基因工程原理-第二章 DNA重組

基因工程原理PrincipleofGeneEngineering

第一章第一節(jié)基因工程原理第二章第二章DNA重組第一部分DNA的組成和結(jié)構(gòu)1.1DNA的組成1.2DNA的空間結(jié)構(gòu)線形DNA：環(huán)形DNA：1.3DNA復(fù)制半保留復(fù)制方式復(fù)制起始位點(diǎn)（replicationoriginsite）/Article/ShowArticle.asp?ArticleID=20877

原核生物DNA的復(fù)制解旋酶單鏈結(jié)合蛋白DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶DNA聚合酶DNA連接酶/Article/ShowArticle.asp?ArticleID=20876

真核生物DNA的復(fù)制復(fù)制子從復(fù)制起始點(diǎn)開始復(fù)制出的一個(gè)DNA分子或一個(gè)DNA片段的核苷酸序列。復(fù)制子的數(shù)量原核生物的染色體DNA：單個(gè)真核生物染色體DNA：多個(gè)質(zhì)粒DNA：單個(gè)、多個(gè)1.4DNA轉(zhuǎn)錄啟動子和轉(zhuǎn)錄區(qū)的結(jié)構(gòu)啟動子：Promotor，DNA分子上能與RNA聚合酶結(jié)合并形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體的區(qū)域，在許多情況下，還包括促進(jìn)這一過程的調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。Pribnowbox5’-AGGAGG-3’SD序列Shine-Dalgarnosequence;SDsequence1974年，由J.Shine和L.Dalgarno發(fā)現(xiàn)SD序列：在細(xì)菌mRNA起始密碼子AUG上游10個(gè)堿基左右處，有一段富含嘌呤的堿基序列，能與細(xì)菌16SrRNA3’端識別，幫助從起始AUG處開始翻譯。Pribnowbox5’-AGGAGG-3’SD序列1.5DNA轉(zhuǎn)錄終止子（transcriptionterminator）終止子（Terminator）是一段位于基因或操縱組末端的DNA片段，可中斷轉(zhuǎn)錄作用。原核生物擁有兩種類型的終止子，包括：本體轉(zhuǎn)錄終止子（Intrinsictranscriptionterminators）：ρ-依賴轉(zhuǎn)錄終止子（Rho-dependenttranscriptionterminators：——不依賴于蛋白質(zhì)輔因子就能實(shí)現(xiàn)終止作用?！蕾嚨鞍纵o因子才能實(shí)現(xiàn)終止作用。這種蛋白質(zhì)輔因子稱為釋放因子，通常又稱ρ因子，與RNA螺旋酶蛋白復(fù)合物。兩類終止子有共同的序列特征：在轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)前有一段回文序列。富含GC回文序列：雙鏈DNA中含有的兩個(gè)結(jié)構(gòu)相同、方向相反的序列稱為反向重復(fù)序列，當(dāng)該序列的雙鏈被打開后，可形成局部“十”字形結(jié)構(gòu)。這段序列被稱為回文序列。1.6天然DNA的來源和用途染色體DNA：分離目的基因的主要材料，1000～106kb病毒DNA：用于構(gòu)建基因克隆載體,T4、λ…質(zhì)粒DNA：用于構(gòu)建基因克隆載體線粒體DNA：呼吸作用的基因葉綠體DNA：光合作用的基因——存在與生物體內(nèi)的DNA（1）大腸桿菌源質(zhì)粒DNA的提?。?）λ噬菌體DNA的提取（3）氯化銫法制備植物基因組DNA1.7天然DNA的的提取

