分子生物學試驗的常見問題與解決方案以下所有都轉自胡老師的新浪

分子生物學實驗的常見問題與解決方案以下所有都轉自胡老師的新浪博客，與大家分享。

所有文章內(nèi)容直梯在二樓

一、Southern雜交

問題1：電泳后發(fā)現(xiàn)凝膠中DNA擴散，導致結果難以確定，如何解決這一問題？

解決方案：〔1〕在操作上：電泳時隔孔上樣，電泳后要對凝膠及時處理使凝膠枯燥；〔2〕瓊脂糖的質量應該較好，尤其是不應含有內(nèi)切酶，否那么有時將使低拷貝數(shù)基因的雜交結果難以解釋。

問題2：傳統(tǒng)方法中轉膜不完全的問題如何克服？

解決方案：經(jīng)典的向上轉移法會使凝膠短時間內(nèi)變薄,此時即使延長轉移時間至24小時以上,也不能使大分子DNA良好地轉移出去,因此,轉膜不完全。向下轉膜法由于不需在吸水紙上增加重量,凝膠根本不變形；加之吸水紙的吸力與水受到的重力方向一致,故可以良好地完成DNA的轉移,它不需要特殊的儀器,轉移速度較快,轉移效率高。

利用地高辛標記探針進行Southern雜交時，對于大于15kb的DNA片斷，轉膜之前用鹽酸進行脫嘌呤可以促進轉膜效率,但脫嘌呤過度可導致分子量相對較小的DNA被打斷成過小的片段而難以和尼龍膜結合。如果實驗轉膜過程中同時含有大于15kb的DNA(通常為基因組)和小片段DNA(通常是基因組酶切產(chǎn)物)，那么在轉移的過程中傾斜容器，僅使凝膠上半局部浸泡于鹽酸，這樣既可以提高大片斷DNA的轉移效率，又不會打碎小片段DNA。

另外，等采用瓊指糖凝膠直接雜交的方法，來解決這一難題：以轉基因鼠的檢測為例，實驗步驟如下：1.轉基因鼠的建立：以鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5’調控區(qū)指導人G-CSF基因為構件，建立轉基因小鼠。轉基因小鼠的檢測采用剪取鼠尾DNA做Southern進行鑒定。2.瓊脂糖凝膠直接雜交:(l)用BanHI(150U)對由假孕鼠產(chǎn)生的仔鼠剪尾提取基因組DNA10μg酶切過液，取少量電泳檢查酶切完全后，上樣電泳8小時，(2)將電泳槽板連同凝膠置50℃放置3小時，用鑷子輕輕揭起凝膠，放于變性液(0.5MNaOH，0.5MNaCl)20分鐘，轉置中和液(0.5MTrisHCl，0.15MNaCl)20分鐘，將膠放于玻璃板上瀝干液體，室溫放置30分鐘。(3)干膠應立即雜交。先將膠在水中泡一下，以利于操作。(4)將膠放人雜交液(6×SSC、5×Denhardt’S、0.25%SDS、100μg/ml鮭魚精DNA)，加人探針，42℃雜交16-20小時。(5)雜交完成后，洗膜8輪，42℃每次15分鐘。2×SSC、0.1%SDS、1×SSC、0.1SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、各洗兩次，在冰水中浸泡2分鐘，以利于鹽的排出。(6)枯燥后按檢測試劑盒操作，室溫壓片0.5-2小時。沖片照相。使用的探針為G-CSF。DNA，探針標記采用Fluorescein-12-dUTP，檢測試劑盒為杜邦公司產(chǎn)品，操作按試劑盒說明書進行。用瓊脂糖凝膠直接雜交的方法，較好地解決了微量核酸或低拷貝數(shù)轉基因的檢測問題，結果不僅直觀，而且特異性好。與常規(guī)的Southern雜交相比，它所具有的優(yōu)勢是，它省略了將DNA進行轉膜的步驟，從而防止了因轉膜不完全所造成的DNA量的損失，特別是低拷貝數(shù)基因的喪失。另一方面，也使復雜的Southern雜交操作程序大大簡化。因此，在轉基因鼠的鑒定中以及微量核酸檢測、疾病診斷中是防止低拷貝數(shù)基因漏檢的一種可行途徑。

問題3：在向下轉膜法中，如何提高轉膜效率？

解決方案：1、轉移液的水平面應略低于凝膠的水平面。如果轉移液的水平面高于凝膠，短時間內(nèi)會有大量液體聚集在凝膠上，直接從側面流失；果轉移液的水平面過分低于凝膠，影響紗布的吸水力，轉移效率下降。2、吸水紙吸水后易變形，使吸水紙與濾紙間產(chǎn)生空隙，而降低吸水紙的吸水效率，應及時更換吸水紙。3、過夜轉移時，及時添加轉移液，防吸干。4、樣本豐度高時，移時間可以縮短至1小時，此時凝膠上仍可見大分子量DNA的殘留，當樣本豐度低時，以延長轉移時間。5、紗布上不要加蓋重物，防凝膠受壓變薄，響轉移效率。

問題4堿轉移結束后的尼龍膜潮濕不利于保存，且防止長期保存過程中DNA結合不緊密影響雜交效果，應如何做？

解決方案：將尼龍膜置于濾紙上枯燥片刻，在紫外交聯(lián)儀中將轉有DNA的一面向上12000J交聯(lián)4min，假設尼龍膜暫不雜交，可在4℃下保存?zhèn)溆玫娣艜r間不宜超過半年。

問題5使用堿轉移法，將導致雜交后探針的去除困難，幾乎80%-90%的探針難以洗脫，如何解決這一問題？

解決方案：將煮沸的5g/LSDS溶液倒在膜上,待溶液自然冷卻至室溫,可除去膜上已雜交的DNA探針。洗脫后的尼龍膜,可反復用于其他探針的雜交(至少可耐5輪雜交與洗脫)。

<BR>問題6：Southern雜交中，探針的背景高，應如何解決？

解決方案：用隨機引物法標記的探針要想得到最低的背景，在向尼龍膜上加prob-DIGEasyHyb混合物前,要用0.45μm醋酸纖維素膜過濾，勿用硝酸纖維素濾膜過濾。對每一個探針和目的片段，總是要根據(jù)經(jīng)驗確定最適宜的雜交條件，探針濃度很關鍵，如果太高，將會非特異性結合到膜上；太低，敏感性會降低。

利用地高辛標記探針進行Southern雜交時，以下2種措施可降低背景：(1)適當延長梯度洗膜的時間和提高洗膜溫度；(2)控制地高辛抗體的濃度。使用足夠量的地高辛抗體可以獲得較好的雜交信號,但過量的地高辛抗體會在膜上產(chǎn)生非特異結合斑點。

問題7：Southern雜交沒有檢測出出雜交信號的原因，如何解決？

解決方案：〔1〕目的DNA在總DNA中所占的比例，一般需要10μgDNA樣品,如果樣品中目的基因含量較高,可以按比例減少DNA用量。如果基因組中目的基因的拷貝數(shù)較低,致使常規(guī)的基因組用量不能滿足Southern雜交的需要,此時可加大基因組的用量；〔2〕探針的濃度和比活性：在雜交袋中雜交需要0.2ml/cm2的雜交液；使用圓筒狀瓶子進行雜交可以使用較小的體積，約0.1ml/cm2?！?〕轉移到濾膜上的DNA量以及探針與目的DNA間的配對：〔見問題2，3〕

