鹽酸小堿對大鼠肝微粒體p450同工酶和多藥耐藥基因的影響

鹽酸小堿對大鼠肝微粒體p450同工酶和多藥耐藥基因的影響

氨基cyclospoin（csa）是大多數(shù)移植手段中使用的免疫抑制劑之一。在臨床實踐中，假設鹽酸小黃堿（ber）可顯著增加csa的血藥濃度。為了闡明Ber和CsA相互作用的機制,本文研究了Ber及其與CsA合用對大鼠肝臟細胞色素P450(cytochromeP450,CYP)同工酶和多藥耐藥基因mdr1a、mdr1b的影響。1材料和方法1.1試劑:李碳酸鈉amenge-pa鹽酸小檗堿為上海天平制藥廠產(chǎn)品,批號990801;環(huán)孢素A為華北制藥集團有限責任公司生產(chǎn),批號990601;酮康唑為西安楊森制藥有限公司產(chǎn)品,批號000222565;紅霉素(erythromycin),氨基比林(aminopyrine),6-磷酸葡萄糖二鈉,6-磷酸葡萄糖脫氫酶均為Sigma公司產(chǎn)品。牛血清白蛋白(BSA)、氧化型輔酶Ⅱ(NADP)、甲醛、乙酰丙酮、甲醇等為國產(chǎn)分析純試劑。TRIZOLRNA提取試劑盒為美國Gibco公司產(chǎn)品;PCRMarker為華美生物工程公司產(chǎn)品;Titan單管逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒為瑞士Roche公司產(chǎn)品。1.2各組患者血清基纖維素鈉cmc的表達水平♂大鼠,體重130～150g,由本院實驗動物中心提供,隨機分為質(zhì)量分數(shù)為50mol·L-1羧甲基纖維素鈉(CMC)溶媒對照組、150mg·kg-1酮康唑陽性對照組、100mg·kg-1Ber組、200mg·kg-1Ber組、45mg·kg-1CsA組、100mg·kg-1Ber+CsA組、200mg·kg-1Ber+CsA組。分別灌胃給藥6、12d后處死動物,取肝臟制備微粒體和RNA。1.3微粒體制備采用鈣沉淀法制備肝臟微粒體,肝臟組織勻漿后于4℃200×g離心10min,取上清液9000×g離心20min,再取上清液與88mmol·L-1CaCl2混勻,冰浴5min,4℃27000×g離心15min,洗滌沉淀1次,微粒體以0.25mol·L-1蔗糖溶液重懸,-40℃保存?zhèn)溆谩?.4氨基比林n-脫甲基酶活性測定紅霉素N-脫甲基酶(ery-thromycinN-demethylase,ERD)活性和氨基比林N-脫甲基酶(aminopyrenceN-demethylase,ADM)活性測定用分光光度法,氨基比林和紅霉素的終濃度分別為0.4mmol·L-1、8mmol·L-1。蛋白含量測定采用Folin酚試劑法。1.5同工酶基因檢測按TRIZOLRNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA,所有引物(Tab3)均由美國Gibco公司合成。用Titan單管RT-PCR試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增反應(珠海Hema8000CDNA擴增儀)。用圖像分析儀測定電泳照片上各條帶的密度值,計算各同工酶基因與內(nèi)對照環(huán)孢素受體(cyclophilin,CYC)基因的比值。由于擴增的mdr1b基因和CYC基因大小十分接近,故分別進行擴增。1.6統(tǒng)計方法結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示,組間比較用t檢驗。2結(jié)果2.1在微粒體中隨時間的應用從Tab1可見,給藥6d后,與溶媒對照組比較,酮康唑陽性對照組可使大鼠肝微粒體ERD酶活性降低(P<0.05)。100mg·kg-1Ber組ERD酶活性雖有下降,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),當Ber劑量增至200mg·kg-1時則可明顯抑制ERD酶活性,表現(xiàn)為劑量依賴性。45mg·kg-1CsA組、100mg·kg-1Ber+CsA組、200mg·kg-1Ber+CsA組對ERD酶活性均有抑制作用,同時200mg·kg-1Ber+CsA組抑制作用高于CsA單用組(P<0.01)。給藥12d后,各用藥組肝微粒體ERD酶活性進一步降低,Ber單用時表現(xiàn)為明顯的劑量依賴性,200mg·kg-1Ber+CsA組抑制作用高于CsA單用組(P<0.01)。但是,Ber作用的時間依賴性不甚明顯,給藥12d時,100、200mg·kg-1Ber組與給藥6d組差異無顯著性(P>0.05)。