合適的生物材料——裂解細(xì)胞——分離DNA——純化核檢測（1）大腸桿菌源質(zhì)粒DNA的提取松弛型質(zhì)粒：加氯霉素嚴(yán)緊型質(zhì)粒：不加氯霉素（2）λ噬菌體DNA的提取1.8DNA的純化氯化銫-溴化乙錠連續(xù)梯度離心法離子交換層析法瓊脂糖凝膠電泳洗脫法“基因純”試劑純化從DNA樣品中去掉EB2.2.4DNA濃縮2.2.5DNA純度檢測第三次課結(jié)束！第二部分基因工程工具酶基因工程工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶和激酶DNA聚合酶和RNA聚合酶DNA和RNA修飾酶。一、序列特異的DNA限制性內(nèi)切核酸酶

(Restrictionendonuclease,RE）

——指能夠識別雙鏈DNA分子中特殊核苷酸序列，并使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開的核酸內(nèi)切酶。來源：原核生物種類：500多種作用：把外源DNA切割成片段。第一型（TypeI）：能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解第二型（TypeII）：只催化非甲基化的DNA的水解第三型（TypeIII）同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用限制性內(nèi)切酶的命名和書寫：HindIII細(xì)菌屬名細(xì)菌種名菌株酶編號Haemophilusinfluenzae

dRE的功能:防御外源DNA感染,利于遺傳的穩(wěn)定性RE抑制了細(xì)菌種屬間的交叉繁殖,但甲基化酶的某些誤差,又使得不同菌株間DNA的重組成為可能,利于生物的進(jìn)化.1968年,從大腸桿菌中分離到了I型RE,

1970年,從大腸桿菌中分離到了II型RERE的發(fā)現(xiàn)：3.1.1限制性核酸內(nèi)切酶作用機(jī)制OH3’P-5’5’P3’HO（1）在DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位,切割DNA分子,形成鏈的斷裂.識別序列:又叫靶子序列,是由4-8個(gè)核苷酸組成的特定核苷酸序列.

3.1.2限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列旋轉(zhuǎn)對稱或二重互補(bǔ)對稱連續(xù)的:例如：5‘…ABCC’B’A’…3’3’…A’B’C’CBA…5’間斷的:5’…ABNBA…3’

3’…A’B’N’B’A’…5’EcoRIBamHIGAATTCCTTAAGGGATCCCCTAGG（2）識別序列在DNA分子上出現(xiàn)的頻率例如：識別序列核苷酸個(gè)數(shù)出現(xiàn)識別序列的幾率41/44（1/256）61/46(1/4096)λDNA長49000bp，

BglII的識別序列為AGATCT

所以理論上在λDNA中，BglII識別序列應(yīng)該出現(xiàn)：49000/4096=12次。

實(shí)際上，僅出現(xiàn)6次。同裂酶(isoschizomer)---來源不同,但識別同樣的核苷酸靶子序列.

例如:HpaII和MspI的識別序列都為5'...C^CG

G...3'

3'...G

GC^C...5'BamHI：5'G^GATCC3‘BclI：5'T^GATCA3‘BglII：5'A^GATCT3'同尾酶(isocaudamer)----來源不同,識別的核苷酸靶子序列不同,但產(chǎn)生相同的粘性末端.例如:BamHI,BclI,BglII是一組同尾酶切割后的末端是GATC.3.1.3限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA的位點(diǎn)多數(shù)在識別序列內(nèi)部。環(huán)形DNA切割后的片段數(shù)：N線形DNA切割后的片段數(shù)：N+1DNA片段末端種類：粘性末端：磷酸二酯鍵斷裂位置是交錯的平末端：斷裂位置在對稱軸切割位點(diǎn)表示方法5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’PstI可以表示為：5’-CTGCA↓G-3’反應(yīng)總體積：20微升酶的用量緩沖液的組成與酶的種類有關(guān)反應(yīng)時(shí)間1-3小時(shí)。3.1.4限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)系統(tǒng)例：BglⅡ?qū)Ζ薉NA的消化13mL蒸餾水2mL10x緩沖液4mL底物DNA1mLRE37℃，1-3小時(shí)依次加入：混勻離心升溫，使酶失活（65℃10-15min）除去酶蛋白限制性酶切反應(yīng)一般流程底物DNA：DNA純度DNA分子構(gòu)型識別位點(diǎn)側(cè)面序列位點(diǎn)偏愛DNA甲基化