二、藍白斑篩選

問題1：做藍白斑篩選只見白斑，不見藍斑，該如何做？解決方案：〔1〕做空白對照，將沒有進行重組的宿主菌直接接入含有IPTG和X-galLB瓊脂糖平板在37℃下培養(yǎng)17小時以上以便顯色。顯色后將平板置于4℃兩小時，藍色會加深。如果正常顯色，說明試劑，培養(yǎng)基及菌沒有問題，如果不能正常顯色，更換試劑重新配置培養(yǎng)基或者接入新的菌種，再次培養(yǎng)，確保空白對照結果正確?！?〕假設空白試驗結果正確，用牙簽挑取白色菌落，進行PCR擴增，同時設立陽性、陰性和空白對照。陽性對照為經(jīng)測序確認含有相同大小插入片段的重組菌落，陰性對照為經(jīng)測序確認為不含插入片段的空載質粒菌落，空白對照為不加模板的PCR體系。PCR擴增產(chǎn)物通過非變性PAGE條帶分析，確定是否重組，即PCR擴增后的反響液中參加2μl的6×上樣緩沖液，混勻，上樣至已預電泳的10％非變性PAGE加樣孔中，200V電壓電泳后，取膠至EB液中染色30min，最后在紫外燈下數(shù)碼照相。比對結果，判斷白斑是否為重組子。

問題2：做藍白斑篩選時，只見藍斑，不見白斑該如何做？解決方案：〔1〕做空白對照，將沒有進行重組的宿主菌直接接入含有IPTG和X-galLB瓊脂糖平板在37℃下培養(yǎng)17小時以上以便顯色。顯色后將平板置于4℃兩小時，藍色會加深。觀察對照的藍色是否和實驗組的顏色一樣，如果實驗組的藍色較淺，可能載體帶有插入片段，但沒有阻斷l(xiāng)acZ閱讀框?！?〕用牙簽挑取淺藍色菌落，進行PCR擴增，同時設立陽性、陰性和空白對照。陽性對照為經(jīng)測序確認含有相同大小插入片段的重組菌落，陰性對照為經(jīng)測序確認為不含插入片段的空載質粒菌落，空白對照為不加模板的PCR體系。PCR擴增產(chǎn)物通過非變性PAGE條帶分析，確定是否重組，即PCR擴增后的反響液中參加2μl的6×上樣緩沖液，混勻，上樣至已預電泳的10％非變性PAGE加樣孔中，200V電壓電泳后，取膠至EB液中染色30min，最后在紫外燈下數(shù)碼照相。比對結果，判斷淺藍色菌落是否為重組子。

三、外源基因在大腸桿菌的表達

問題1：外源基因在大腸桿菌中高效表達易形成包含體，包含體形成有利于表達產(chǎn)物的純化，但降低產(chǎn)生大量不具有生物活性的產(chǎn)物，如何降低包涵體的形成？

解決方案：〔1〕采用胰胨-磷酸鹽培養(yǎng)基能夠限制包含體的形成。〔2〕培養(yǎng)液中參加甜菜堿和山梨醇來改變滲透壓，使表達產(chǎn)物由包含體形式轉變?yōu)榛钚誀顟B(tài)，將溫度從37℃降低到25℃時誘導表達，可降低包含體的形成?！?〕選用pMBI衍生而來的載體質粒，因為其可以協(xié)同表達DnaK-DnaJ或GroEL-GroES，增加凝結蛋白的溶解度。分子伴侶折疊作用效率與細胞DnaK-DnaJ和GroEL-GroES的濃度有關，與表達蛋白的性質有關。

問題2：在lac、tac表達系統(tǒng)中IPTG用于誘導lac、tac啟動子的轉錄，但由于IPTG本身具有一定的毒性。從平安角度，對表達和制備用于醫(yī)療目的的重組蛋白并不適合。一些國家規(guī)定在生產(chǎn)人用重組蛋白質的生產(chǎn)工藝中不能使用IPTG，應如何做？

解決方案：〔1〕lac和tac啟動子的轉錄受溫度嚴緊調控：把阻遏蛋白LacI的溫度敏感突變體lacI(ts)、lacIq(ts)插入表達載體或整合到染色體后，均能使lac和tac啟動子的轉錄受到溫度嚴緊調控在較低溫度〔30℃〕時抑制，在較高溫度〔42℃〕時開放。〔2〕用乳糖替代IPTG誘導lac和tac啟動子的轉錄：乳糖在Β-半乳糖苷酶作用下生成異乳糖，異乳糖具有誘導劑的作用這一過程涉及乳糖的轉運和轉化，其效率受到多種因素的影響和制約因此乳糖誘導的有效劑量大大高于IPTG。乳糖本身作為一種碳源可以被大腸桿菌代謝利用，較多的乳糖存在也會導致菌體生理及生長特性變化。乳糖替代lPTG作為誘導劑的研究要與發(fā)酵工藝結合起來，才能顯示其良好的前景。

問題3：T7表達系統(tǒng)表達目的基因的水平是目前所有表達系統(tǒng)中最高的，但也不可防止出現(xiàn)在相對較高的本底轉錄，如果目的基因產(chǎn)物對大腸桿菌宿主有毒性，會影響細胞的生長。

解決方案：在表達系統(tǒng)中低水平表達T7溶菌酶基因：因為T7溶菌酶除了作用于大腸桿菌細胞壁上肽聚糖外，還能與T7RNA聚合酶結合抑制其轉錄的活性。目前T7溶菌酶基因都通過共轉化質拉導入表達系統(tǒng)，它能明顯降低本底轉錄，但對誘導后目的基因的表達水平無明顯影響。

問題4：為了提高外源基因的表達水平，對表達載體如何進行改良？

解決方案：(l)可誘導拷貝數(shù)的表達載體。質粒的拷貝數(shù)由培養(yǎng)條件控制，當需要增菌培養(yǎng)時，質粒的拷貝數(shù)很低，每個細胞僅1-5個拷貝，經(jīng)適當條件誘導后，載體拷貝數(shù)可達每個細胞100-500個拷貝。這種表達載體的優(yōu)點減小了載體質粒的喪失，保證質粒在大腸桿菌中的穩(wěn)定性，對外源基因的表達調控更為嚴格，有利于基因的高效表達。這里主要有兩類條件控制拷貝數(shù)的表達載體，一類是基于質粒Rl根底上的單復制起始表達載體；另一類是雙復制起始表達載體，一個復制起始來源于Co1EI，另一個來源于質粒pSC101。(2)多順反子型表達載體。這種表達載體的設計在于將第二個順反子的SD序列插入在第一個順反子的終止密碼子TAA之前，第一個順反子要盡量短，后面接目的基因的起始密碼子ATG。由于第一個順反子翻譯地有效起始，使得大量的核糖體結合在多順反子mRNA上，促進了核糖體對第二個順反子的SD序列的識別和翻譯起始，從而提高了表達水平。(3)帶翻譯增強子的表達載體。atpE基因SD序列上游的一段序列對其表達具有促進作用，它位于SD序列上游2-7bp處，這段序列在atpE基因的mRNA上核昔酸順序為UUUUAACUGAAACAAA，將其插入到其它表達載體內(nèi)構建的新型表達載體，對Β-干擾素和IL-2的表達提高了6-8倍。T7噬菌體基因10的mRNA中有一個翻譯增強子，它是一段與16sRNA的互補序列，提高了核糖體與翻譯起始區(qū)的親和力，將其插入SD序列上游或起始密碼子下游均可提高翻譯起始效率。

問題5：質粒的過度增殖以及其后目的基因的高效表達影響受體細胞的生長代謝，導致重組質粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達水平的下降。如何解決？

解決方案：將重組質粒的擴增納入可控制的軌道：〔1〕采用條件控制拷貝數(shù)的表達載體，一類是基于質粒Rl根底上的單復制起始表達載體；另一類是雙復制起始表達載體，一個復制起始來源于Co1EI，另一個來源于質粒pSC101；〔2〕將外源基因插入到大腸桿菌的染色體中chopin等報道，將分泌型IGF-I的基因，采用串連式的重復方式插入到大腸桿菌染色體的attλ位點，在不添加抗生素誘導的條件下，采用高密度發(fā)酵，IGF-I基因十分穩(wěn)定。

