實驗室檢測常用技術(shù)

張雅為遼寧省疫控中心2010年11月實驗室檢測常用技術(shù)《國家動物疫情測報體系管理規(guī)范》

豬：口蹄疫、豬水泡病、豬瘟、偽狂犬病、豬呼吸與繁殖障礙綜合征牛：口蹄疫、結(jié)核、布氏桿菌病、瘋牛病羊：口蹄疫、布氏桿菌病、山羊/綿羊痘、癢病馬屬動物：馬傳貧、馬鼻疽雞：新城疫、禽流感鴨、鵝：禽流感內(nèi)容血清學(xué)檢測：血凝抑制試驗?zāi)囼炑a(bǔ)體結(jié)合試驗皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)聯(lián)免疫吸附試驗病原學(xué)檢測：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)基本概念抗原：抗原是指那些能夠誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體和致敏效應(yīng)淋巴細(xì)胞，并在體內(nèi)外與之特異性結(jié)合，發(fā)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)。抗體：是能與相應(yīng)的抗原特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)分子，和機(jī)體其他生物大分子一樣是細(xì)胞的產(chǎn)物，分泌到體液中或表現(xiàn)在細(xì)胞表面上。抗原、抗體反應(yīng)：抗原和抗體在體外的反應(yīng)亦稱血清學(xué)反應(yīng)。血凝及血凝抑制試驗試驗原理某些病毒或病毒的血凝素，能選擇性的使某種或某幾種動物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象稱為血凝（hemagglutination，HA），也稱直接血凝反應(yīng)。當(dāng)病毒的懸液中先加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆粒或其血凝素時，則紅細(xì)胞表面的受體就不能與病毒顆?；蚱溲刂苯咏佑|。這時紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象就被抑制，稱為紅細(xì)胞凝集抑制（hemagglutinationingibition，HI）反應(yīng)，也稱血凝抑制反應(yīng)。試驗原理（續(xù)）血凝抑制試驗可以用于：①應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)病毒懸液測定血清中的相應(yīng)抗體；②應(yīng)用特異性抗體鑒定新分離的病毒。測定動物血清中的血凝抑制抗體，必須首先：①滴定病毒或其血凝素對相應(yīng)紅細(xì)胞的血凝效價；②應(yīng)用某種或某幾種方法處理被檢血清，除去其中的非特異性血凝抑制物質(zhì)。實驗準(zhǔn)備血凝板

0.5%-1%的紅細(xì)胞懸液

100ul微量移液器

PBS或生理鹽水

待檢病毒液或檢測抗原

待檢血清及陽性血清血凝實驗步驟注：第12孔為陰性對照。振蕩混勻，于室溫（20℃-25℃

）放置40分鐘后判定結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4℃環(huán)境下）。對照孔紅細(xì)胞將呈明顯的紐扣狀沉到孔底?？乖╱l）結(jié)果判定將板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無成淚滴狀流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀釋倍數(shù)代表一個血凝單位（HAU）。四單位抗原配置根據(jù)血凝試驗結(jié)果配置4HAU抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點，終點稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU抗原的稀釋倍數(shù)。如血凝終點滴度為1：256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1：64（256/4）。四單位抗原配置四單位抗原回滴4單位抗原(μl)血凝抑制試驗步驟