酶的用量酶的活性底物DNA：位點(diǎn)數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的組成：緩沖液系統(tǒng)MgCl2（或醋酸鎂）NaCl（或KCl）Tris-HCl?-巰基乙醇（或二硫蘇糖醇DTT）反應(yīng)溫度：大多數(shù)是37℃，少數(shù)或高或低Star活性：某些限制性核酸內(nèi)切酶在特定條件下，可以在不是原來的識別序列處切割DNA。3.1.5限制性核酸內(nèi)切酶的Star活性4二、DNA連接酶DNA連接酶能催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3’-OH和5’-P基團(tuán)末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接。如果是兩個(gè)或兩個(gè)以上不同雙鏈DNA片段末端連接，則產(chǎn)生重組DNA分子。3.2DNA連接酶缺口nick5’5’3’3’5’5’3’3’DNA連接酶5’5’3’3’DNA連接酶裂口gap5’5’3’3’nick（2）酶-AMP復(fù)合物中的AMP與DNA鏈上的5’P結(jié)合，形成DNA-腺苷酸復(fù)合物，P活躍起來（3）3’OH對活躍的P作親核攻擊，結(jié)果形成磷酸二酯鍵。（1）DNA連接酶與輔助因子ATP或NAD+反應(yīng),生成酶-腺苷酸復(fù)合物.3.2.1DNA連接酶的作用機(jī)理E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶√×√√（但效率較低）3.2.2目前常用的DNA連接酶1條DNA鏈具有3’-OH,另1條DNA鏈具有5’-P,而且3’-OH與5’-P是相鄰的.3’-OH與5’-P位于與互補(bǔ)鏈上的互補(bǔ)堿基配對的兩個(gè)脫氧核苷酸的末端.吸能反應(yīng):E.coliDNA連接酶需要NAD+，T4DNA連接酶需要ATP.3.2.3DNA連接酶作用條件缺口nick5’5’3’3’5’5’3’3’DNA連接酶5’5’3’3’DNA連接酶裂口gap5’5’3’3’——反應(yīng)溫度：37℃——酶用量：平末端1-2unit粘性末端0.1unit——ATP：10μmol/L—1mmol/L——buffer：Tris-HCl，KCl，DTT，BSADNA連接酶反應(yīng)條件具互補(bǔ)粘性末端片段之間的連接具平末端DNA片段之間的連接DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接3.2.4DNA片段之間的連接方式具互補(bǔ)粘性末端片段之間的連接具平末端DNA片段之間的連接DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接DNA片段末端同聚物加尾后進(jìn)行連接粘性末端修飾成平末端后連接DNA片段5’段磷酸化作用后連接DNA片段末端同聚物加尾后進(jìn)行連接粘性末端修飾成平末端后連接DNA片段5’端脫磷酸化作用后連接5

——催化以DNA單鏈為模板，以4種脫氧核糖核苷酸為底物，合成一條與模板序列互補(bǔ)的DNA新鏈的酶。三、DNA聚合酶DNA聚合酶包括：大腸桿菌DNA聚合酶I大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow大片段酶T4DNA聚合酶T7DNA聚合酶修飾的T4DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶耐熱性DNA聚合酶（一）耐熱性DNA聚合酶1956年，美國Kornberg從大腸桿菌中分離出來。由大腸桿菌基因polA編碼，單鏈多肽蛋白質(zhì)。分子量：109kD球形，Φ65埃（二）大腸桿菌DNA聚合酶I（E.coliDNApolI）1.DNA聚合酶I反應(yīng)需要的條件:全部4種脫氧核苷三磷酸,和Mg++.

dATPdCTPdTTPdGTP帶有3’-OH游離基團(tuán)的引物鏈.2.DNA聚合酶I催化的反應(yīng)