問題6：在分泌型異源蛋白的表達中，附加的甲硫氨酸也可能改變蛋白質的免疫性質和藥理性質，應如何去除？

解決方案：⑴在表達系統(tǒng)中共表達甲硫氨酸氨肽酶基因。⑵在別離純化后在體外用外肽酶處理。但它們都對與甲硫氨酸相鄰的氨萊酸殘基類型有一定要求，因此在使用上有一定的限制。

問題7：把所表達的目標蛋白外泌到細胞外的培養(yǎng)基中可以進一步減少蛋白水解酶的降解，也有利于別離純化。如何實現(xiàn)目標蛋白的外分泌表達？

解決方案：〔1〕與大腸桿菌本身的外泌蛋白基因融合表達；〔2〕與一些能提高細胞外膜通透性的因子融合或共表達；〔3〕改變培養(yǎng)基的成分。但方法僅對外泌分子量較小的蛋白有效，而且外泌效率一般都比擬低。

問題8：如何使外源基因高效表達？

解決方案：〔1〕表達質粒的優(yōu)化和設計：構建表達質粒時首先要考慮使目標基因的翻譯起始密碼ATG與SD序列之間的距離和堿基組成處于一個適當?shù)姆秶鷥?nèi)。核糖體結合位點序列的變化對mRNA的翻譯效率有顯著影響，具體表現(xiàn)為：SD序列UAAGGAGG的?胄室?AAGGA高3-6倍；翻譯起始密碼ATG與UAAGGAGG的最適距離是6-8個堿基長度，與AAGAA的最適距離是5-7個堿基長度；ATG與UAAGGAGG至少相隔3-4個堿基，與AAGAA至少相隔5個堿基mRNA的翻譯才能進行；ATG與SD序列之間的堿基組成為A，T堿基豐富時，mRNA翻譯效率較高。其次，盡量提高核糖體結合位點本身和附近的序列中A/T堿基的含量，降低mRNA5’端形成的“莖環(huán)〞結構的可能性，也是構建表達質粒時需要注意的事項。在必要的情況下，還可通過定點突變，PCR等技術改變個別關鍵的堿基來破壞mRNA5’端的“莖環(huán)〞結構。把目標基因設計成多順反子結構，在大腸桿菌本身的高效翻譯起始元件后加上第二個SD序列和目標基因，一起插入表達載體。這一方法通常適用于目標基因5’端序列容易形成二級結構，而又不宜改變其序列的情形下。再者，在構建表達質粒時，充分利用各個基因的結構特征和特點，注意引入翻譯增強子序列?！?〕共表達大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因：由于同義密碼子的使用頻率與細胞內(nèi)對應的tRNA的豐度有正比關系稀有密碼子對應的tRNA的豐度很低，有可能在翻譯過程中發(fā)生中止和移碼突變。可采用1.通過基因突變把稀有密碼子改變?yōu)槠渌褂妙l率高的同義密碼子；2.在表達系統(tǒng)中共表達稀有密碼子tRNA基因，以提高大腸桿菌細胞內(nèi)稀有密碼子tRNA的豐度?！?〕提高目標基因mRNA和目標基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性：利用蛋白轉運系統(tǒng)把目標蛋白最終累積在周質空間，或分泌到培養(yǎng)基中；采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌；對分子量較小的目標基因進行融合表達或串聯(lián)聚合表達；共表達能提高特定目標蛋白穩(wěn)定性的輔助因子，如分子伴侶基因；對蛋白質序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識別位點進行改造；在較低的溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件?！?〕高密度發(fā)酵和工程化宿主細胞：：大腸桿菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模制備重組蛋白質過程中不可缺少的工藝步驟。其目的是在單個菌體對目標基因的表達水平根本不變的前提下，通過單位體積的菌體數(shù)量的成倍增加來實現(xiàn)總表達量的提高。目前常用的發(fā)酵方式有：恒定培養(yǎng)、流加補料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種。工程化宿主細胞：1.構建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌是解決高密度發(fā)酵后期由于菌體的生長密度較高，培養(yǎng)基中的溶氧飽和度往往比擬低，氧氣的缺乏導致菌體生長速率降低和乙酸的累積，乙酸的存在對目標基因的高效表達有明顯的阻抑作用的根本途徑。利用透明顫菌血紅蛋白能提高大腸桿菌在貧氧條件下對氧的利用率的生物學性質，把透明顫菌血紅蛋白基因vgb導入大腸桿菌細胞內(nèi)以增加其對溶氧的寬容度。從而降低菌體產(chǎn)生乙酸所要求的溶氧飽和度閥值；用基因敲除技術缺失大腸桿菌的磷酸轉乙酰酶基因pta1和乙酸激酶基因ackA，使從丙酮酸到乙酸的合成途徑被阻斷；改變代謝流的方向，通過共轉化把枯草桿菌、釀酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因alsS，單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因pdc1和乙醇脫氫酶基因adh2導入大腸桿菌，使丙酮酸的代謝有選擇地向生成3-羥基丁酮或乙醇的方向進行。2.構建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌：rpoH基因編碼大腸桿RNA聚合酶的r32亞基，r32亞基對大腸桿菌中多種蛋白水解酶的活力有正調控作用。rpoH基因缺陷的突變株己經(jīng)被構建，研究結果說明它能明顯提高目標基因的表達水平。bbs-bio2023-07-0613:21問題比擬長，我總結出來，大家可以很清楚的看到都有哪些問題

1、Southern雜交

2、藍白斑篩選

3、外源基因在大腸桿菌的表達

4、PCR反響

5、DNA的連接反響&細菌的培養(yǎng)

6、southern雜交

7、細菌的藍白斑篩選法篩選轉化子bbs-bio2023-07-0712:591PCR反響

1.1假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶

可能原因：

〔1〕模板：①模板中含有雜蛋白質；②模板中含有Taq酶抑制劑；③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白；④在提取制備模板時喪失過多，或吸入酚，模板本身拷貝數(shù)低；⑤模板核酸變性不徹底。

對策：純化模板；配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改；如果疑心污染了抑制劑，可以使用乙醇沉淀DNA。

〔2〕酶失活

對策：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

〔3〕引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，

對策：①選定一個好的引物合成單位；②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度；③引物應高濃度小量分裝保存，防止屢次凍融或長期放冰箱冷藏局部，導致引物變質降解失效；④引物設計不合理，如引物長度不夠引物之間形成二聚體等，需重新設計引物。

〔4〕Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低那么影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

對策：調整Mg2+濃度，從1mM到3mM，間隔0.5mM進行一系列反響，確定對于每個模板和引物對的最正確鎂離子濃度。注意：對實時定量PCR，使用3mM到5mM的鎂離子濃度。

〔5〕反響體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要摸索條件，否那么容易失敗。

〔6〕物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。

對策：優(yōu)化PCR溫度，有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度。

〔7〕靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。

1.2假陽性：出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

可能原因：

〔1〕引物設計不適宜：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。

對策：需重新設計引物。

〔2〕靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：

一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。

對策：①操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。③必要時，在加標本前，反響管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。

二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽性的產(chǎn)生。

對策：可用巢式PCR方法來減輕或消除。

1.3出現(xiàn)非特異性擴增帶

PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：

〔1〕引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。〔2〕Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關?！?〕酶的質和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶那么不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。

對策：①必要時重新設計引物。②減低酶量或調換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。⑤降低Mg2+濃度。