注：第11孔為陽性對照，第12孔為陰性對照。輕輕混勻，靜置約40分鐘。結(jié)果判定以完全抑制4個HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。只有陰性對照孔血清滴度不大于2log2，陽性對照孔血清誤差不超過1個滴度，實驗結(jié)果才有效。HI價小于等于3log2判定HI試驗陰性；HI價等于4log2為可疑，需重復(fù)試驗；HI價大于等于5log2為陽性。（GB/T18936-2003）凝集實驗概述細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原，或吸附在膠乳、白陶土、離子交換樹脂和紅細(xì)胞的抗原，與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適當(dāng)電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時間，形成肉眼可見的凝集團(tuán)塊，稱為凝集試驗（agglutination）。凝集試驗可用于檢測抗原或抗體，最突出的優(yōu)點是操作簡便。凝集試驗可根據(jù)抗原的性質(zhì)、反應(yīng)的方式分為直接凝集試驗（簡稱凝集試驗）和間接凝集試驗。直接凝集試驗顆粒性抗原與凝集素直接結(jié)合并出現(xiàn)凝集現(xiàn)象的試驗稱作直接凝集試驗（directagglutinationtest）。直接凝集試驗按操作方法可分為玻片法和試管法。玻片法玻片法為定性試驗。此法簡便快速，可用已知診斷抗原懸液檢測待檢血清是否存在相應(yīng)抗體。玻片法試驗準(zhǔn)備：抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰性血清受檢血清應(yīng)新鮮，無明顯蛋白凝塊，無溶血、無腐敗氣味潔凈的玻璃板，其上劃分成4cm2的方格吸管或分裝器，適于滴加0.03mL牙簽或火柴桿，供攪拌用玻片法操作方法：將玻璃板上各格標(biāo)記受檢血清號，然后加相應(yīng)血清0.03ml在受檢血清旁滴加抗原0.03ml用牙簽類小棒攪動血清和抗原使之混合每次試驗應(yīng)設(shè)陰、陽性血清對照玻片法判定：在陰、陽性血清對照成立的條件下，方可對被檢血清進(jìn)行判定。受檢血清在4min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象者判為陽性（+），無凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色者判為陰性（-）。（GB/T18646-2002）試管法材料準(zhǔn)備：稀釋液：0.5%石碳酸生理鹽水。檢驗羊血清時用含0.5%石碳酸的10%鹽溶液，如果血清稀釋用含0.5%石碳酸的10%鹽溶液，抗原的稀釋也用含0.5%石碳酸的10%鹽溶液抗原、陽性血清和陰性血清凝集試驗管（三分管）、試管架、吸管及溫箱試管法置37℃～40℃溫箱24h，取出檢查并記錄結(jié)果。試管法每次試驗均應(yīng)設(shè)陽性血清、陰性血清和抗原對照。牛、馬、鹿、駱駝血清稀釋法與上述基本一致，差異是第一管加1.2ml稀釋液和0.05ml被檢血清。大規(guī)模檢疫時也可只用2個稀釋度，即牛、馬、鹿、駱駝用1:50和1:100，豬、山羊、綿羊和狗用1:25和1:50。試管法結(jié)果判定參照比濁管，按各試管上層液體清亮度判讀1）++++菌體完全凝集，100%下沉，上層液體100%清亮；2）+++菌體幾乎完全凝集，上層液體75%清亮；3）++菌體凝集顯著，液體50%清亮；4）+凝集物有沉淀，液體25%清亮；5）-凝集物無沉淀，液體均勻渾濁。試管法結(jié)果判定牛、馬、鹿、駱駝1:100血清稀釋，豬、山羊、綿羊和狗1:50血清稀釋，出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象時，受檢血清判定為陽性。牛、馬、鹿、駱駝1:50血清稀釋，豬、山羊、綿羊和狗1:25血清稀釋，出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象時，受檢血清判定為可疑。（GB/T18646-2002）補(bǔ)體結(jié)合試驗概念補(bǔ)體（complement）是存在于正常動物血清中，具有類似酶活性的一組蛋白質(zhì)，具有潛在的免疫活性，激活后能表現(xiàn)出一系列的免疫學(xué)活性，能協(xié)同其他免疫物質(zhì)直接殺傷靶細(xì)胞和加強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。正常情況下，補(bǔ)體成分以無活性的酶原形式存在，只有在激活物（如抗原抗體復(fù)合物）的作用下，補(bǔ)體各成分才依次被活化。實驗原理CFT是根據(jù)任何抗原抗體復(fù)合物可激活、固定補(bǔ)體的特性，用一定量的補(bǔ)體與致敏紅細(xì)胞來檢測抗原、抗體間有無特異性結(jié)合的一類實驗。先加入反應(yīng)系統(tǒng)和補(bǔ)體，給其以優(yōu)先結(jié)合補(bǔ)體的機(jī)會，如果反應(yīng)系統(tǒng)中存在待測的抗體（或抗原），則抗原、抗體發(fā)生反應(yīng)后可結(jié)合補(bǔ)體，再加入指示系統(tǒng)（SRBL與相應(yīng)溶血素），由于反應(yīng)中無游離的補(bǔ)體而不出現(xiàn)溶血，為補(bǔ)體結(jié)合試驗陽性。如待測系統(tǒng)中不存在待檢的抗體或（抗原），則在液體中仍有游離的補(bǔ)體存在，當(dāng)加入指示劑時會出現(xiàn)溶血，為補(bǔ)體結(jié)合試驗陰性。實驗準(zhǔn)備稀釋液：0.85%生理鹽水綿羊紅細(xì)胞懸液：采成年公綿羊血，用稀釋液洗滌3-4次，最后一次以2000r/min離心10min，以稀釋液配置成2.5%紅細(xì)胞懸液抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰性血清、溶血素受檢血清：用稀釋液作1:10稀釋，加熱滅能溶血素補(bǔ)體抗原操作過程血清被檢血清對照管陽性血清陰性血清抗原溶血素補(bǔ)體血清加入量0.50.50.50.50.50.5000稀釋液00.500.500.501.51.5抗原0.500.500.50100工作量補(bǔ)體0.50.50.50.50.50.50.500.537℃～38℃水浴20min二單位溶血素0.50.50.50.50.50.50.50.502.5%紅細(xì)胞0.50.50.50.50.50.50.50.50.537℃～38℃水浴20min判定結(jié)果舉例＋＋＋＋－＋＋＋＋－－－－＋＋＋＋＋＋＋＋結(jié)果判定第一次判定要求不加抗原的，不加或加抗原的陰性血清對照管，抗原對照管呈完全溶血反應(yīng)。初判后靜置12h作第二次判定，要求溶血素對照管，補(bǔ)體對照管呈完全抑制溶血。對照正確即可對受檢血清進(jìn)行判定，受檢血清加抗原管的判定參照標(biāo)準(zhǔn)比色管記錄結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)

