比表3顯示,模型組小鼠1C和4C細(xì)胞百分比顯著下降,2C細(xì)胞百分比相對(duì)升高。五子衍宗湯低、高劑量均可顯著增性恢復(fù)生精障礙小鼠各級(jí)生精細(xì)胞的百分比。2.4睪丸生精管間隙的測(cè)定光鏡可見(jiàn),模型組小鼠睪丸內(nèi)生精小管多退化、萎縮,管壁生精上皮變薄,生精細(xì)胞層數(shù)減少,排列紊亂,精子細(xì)胞較少,腔內(nèi)精子少見(jiàn),睪丸生精小管間隙明顯增大。五子衍宗湯組小鼠睪丸內(nèi)大部分生精小管的各級(jí)生精上皮細(xì)胞層次較明顯,排列較規(guī)則,管腔內(nèi)可見(jiàn)較多成熟精子生成,基本達(dá)到正常的睪丸組織形態(tài)(結(jié)果見(jiàn)圖1)。2.5生精細(xì)胞凋亡電鏡下可見(jiàn),模型組小鼠睪丸生精細(xì)胞較少,并可見(jiàn)明顯的生精細(xì)胞凋亡;治療組睪丸超微結(jié)構(gòu)明顯恢復(fù),五子衍宗湯組可見(jiàn)生精上皮變厚,見(jiàn)正常形態(tài)的精原細(xì)胞、精母細(xì)胞且生精上皮的中部有爆發(fā)產(chǎn)出的大量精子(結(jié)果見(jiàn)圖2)。3子衍宗湯對(duì)環(huán)磷酰胺致生精障礙的保護(hù)作用環(huán)磷酰胺是一種臨床常見(jiàn)的抗腫瘤藥物,其機(jī)制主要是通過(guò)對(duì)DNA的烷化作用而干擾細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)功能。近代研究表明,環(huán)磷酰胺具有明顯的生殖毒性,對(duì)睪丸有明顯的損傷作用,導(dǎo)致無(wú)精子癥或少精子癥,造成不育。通過(guò)臨床研究發(fā)現(xiàn),在兒童期因白血病、實(shí)體腫瘤、自身免疫性疾病接受環(huán)烷化劑環(huán)磷酰胺治療的男性患兒,成年后80.2%~92.6%為無(wú)精子癥或少精子癥,可導(dǎo)致不育或者出現(xiàn)子代遺傳性缺陷或畸形。中醫(yī)藥對(duì)生精障礙有較好的治療效果,但對(duì)環(huán)磷酰胺所致生精障礙的治療仍缺乏深入的研究。五子衍宗湯為臨床治療男性不育的常用方劑,本實(shí)驗(yàn)探討了五子衍宗湯對(duì)環(huán)磷酰胺致小鼠睪丸功能損害及生精障礙的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn),在環(huán)磷酰胺致生精障礙小鼠模型中,小鼠睪丸重量、附睪重量、精子密度、精子活率等顯著下降,生精小管退化萎縮,生精上皮層次減少,細(xì)胞排列紊亂,初級(jí)精母細(xì)胞(4C細(xì)胞)與精子細(xì)胞和精子(1C細(xì)胞)比例顯著減少。五子衍宗湯能夠拮抗環(huán)磷酰胺的生殖毒性,提高睪丸和附睪重量;顯著增加生精障礙小鼠的精子密度及精子的活率;修復(fù)睪丸生精小管生精上皮損傷,使生精小管結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常;促進(jìn)精原細(xì)胞向初級(jí)精母細(xì)胞轉(zhuǎn)化,恢復(fù)各級(jí)生精細(xì)胞的比例。睪丸是精子的生成場(chǎng)所,附睪則對(duì)精子的成熟起重要作用。研究結(jié)果提示,