1.4出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

可能原因：酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多。

對策：①減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

2RT-PCR反響

2.1在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有RT-PCR產(chǎn)物

可能原因：

〔1〕RNA被降解

對策：①在用來驗證完整性之前先在變性膠上分析RNA，使用良好的無污染技術別離RNA；②在將組織從動物體取出后立刻處理在100％甲酰胺中儲存RNA；③如果使用胎盤RNase抑制劑，不要加熱超過45℃或pH超過8.0，否那么抑制劑或釋放所有結合的RNase。而且，在≥0.8mMDTT時參加RNase抑制劑，一定要存在DTT。

〔2〕RNA中包含逆轉錄抑制劑

對策：通過乙醇沉淀RNA除去抑制劑。用70％〔v/v〕乙醇對RNA沉淀進行清洗。可以參加糖元〔0.25μg到0.4μg/μl〕以幫助小量樣品RNA的恢復?！材孓D錄抑制劑包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸鈉，spermidine，甲酰胺和胍鹽。〕將對照RNA同樣品混合，同對照RNA反響比擬產(chǎn)量以檢驗抑制劑。

〔3〕多糖同RNA共沉淀

對策：使用氯化鋰沉淀RNA以除去多糖。

〔4〕用于合成cDNA第一鏈合成的引物沒有很好退火

對策：①確定退火溫度以適合引物。對于隨機六聚體，建議在反響溫度保溫之前先在25℃保溫10分鐘。②對于基因特異性引物〔GSP〕，可以試一下其他GSP，或換用oligo(dT)或隨機六聚體。③確定GSP是反義序列。

〔5〕起始RNA量不夠

對策：增加RNA量。對于＜50ng的RNA樣品，可以在第一鏈cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。

〔6〕RNA模板二級結構太多

對策：①將RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性/退火。②提高逆轉錄反響溫度，對SuperScriptⅡ可以到50℃，對ThermoScript可以到65℃。注意：不要在＞60℃時使用oligo(dT)引物，選擇一個在反響溫度可以退火的GSP。對于＞1kb的RT-PCR產(chǎn)物，保持反響溫度≤65℃。不要在高于37℃時使用M-MLV。③如果不需要全長cDNA，在第一鏈反響中使用隨機引物。

〔7〕引物或模板對剩余的RNA模板敏感

對策：在PCR前用RNaseH處理。

〔8〕靶序列在分析的組織中不表達

對策：嘗試其他靶序列或組織

〔9〕PCR沒有起作用

對策：對兩步法RT-PCR，不要在PCR步驟中使用超過1/5的逆轉錄反響產(chǎn)物。

2.2污染造成假陽性

可能原因：

〔1〕樣品間的交叉污染

對策：①收集樣品的容器最好使用一次性的，如重復使用，應在使用前應于180℃的高溫下干烤6小時或更長時間；②樣品存放時要密封嚴實，以防外溢造成相互間的交叉污染；③樣品在提取過程中離心管及吸樣槍頭最好使用一次性的，以免不同實驗樣品間相互污染；④由于吸樣槍污染會導致樣品間的污染，也是一個值得注意的問題，由于操作不慎將樣品或提取物吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取時要十分小心，吸時要慢，吸取盡量一次性完成，忌屢次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染；⑤同時要注意操作時不要劇烈地搖動反響管，開蓋時也容易造成氣溶膠污染。每次實驗完畢都要及時清理實驗臺面，用0.5%次氯酸鈉消毒后再翻開紫外燈照射半小時。

〔2〕RT-PCR本身使用的試劑污染在試劑配制過程中，由于加樣槍、容器及其它溶液被污染。

對策：所有試劑都應盡量小量分裝，以減少重復加樣次數(shù)，防止污染時機，另外RT-PCR試劑應盡可能密封好分類存放。每次操作完畢后同樣要進行臺面消毒和紫外線照射消毒。

〔3〕擴增產(chǎn)物的污染，極微量的擴增產(chǎn)物污染就可造成假陽性。

對策；每次實驗完后，擴增產(chǎn)物都要及時密封后處理。設陽性對照。

〔4〕操作人員污染：只要存在少量的RNA酶就會引起RNA的降解，從而影響結果的準確性，RNA酶可存在操作人員手汗、唾液中，也可灰塵中，一旦器械、玻璃制品、塑料制品受到污染，容易造成實驗失敗。

對策；操作人員應戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。設置PCR操作專用實驗室，所用實驗用具應為專用，并合理分隔實驗室，將樣品的提取、配制RT-PCR反響液、PCR循環(huán)擴增等步驟分室進行，實驗前應將實驗室及實驗人員工作服用紫外線或臭氧消毒以破壞殘留的DNA或RNA。

2.3在無反轉錄酶的情況下，對照RNA獲得擴增結果

可能原因；

〔1〕對照RNA中含有痕量DNA。

對策：第一鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。

〔2〕有可能是引物二聚體的條帶。

2.4擴增產(chǎn)物滯留在加樣孔中

可能原因：由于模板量過高而導致PCR結果產(chǎn)生了高分子量的DNA膠狀物。

對策：將第一鏈結果至少稀釋100倍再進行二次擴增。另外，在二次PCR時使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當增高或進行熱啟動以提高特異性。bbs-bio2023-07-0812:423定量PCR

3.1無CT值〔信號〕出現(xiàn)

可能原因：

〔1〕反響循環(huán)數(shù)不夠

對策；35個循環(huán)以上，可根據(jù)實驗情況增加循環(huán)〔如至45cycles〕，但高于45個循環(huán)會增加過多的背景信號。

〔2〕測熒光信號的步驟有誤

對策：一般SG法采用72℃延伸時采集，Taqman法那么一般在退火結束時或延伸結束采集信號。

〔3〕引物或探針降解

對策：可通過PAGE電泳檢測其完整性。

〔4〕引物或探針的設計，如探針高于引物的溫度不夠，造成探針未雜交上而產(chǎn)物已延伸的情況。

對策：重新設計引物或探針

〔5〕模板量缺乏

對策；對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。

〔6〕模板降解

對策：防止樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。

3.2CT值出現(xiàn)過晚

可能原因：

〔1〕擴增效率低，反響條件不夠優(yōu)化

對策：設計更好的引物或探針；改用三步法進行反響；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。

〔2〕PCR各種反響成分的降解或加樣量的缺乏

〔3〕PCR產(chǎn)物太長

對策：一般采用80-150bp的產(chǎn)物長度。

3.3標準曲線的線性關系不佳

可能原因：

〔1〕加樣存在誤差，使得標準品不呈梯度

對策：精確操作。

〔2〕標準品出現(xiàn)降解

對策：防止標準品反復凍融，或重新制備并稀釋標準品。

〔3〕引物或探針不佳

對策：重新設計更好的引物和探針

〔4〕模板中存在抑制物，或模板濃度過高

對策：降低模板濃度或重新制備。

3.4陰性對照也出現(xiàn)明顯的起飛

可能原因：

〔1〕混合物或水被污染

對策：防止污染。

〔2〕引物二聚體的出現(xiàn)