0～40%溶血判為陽性反應(yīng)50%～90%溶血判為可疑反應(yīng)100%溶血判為陰性反應(yīng)（GB/T18646-2002）皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗實驗原理機(jī)體受到某種抗原刺激時，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞活化、增殖分化成致敏淋巴細(xì)胞，使機(jī)體致敏，以后如再次接觸相同的抗原，致敏淋巴細(xì)胞即釋放出各種淋巴因子，一方面使機(jī)體表現(xiàn)特異性的細(xì)胞免疫，另一方面則發(fā)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。結(jié)核分支桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)實驗操作注射部位及術(shù)前處理：將牛只編號后在頸側(cè)中部上三分之一處剪毛，直徑約10cm。用卡尺測量術(shù)部中央皮皺厚度，做好記錄。注射劑量：不論大小牛只，一律皮內(nèi)注射0.1ml(含2000IU)。注射方法：先以75%酒精消毒，然后皮內(nèi)注射牛型結(jié)合分支菌素PPD，注射后局部應(yīng)出現(xiàn)小皰，如對注射有疑問，應(yīng)另選15cm以外的部位或?qū)?cè)重做。皮內(nèi)注射后72h判定，仔細(xì)觀察局部有無熱痛、腫脹等炎性反應(yīng)，并以卡尺測量皮皺厚度，做好詳細(xì)記錄。對陰性牛和疑似反應(yīng)牛，于注射后96h和120h分別再觀察一次。結(jié)果判定陽性反應(yīng)：局部有明顯的炎性反應(yīng)，皮厚差大于或等于4.0mm。疑似反應(yīng)：局部炎性反應(yīng)不明顯，皮厚差大于或等于2.0mm，小于4.0mm。陰性反應(yīng)：無炎性反應(yīng)，皮厚差在2.0mm以下。凡判定為疑似反應(yīng)的牛只，于第一次檢疫60d后進(jìn)行復(fù)檢，其結(jié)果仍為疑似反應(yīng)時，經(jīng)60d再復(fù)檢，如仍為疑似反應(yīng)，應(yīng)判為陽性。（GB/T18645-2002）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）概述酶具有高效生物催化作用，一個酶分子在數(shù)分鐘內(nèi)可以催化幾十、幾百個底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生放大作用，使得原來極其微乎其微的抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識別出來，這種技術(shù)被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗法（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA）。本法自上世紀(jì)70年代初期由Vanweemen、Schuars及Perlmarn等相繼分別報道后，現(xiàn)已引起廣泛重視。原理將已知抗體或抗原結(jié)合在某種固相載體上，并保持其免疫活性。測定時將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)抗原按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離物成分，然后加入底物顯色，進(jìn)行定性或定量測定。ELISA可用于檢測抗體，也可用于檢測抗原。實驗的方法類型有多種，如雙抗體夾心法、間接法、競爭法和捕獲法等，雖然原理不盡相同，但實驗特點和影響因素基本一樣。酶抗抗體酶標(biāo)記抗抗體抗體抗原固相載體1.將抗原包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標(biāo)記抗抗體，則結(jié)合為抗原-抗體-酶標(biāo)記抗抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。間接法（抗-HCV等）示意圖雙抗體夾心法（HBsAg、HBeAg等）示