對策：用SG法在35cycles以后陰性出現(xiàn)起飛屬正常情況，可配合熔解曲線進行分析。

〔3〕反響過程中探針的降解

對策：用PAGE電泳對探針進行檢測。

〔4〕如果使用了ROX校正，那么可能是ROX的降解所造成。

3.5熔解曲線不止一個主峰

可能原因：

〔1〕引物設計不夠優(yōu)化

對策：應防止引物二聚體和發(fā)夾結構的出現(xiàn)。

〔2〕引物濃度不佳

對策：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

〔3〕鎂離子濃度過高

對策：適當降低鎂離子濃度，或選擇更適宜的mix試劑盒。

〔4〕模板有基因組的污染

對策：RNA提取過程中防止DNA的引入，或通過引物設計防止非特異擴增。

3.6擴增效率低

可能原因：

〔1〕反響試劑中局部成分特別是熒光染料降解。

〔2〕反響條件不夠優(yōu)化

對策：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。

〔3〕反響體系中有PCR反響抑制物

對策：一般是參加模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再參加反響體系中，減少抑制物的影響。

3.7實驗重復性不好

可能原因：

〔1〕加樣不準確

對策：精確操作。

〔2〕儀器在樣品上溫度條件有差異，即溫度均一性不好。

〔3〕模板濃度低。樣品初始濃度越低，重復性越差

對策：應減少樣品的稀釋倍數(shù)。

3.8變性溫度是否適宜

大局部的雙鏈DNA在95°C就開始解鏈了，在有些情況下在90至94°C都不能很好地變性DNA。由于局部變性，參加反響的探針和引物相應的減少了，因此反響效率會下降。

3.9變性時間是否適宜

15到20秒對于變性擴增子是足夠了，然而，長一點的產(chǎn)物，可能會需要30秒，60秒的變性時間通常是不需要的。

3.10退火溫度和時間是否適宜

檢查引物和探針的Tm值，SYBRGreenI的退火時間大約20到35秒，雙標記探針通常是兩步法，退火和延伸合并為一步，時間大約是45到60秒，溫度通常在60°C，對于FRET探針退火步驟大約20到30秒。

3.11在哪一步驟采集信號

SYBRGreenI應當在72°C，此時絕大局部的DNA是雙鏈狀態(tài)，如上所述，雙標記探針通常是兩步檢測，因此信號采集應該在退火延伸的整合步驟。對于FRET檢測，數(shù)據(jù)應該在退火步驟檢測。如果對于信號采集點不確定，可以多點采集作比照。如果監(jiān)控屏幕檢測不到信號，檢查程序設定是否存在至少一個的信號采集點。

3.12是否選定了適宜的增益值

一些情況下會看到曲線超過了窗口范圍，在熒光強度100的地方成一直線。盡管大局部的數(shù)據(jù)可以用，但是減少增益，一些原始數(shù)據(jù)就不會超出范圍。有時，在第一個循環(huán)信號就跳出了窗口范圍，這是由于增益選得太高，看起來像沒有檢測到數(shù)據(jù)。如果熔解曲線分析時，開始熒光就到達了100，那么應當用低的增益重新運行，而不需要重新運行擴增反響，SYBRGreenI和FRET的樣品可以在一定程度上反復使用。

4DNA限制性內(nèi)切酶酶切反響

4.1DNA完全沒有被內(nèi)切酶切割

可能原因：

〔1〕內(nèi)切酶失活

對策：標準底物檢測酶活性。

〔2〕DNA不純，含SDS、酚、EDTA等內(nèi)切酶抑制因子。

對策：將DNA過柱純化，乙醇沉淀DNA

〔3〕條件不適〔試劑、溫度〕對策：檢查反響系統(tǒng)是否最正確。

〔4〕DNA酶切位點上的堿基被甲基化

對策：換用對DNA甲基化不敏感的同裂酶，重新將質粒DNA轉化至dcm-，dam-基因型的細菌菌株。

〔5〕DNA酶切位點上沒有甲基化〔如DpnI〕

對策：換用不同切割非甲基化位點的同裂酶消化DNA〔如San3AI代替DpnI)，重新將質粒轉至dcm+dam+菌株中擴增。

〔6〕DNA位點上存在其它修飾

對策：將DNA底物與λDAN混勻進行切割驗證。

〔7〕DNA不存在該酶識別順序

對策：換用其它的酶切割DNA或過量酶消化進行驗證。

4.2DNA切割不完全

可能原因：

〔1〕內(nèi)切酶活性下降

對策：用5-10倍過量消化。

〔2〕內(nèi)切酶稀釋不正確

對策：用酶貯藏液或反響緩沖液稀釋酶。

〔3〕DNA不純，反響條件不佳

對策：將DNA過柱純化，乙醇沉淀DNA；檢查反響系統(tǒng)是否最正確。

〔4〕內(nèi)切酶識別的DNA位點上的堿基被甲基化或存在其它修飾

對策：換用對DNA甲基化不敏感的同裂酶，重新將質粒DNA轉化至dcm-，dam-基因型的細菌菌株；將DNA底物與λDAN混勻進行切割驗證。

〔5〕局部DNA溶液粘在管壁上

對策：反響前離心數(shù)秒。

〔6〕內(nèi)切酶溶液粘度大，取樣不準

對策：將內(nèi)切酶稀釋，增大取樣體積。

〔7〕酶切后DNA粘末端退火

對策：電泳前將樣品置65℃保溫5-10分鐘，取出后置冰浴驟冷.

〔8〕由于反響溶液、溫度、強烈振蕩使內(nèi)切酶變性

對策：使用標準反響緩沖液及溫度，防止強烈振蕩。

〔9〕過度稀釋使酶活性降低

對策：適當稀釋酶液，反響液稀釋的酶不能貯藏。

〔10〕反響條件不適

對策：使用最正確反響體系。

〔11〕識別位點兩側插入了可影響酶切效率的核酸順序

對策：加大酶量5-10倍。

4.3DNA片段數(shù)目多于理論值

可能原因：

〔1〕內(nèi)切酶星狀活性

對策：檢查反響條件：甘油濃度大于12%，鹽度過低，Mn2+的存在及酶：DNA值過大均可導致星狀活性，降低酶的使用量。

〔2〕其它內(nèi)切酶污染

對策：用λDNA作底物檢查酶切結果。

〔3〕底物中含其它DNA雜質

對策：電泳檢查DNA，換用其它酶切，純化DNA片段。

4.4酶切后沒有觀察到DNA片段的存在

可能原因：

〔1〕DNA定量錯誤〔如RNA含量較高〕

對策：用RNA酶A〔無DNA酶〕100ug/ml消化DNA樣，酚抽提后沉淀溶解，定量。

〔2〕在酶切反響液中形成非特異性的沉淀

對策：在反響前透析DNA樣品或用酒精沉淀二次。

4.5內(nèi)切酶保存期內(nèi)快速失活

可能原因：

〔1〕保存溫度不適宜

對策：內(nèi)切酶貯藏在含50%甘油的貯藏液中，應在-20℃低溫保存。

〔2〕以稀釋形式保存

對策：稀釋酶液不宜長期存放，應一次使用。

〔3〕貯藏緩沖液不適當

對策：使用廠家推薦的貯藏緩沖液。

〔4〕低蛋白濃度

對策：內(nèi)切酶與500ug/ml的BSA一起保存。

4.6電泳后DNA片段的帶型彌散，不均一

可能原因：

〔1〕DNA上結合有蛋白質

對策：電泳前上樣液65℃加熱5min，并參加0.1%的SDS，酚/氯仿抽提純化。

〔2〕內(nèi)切酶中含有DNA外切酶

對策：減少酶用量或消化時間，換用新包裝的酶。

4.7酶切后的DNA片段連接效率低

可能原因：

〔1〕含磷酸鹽的濃度高

對策：透析，乙醇沉淀去除磷酸鹽

〔2〕內(nèi)切酶失活不全或含有ATP酶

對策：延長滅活時間或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA。

〔3〕平末端連接

對策：加大T4DNA連接酶的用量。

〔4〕外切酶污染

對策：減少酶用量，縮短保溫時間，酚抽提回收DNA。

〔5〕連接緩沖液不適宜

對策：重新配制連接緩沖液。bbs-bio2023-07-1512:415DNA的連接反響

5.1TA克隆連接失敗或效率低

可能原因：

〔1〕連接緩沖液活性低，ATP降解或緩沖液稀釋不當

對策：使用一次性分裝的緩沖液，防止反復凍融。提供的T4連接酶緩沖液為十倍濃度，正確稀釋。

〔2〕連接酶失活

對策：更換連接酶

〔3〕PCR產(chǎn)物中含有抑制連接的成分，導致連接失敗

對策：將PCR產(chǎn)物和連接反響對照混合，觀察是否存在抑制效應。如疑心有抑制成分存在，應重新純化PCR產(chǎn)物。

〔4〕PCR產(chǎn)物沒有3’A突出端，不能連接

對策：使用能產(chǎn)生3’A突出端的DNA聚合酶或平端PCR產(chǎn)物先通過聚合酶及dATP進行加尾反響產(chǎn)生3’A突出端，再與T載體連接。

〔5〕載體T突出端喪失，引起載體平端連接

對策：防止核酸外切酶的引入，降解T突出端。只使用無外源核酸酶的T4連接酶。

〔6〕插入片段與載體比例不理想

對策：優(yōu)化比例

5.2粘端連接考前須知

〔1〕連接反響的溫度：ＤＮＡ連接酶的最適反響溫度為３７℃，但在此溫度下，粘性末端的氫鍵結合很不穩(wěn)定，折衷方法是１２℃過夜。

〔2〕DNA的平未端和粘性末端：由于內(nèi)切酶產(chǎn)生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而連接反響中就有平未端連接和粘性末端連接。二者連接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物濃度，酶濃度選擇上是有差異的。

〔3〕堿性磷酸酶處理質粒載體：為了提高連接效率，一般采取提高ＤＮＡ的濃度，增加重組子比例。這樣就會出現(xiàn)ＤＮＡ自生連接問題，為此通常選擇對質粒載體用堿性磷酸酶處理，除去其５’末端的磷酸基，防止環(huán)化，通過接反響后形成的缺口可在轉化細胞后得以修復。

〔4〕連接反響的檢測：連接反響成功與否，最后的檢測要通過下一步實驗，轉化宿主菌，陽性克隆的篩選來確定。

〔5〕如果要檢驗連接酶和連接酶專用的緩沖液是否有效，可重新連接酶切后的λDNA。假設連接成功，那么說明有效。

5.3平端連接考前須知

〔1〕插入片斷和載體片斷的比例要高。

〔2〕連接酶要加的多點，最好用高濃度的酶。

〔3〕載體片斷要做去磷酸化處理。

〔4〕可以用15％的PEG8000來增加連接效率和減少載體自聯(lián)。

〔5〕反響體系10UL，不要太大。

〔6〕去磷酸化的步驟要根據(jù)自己酶的性質而定，一般要反響一個小時，在反響半小時后再補充酶再反響半小時。

〔7〕插入片斷和載體片斷要酶切良好。

〔8〕低溫下長時間的連接效率比室溫下短時間連接的好，平端連接需要過夜反響。建議放在四度冰箱連接兩天效率更高比14度好。

5.4用T4DNA連接酶連接后轉化失敗

可能原因：

〔1〕反響體系內(nèi)無ATP或Mg2+

對策：使用隨酶提供的buffer或向其它兼容的buffer中參加ATP。含ATP的Buffer保存超過1年，其內(nèi)ATP可能會降解，導致連接失敗。當補加ATP時，確定補加的是核糖核酸ATP，而不是脫氧核糖核酸ATP，因為后者不起作用。

〔2〕反響體系中鹽濃度過高或EDTA含量高

對策：純化DNA

〔3〕去磷酸化步驟完成后，CIP、BAP或SAP失活不徹底

對策：根據(jù)廠家推薦的方法去除去磷酸化酶。

〔4〕DNA濃度過高導致連接后產(chǎn)生的均是線性DNA

對策：保持總DNA濃度在1-10μg/ml之間。

〔5〕連接末端為單堿基突出末端

對策：使用最高至5μl高濃度連接酶16°C過夜連接。

〔6〕插入片段和質粒沒有磷酸化。注重：假設載體已經(jīng)去磷酸化了，而引物又沒有磷酸化會導致連接失敗，訂購磷酸化的引物或對引物進行磷酸化。

〔7〕參加過多的連接混合物至感受態(tài)細胞

對策：50μl感受態(tài)細胞應參加1-5μl連接混合物。

〔8〕插入片段太大，不能進行環(huán)化

對策：降低插入片段的濃度，并使用高濃度連接酶16°C過夜連接。

〔9〕連接酶失活

對策：用lambdaHindIII或其它可行的底物進行檢測。

5.5內(nèi)切酶酶切反響后，有什么因素可以導致T4DNA連接酶連接和后續(xù)的轉化失敗

可能原因：

〔1〕內(nèi)切酶酶切不充分

對策：假設酶切位點位于PCR產(chǎn)物的末端，識別位點末端側需要加至少6個保護堿基。用對照底物檢測內(nèi)切酶的活性。

〔2〕內(nèi)切酶沒有完全失活

對策：假設內(nèi)切酶不能熱失活，用酚/氯仿抽提純化DNA。

〔3〕內(nèi)切酶的星號活性消化了載體或插入片段

對策：跑膠檢測DNA，假設存在多余的條帶，減少內(nèi)切酶使用量或減短反響時間。

〔4〕DNA或內(nèi)切酶有外切酶或磷酸酶的污染，破壞了DNA末端

對策：酚/氯仿抽提純化DNA。檢查內(nèi)切酶的質量檢測資料和注重事項，假設連接QC不佳或外切酶活性高，減少內(nèi)切酶量或縮短反響時間。

5.6在應用快速連接試劑盒時，什么原因可以造成不完全連接或轉化？

可能原因：

〔1〕快速連接反響被熱失活了，快速連接緩沖液中含有PEG，熱失活后會抑制轉化。

〔2〕快速連接混合液在電擊之前沒有純化，快速連接緩沖液中含有的PEG會阻止電擊反響。

對策：應用商業(yè)化的DNA純化柱純化連接產(chǎn)物。

〔3〕過夜孵育進行連接反響。連接時間過長，快速連接緩沖液中存在的PEG就會降低轉化效率。連接反響時間超過30min，也不會獲得更好的效果。

〔4〕反響體系中鹽濃度過高，抑制了連接或轉化反響

對策：純化DNA。

〔5〕脫磷之后，所用的磷酸酶〔CIP，BAP或SAP〕沒有完全失活或去除

對策：可以按照推薦的操作來進行以去除磷酸酶或者選用熱敏磷酸酶〔NEB#M0289〕。因為熱敏磷酸酶在65℃5min即可完全失活而無需純化DNA。

6細菌的培養(yǎng)

6.1用氨芐抗性的選擇培養(yǎng)基篩選轉化細胞時，平板上沒有克隆，有一層白色的漿狀物，不均勻，像一層菌膜。

可能原因：氨芐無效或濃度過低，操作中引入雜菌；質粒沒有轉進去。

對策：重新轉化質粒，更換氨芐。

6.2工程菌的不穩(wěn)定性及其對策

工程菌穩(wěn)定與否，與重組質粒本身的分子組成、宿主細胞生理和遺傳性及環(huán)境條件等因素有關。

就質粒本身的分子結構而言，引起工程菌不穩(wěn)定常常是由于穩(wěn)定區(qū)受到影響。另外可能由于重組質粒上有重復序列，或與宿主染色體有局部同源等都會造成質粒的不穩(wěn)定。

就宿主而言，除了上述質粒中有同源序列外，還與宿主的比生長速率、宿主中重組基因〔rec系統(tǒng)〕的完整性、重組時有關基因的具體變異等都有關系。

在培養(yǎng)環(huán)境中高溫、去垢劑〔如SDS等〕、某些藥物〔如利福平〕、染料及胸腺嘧啶饑餓、紫外線輻射等都會引起質粒的喪失，因而常采取以下措施以防止或降低工程菌的不穩(wěn)定性。

〔1〕組建適宜載體

在質粒構建時，插入一段特殊的DNA片段或基因以使宿主細胞分裂時，質粒能夠較穩(wěn)定地遺傳到子代細胞中。

〔2〕選擇適當宿主

重組質粒的穩(wěn)定性在很大程度上受宿主細胞遺傳特性的影響，在選擇宿主時，必須確定其遺傳特點。相對而言重組質粒在大腸桿菌中比擬穩(wěn)定，而在枯草桿菌和酵母中較不穩(wěn)定。

〔3〕施加選擇壓力

從遺傳學來說，選擇即利用某些生長條件使得只有那些具有一定遺傳特性的細胞才能生長。在重組DNA技術中，有好幾方面利用選擇壓力，如轉化后用選擇壓力確定含有重組質粒的克隆株，而在利用克隆菌進行發(fā)酵生產(chǎn)時，經(jīng)常采取施加選擇壓力的方法消除重組質粒的不穩(wěn)定，以提高菌體純度和發(fā)酵生產(chǎn)率。①抗生素添加法②抗生素依賴變異法③營養(yǎng)缺陷法。

〔4〕控制基因過量表達

提高質粒穩(wěn)定性的目的是為了提高克隆菌的發(fā)酵生產(chǎn)率，但許多研究發(fā)現(xiàn)，外源基因表達水平越高，重組質粒往往越不穩(wěn)定，因此可采取分段培養(yǎng)法，即前期控制基因過量表達，使重組質粒穩(wěn)定遺傳，到后期通過提高質粒的拷貝、轉錄、翻譯效率使外源基因高效表達。①利用阻遏—去阻遏啟動子原理控制基因過量表達，②選擇溫度敏感型質?？刂苹蜻^量表達。

〔5〕控制培養(yǎng)條件

重組菌所處的培養(yǎng)環(huán)境條件對其質粒的穩(wěn)定性和表達效率等均具有很大的影響，當重組菌構建成功后，能否進入工業(yè)化生產(chǎn)階段，其關鍵的步驟就是篩選最適的培養(yǎng)條件，包括培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)溫度、pH值范圍，溶氧水平〔好氧菌〕，添加選擇壓力和控制基因表達，實質也是通過培養(yǎng)條件的控制實現(xiàn)的。影響培養(yǎng)條件的因素很多，能影響菌體生長的所有培養(yǎng)工藝、工程參數(shù)都會影響質粒的穩(wěn)定性，在這些工藝工程參數(shù)中，培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、菌體的比生長速率三個方面最為重要。bbs-bio2023-07-2111:091.

southern雜交時如何提高消化效果？

答：一般在消化結束時可取5μl電泳檢測消化結果。如果消化不好，可以延長消化時間，但不可超過6小時；或放大反響體積；或補充酶再消化。如仍不能奏效，可能是DNA樣品中含有太多雜質，需要先進行提純；或是酶的活力下降需要更換。

2.

Southern雜交的探針一般用什么標記？有哪些標記方法?

答：進行Southern雜交的探針一般用放射性物質標記或用地高辛標記。放射性標記靈敏度高，效果好；地高辛標記沒有半衰期，平安性好。

探針的標記方法有隨機引物法、切口平移法和末端標記法。

3.

對照實驗結果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？

答：A〕連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需4℃過夜。

B〕插入片段帶有污染，使3’-T缺失，或抑制連接，抑制轉化。插入片段需純化，或重新制備。

C〕插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發(fā)生。UV過度照射會產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。

D〕高度重復序列可能會不穩(wěn)定，在擴增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株。

4.

進行一次成功的連接實驗需要優(yōu)化哪些實驗指標？

答：進行一次成功的連接實驗需要優(yōu)化一系列實驗指標：

A〕載體和插入片段的摩爾濃度比特別重要，載體：插入片段的摩爾數(shù)的變化范圍可為8：1到1：16，但通常的變化范圍是3：1到1：3。插入片段的長度和序列的變化會影響和同一載體的連接效果。每一個連接反響都需要作實驗，來選擇最正確的載體和插入片段的摩爾數(shù)比。在最小的反響體積中，通常一個連接反響用10-50ng的載體DNA。

B〕進行連接反響時的保溫的時間和溫度也需優(yōu)化。一般而言，平末端連接在22oC保溫4-16小時，粘性末端在22oC保溫3小時，或4oC保溫16小時。大多數(shù)連接反響用T4DNA連接酶，但大腸桿菌的DNA連接酶可用于粘性末端的連接，平末端連接時用此酶，活力較低。當用pGEM載體克隆大片段時〔>7-8kbp〕，經(jīng)轉化的菌株在30oC而不是在37oC生長，更有利于連接。為提高獲得目的克隆的時機，應用盡可能高轉化效率的感受態(tài)細胞。

D〕為降低背景，提高插入片段的連接效率，載體用單一限制性內(nèi)切酶切割后，需去磷酸化。這可提高插入片段的連接效率，抑制載體自身連接。為使連接成功，載體和插入片段應純化無雜質。殘留的雜質會干擾連接酶的效果，抑制連接反響。

5.

藍白斑篩選為什么沒有白斑？

答：說明重組質粒連接效率低或是自連嚴重；也有可能是插入的目的片段太短，并且剛好和lacZ使用的是同一個閱讀框。解決方法有：控制好連接時間和溫度，防止載體自連；適當加長目的片段的長度；加大目的片段和載體的比例；重新選擇連接酶，可以使用雙酶切，但要注意連接酶不要是同尾酶；嘗試更換反響緩沖液。

6.

在藍白斑篩選中如何使顯色更加明顯？

答：做藍白篩選時，轉化，涂板37度培養(yǎng)12到16小時后，一般在4度放幾個小時，藍斑顯色更明顯。

7.

藍白斑篩選中出現(xiàn)淺藍色斑是怎么回事？

答：實際操作中發(fā)現(xiàn)當插入小片段時，重組子也有形成淺藍斑的情況。即藍色菌斑也有可能含外源基因。據(jù)最新報道，大概有30%的假陰性。

8.

對照組未導入含Amp抗性的質粒，涂布該大腸桿菌菌液，普遍都有大量菌落產(chǎn)生，這是怎么解釋？

答：對照組被污染了；或是大腸桿菌發(fā)生了突變；或是氨芐有問題；或是配制培養(yǎng)基時在培養(yǎng)基還沒冷卻時就加了氨芐，氨芐失效。

9.

影響感受態(tài)細胞轉化效率的因素及實際操作過程中應注意的事項有哪些？

答：A〕細菌的生長狀態(tài)：實驗中應密切注視細菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用對數(shù)生長期的細胞〔一般通過檢測OD600來控制。DH5α菌株OD600為0.5時細胞密度是5×107/ml〕；

B〕所有操作均應在無菌條件和冰上進行；

C〕經(jīng)CaCl2處理的細胞，在低溫條件下，一定的時間內(nèi)轉化率隨時間的推移而增加，24小時到達最高，之后轉化率再下降〔這是由于總的活菌數(shù)隨時間延長而減少造成的〕；

D〕化合物及無機離子的影響：在Ca2+的根底上聯(lián)合其他二價金屬離子〔如Mn2+或Co2+〕、DMSO或復原劑等物質處理細菌，可使轉化效率大大提高〔100-1000倍〕；

E〕所使用的器皿必須干凈。少量的去污劑或其它化學物質的存在可能大大降低細菌的轉化效率；

F〕質粒的大小及構型的影響：用于轉化的應主要是超螺旋的DNA；

G〕一定范圍內(nèi)，轉化效率與外源DNA的濃度呈正比。

10.

IPTG用于誘導lac、tac啟動子的轉錄，但其本身具有一定的毒性，假設用于醫(yī)療目的的重組蛋白并不適合。該如何解決這一問題？

答：有兩種解決方法：〔1〕把阻遏蛋白lacⅠ的溫度敏感突變株lacⅠ(ts)插入表達載體或整合到染色體后，均能使lac、tac啟動子的轉錄受到溫度嚴謹調控，在較低溫度〔30℃〕時抑制，在較高溫度〔42℃〕時開放；〔2〕用乳糖替代IPTG，但其效率受到多種因素的影響和制約，因此乳糖誘導的有效劑量大大高于IPTG。乳糖本身作為一種碳源可以被大腸桿菌代謝利用，較多的乳糖存在也會導致菌體生理及生長特性變化。乳糖代替IPTG作為誘導劑的研究要與發(fā)酵工藝結合起來，才能顯示其良好的前景。

11.

PL和PR表達載體由于菌體中沒有cI基因產(chǎn)物，PL或PR啟動子的高強度直接轉錄使其在普通大腸桿菌中相當不穩(wěn)定。如何解決這一問題?

答：方法之一是用溶源化λ噬箘體的大腸桿菌作為PL和PR啟動子表達載體的宿主菌；或是把cI857ts基因組裝在表達載體上，這樣就可以有更大的宿主菌選擇范圍。

12.T7表達系統(tǒng)中本底轉錄水平過高的問題如何解決？

答：解決這一問題的方法之一就是在表達系統(tǒng)中低水平表達T7溶菌酶基因。因為T7溶菌酶除了作用于大腸桿菌細胞壁上的肽聚糖外，還與T7RNA聚合酶結合抑制其轉錄活性。目前T7溶菌酶基因都通過共轉化質粒導入表達系統(tǒng)，它能明顯降低本底轉錄，但對誘導后目標基因的表達水平?jīng)]有明顯影響。

13.

去除附加的甲硫氨酸有什么方法？

答：在表達系統(tǒng)中共表達甲硫氨酸氨肽酶基因；別離純化后在體外用外肽酶處理。

14.

轉化的大腸桿菌為什么不長？

答：A〕檢查感受態(tài)細胞是否有問題，不管公司的也好自己做的也好，轉化連接產(chǎn)物時同時轉化一只質粒，作為對照。

B〕連接T的時候,保證連接比例沒有問題。連接時間可以適當延長，但是試劑盒的連接往往效率很高，連接時間不是大問題。

C〕轉化的細節(jié)處理：加培養(yǎng)基復蘇：搖1h的話，可以多參加一些培養(yǎng)基，此時培養(yǎng)基一定不要參加抗性！搖1h復蘇，搖速在150rpm先搖30min。

D)涂板時來回輕輕涂布，感覺大多數(shù)地方都涂到即可,不要反復用力涂布,不要把涂布環(huán)或者涂布棒燒的過熱,或者不待冷卻就涂。切記感受態(tài)細胞比擬嬌嫩。

E〕檢查一下瓊脂板是否有問題。

F〕檢查一下抗生素在配置過程中是否出錯，有沒有加錯。

15.

如何增加蛋白在大腸桿菌中的表達？

答：有以下幾種方法：〔1〕摸索不同溫度進行表達〔2〕提高誘導時間〔3〕改變基因上游構建，對目的基因進行密碼子優(yōu)化〔4〕提高質粒穩(wěn)定性〔5〕插入信號肽

16.

提高目標蛋白的穩(wěn)定性的措施有哪些？

答：主要有：〔1〕利用蛋白轉運系統(tǒng)把目標蛋白最終積累在周質空間或分泌到培養(yǎng)基中；〔2〕采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌；〔3〕對分子量較小的目標基因進行融合表達或串聯(lián)聚合表達；〔4〕共表達能提高特定目標蛋白穩(wěn)定性的輔助因子，如分子伴侶基因；〔5〕對蛋白質序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識別位點進行改造；〔6〕在較低溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件。bbs-bio2023-07-2210:011、Southern雜交

〔1〕做Southern用雜交袋還是雜交管〔瓶〕好？

答：雜交管好用，首先雜交管不用擔憂氣泡問題，而且膜可以均勻雜交，其次雜交管其實也用不了多少雜交液，只需要幾毫升，在雜交爐里旋轉就可以保證膜均勻雜交。

〔2〕細菌基因組酶切后的條帶可不可以用非變性聚丙烯酰胺凝膠來別離？然后再通過濕轉印到尼龍膜上，一般要轉印多久？

文獻上一般都是通過0.8%左右的瓊脂糖凝膠來別離的，但是通過傳統(tǒng)的毛細管法轉印到膜上比擬麻煩，瓊脂糖凝膠上的DNA能通過半干轉印儀來轉印嗎？

答：首先不一定要用非變性聚丙烯酰胺凝膠來別離：Southern雜交目的就是要知道基因組中是否有想要的基因片段，并且可能還要知道此基因片段的位置是否與預期的一樣，所以酶切基因組并雜交，其雜交條帶的大小是很重要的指標，如果采用非變性聚丙烯酰胺凝膠，雖然大多數(shù)DNA的遷移率與其大小的對數(shù)值成反比，但遷移率也受堿基組成序列的影響，以致大小完全相同的DNA遷移率相差達10%，所以非變性聚丙烯酰胺凝膠不能用來確定DNA的大小。一般采用瓊脂糖凝膠電泳。但是，如果不在意片段的大小，可以聚丙烯酰胺凝膠后采用電轉的方法。電轉的時間取決于片段的大小，凝膠空隙和外加電場的強度，可參閱電轉移的說明書。其次是轉移方法：根本上有三種：毛細管轉移最常用也很穩(wěn)定。電轉移效果不好，必須使用帶電的尼龍膜，溫度可能會過熱等等問題，經(jīng)常是時而轉不出來。真空轉移效率?擼枰瞧鰲Ｃ腹蘢撲淙宦櫸常揮刑跫那榭魷倫詈糜茫曳淺Ｎ榷ǎ笮∑味寄蘢煤芎謾?

〔3〕Southern雜交的時候用什么來做標記比擬好呢?除了放射性元素以外。

答：非放射性標記系統(tǒng)主要包括三大類：半抗原類、熒光色素類、酶類。其中半抗原類使用最為廣泛，商品化選擇最多。①半抗原類：主要有生物素(biotin)、地高辛、熒光素、二硝基苯(dinitrophenyl)、雌二醇、香豆素等，前三者使用最為廣泛，且均有商品化試劑盒選用。②熒光色素類：主要包括熒光素、異硫氰酸熒光素、香豆素、德州紅等。③酶標法：以AmershamPharmacia公司開發(fā)的ECL系統(tǒng)為代表。它是在戊二醛的作用下將辣跟過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)與寡棱苷酸探針片斷直接共價相連，此法簡化了檢測步驟，減少了非特異污染的可能。在這些系統(tǒng)中以新的熒光色素類標記物最具潛力。

非放射性系統(tǒng)的優(yōu)勢為：(1)平安、無污染、使用及后處理方便；(2)穩(wěn)定性好，標記好的探針可保存一年甚至更久，降低工作強度、批次檢測之間重復性好，為多樣本或長期檢測帶來極大方便；(3)利用幾種不同的探針標記方法，可一次對同一樣本進行多探針雜交。

非放射性標記物開展方向為靈敏度高、穩(wěn)定性好、實驗周期短、檢測方法簡單、平安。

2、細菌的藍白斑篩選法篩選轉化子〔1〕藍白斑篩選怎么都是白斑？

目的基因900bp，T載體是takara的PMD18－T，加A后與T載體連接。瓊脂平板外表涂40微升2％的X－gal和28微升5％的IPTG，16h