2.2對adm活性的影響從Tab2可見,給藥6d時,酮康唑組、100mg·kg-1Ber和200mg·kg-1Ber單獨給藥組對大鼠肝微粒體ADM酶活性無影響(P>0.05),而45mg·kg-1CsA組、100mg·kg-1Ber+CsA組、200mg·kg-1Ber+CsA組對ADM酶活性均有抑制作用,而且200mg·kg-1Ber+CsA組抑制作用高于CsA單用組(P<0.01)。給藥12d時,酮康唑組、100mg·kg-1Ber組對ADM活性仍無影響,其余各用藥組則對ADM活性有抑制作用。從Tab2還可看出,隨著Ber給藥時間的延長和劑量的增加,對ADM活性的抑制程度亦增加(P<0.05),有明顯的時間依賴性和劑量依賴性。2.3大鼠肝臟cyp3a1/cyc、csa的比對給藥12d后,酮康唑陽性對照組可使大鼠肝臟CYP3A1/CYC的比值降低(P<0.05)。100mg·kg-1Ber組則對CYP3A1/CYC的比值無影響,其余各組CYP3A1/CYC的比值均降低(P<0.05),而且200mg·kg-1Ber+CsA組抑制作用高于CsA單用組(P<0.05)。結(jié)果見Tab4、Fig1。給藥12d后,酮康唑組可使大鼠肝臟CYP2E1/CYC的比值降低(P<0.05)。100mg·kg-1Ber組則對CYP2E1/CYC的比值無影響,其余各組CYP2E1/CYC的比值均降低(P<0.05)。結(jié)果見Tab4、Fig2。給藥12d后,各組大鼠的CYP1A1基因均未檢出,但內(nèi)對照CYC基因均可見表達。2.4mdr1b/cyc的比值對表1的影響給藥12d后,與對照組相比,酮康唑組可使大鼠肝臟mdr1a/CYC、mdr1b/CYC的比值降低(P<0.05),100mg·kg-1Ber組則對其無影響,其余各組的mdr1a/CYC、mdr1b/CYC比值均降低(P<0.05)。結(jié)果見Tab5,Fig3、4。3原因三:cyp3a的活性長期使用CsA的給藥途徑主要是口服,而CsA的口服吸收差異極大,其絕對生物利用度僅為20%～50%,大鼠用藥后的生物利用度為10%～30%。臨床可見一部分患者CsA用量雖高達8mg·kg-1·d-1,但血濃度仍達不到治療窗。CsA價格十分昂貴,利用Ber增加CsA血濃度可使移植受者服用CsA的劑量減少,而且在升高CsA血濃度的同時,Ber并不增加CsA的毒性反應。CYP3A是參與口服藥物首過效應的主要酶系,也是造成藥物間相互作用的重要原因。紅霉素脫甲基酶是一種細胞色素P450同功酶,測定此酶主要反映了CYP3A的活性。CsA是公認的CYP3A4底物,本文結(jié)果表明CsA亦是CYP3A抑制劑,這與其在臨床治療中表現(xiàn)出的自身抑制現(xiàn)象相符;Ber對ERD活性表現(xiàn)出劑量依賴性抑制,Ber與CsA合用較CsA單用對ERD活性有更強的抑制作用。在成人肝臟中CYP3A4是CYP3A亞族最主要的亞型,而在大鼠和小鼠肝臟中CYP3A亞族最主要的亞型為CYP3A1和CYP3A2。RT-PCR結(jié)果表明:Ber在較大劑量時對CYP3A1基因有明顯抑制作用,其與CsA合用較CsA單用對CYP3A1基因的表達有更強的抑制作用。上述結(jié)果提示:Ber可能是CYP3A抑制劑,抑制CYP3A的活性而減少CsA在肝臟的代謝速率,可能是Ber增加CsA血濃度的機制之一;Ber與經(jīng)CYP3A代謝的藥物合用時,尤其長時間大劑量應用可能產(chǎn)生藥物相互作用。氨基比林N-脫甲基酶主要反映了CYP1A1、2B1、2C11的活性,本研究結(jié)果表明,Ber在較大劑量時對ADM活性有明顯抑制作用,而Ber與CsA合用組尤其顯著。各組RT-PCR分析卻未能檢出CYP1A1基因的表達。生理條件下CYP1A1基因含量極少,而Ber、CsA乃酶抑制劑,故各組CYP1A1基因難于檢出,此結(jié)果與文獻報道一致。CYP2E1代謝底物達70多種,其中大部分為前致癌物和前毒物,小部分為臨床藥物,如氯唑沙宗、乙醇、茶堿、氨苯砜等。人和動物的CYP2E1活性十分近似,迄今發(fā)現(xiàn)所有CYP2E1的底物在人和動物中都是相同的。RT-PCR結(jié)果提示:Ber、CsA單用和兩藥合用均可抑制大鼠肝臟CYP2E1基因的表達。Ber抑制CYP2E1基因的臨床意義有待進一步研究。人MDR1基因的產(chǎn)物是P-糖蛋白(P-glycoprotein),其過量表達與腫瘤細胞的多藥耐藥性有關。P-糖蛋白同時存在于CYP3A大量表達的細胞內(nèi)如腸細胞和肝細胞,它可減少藥物在腸道的吸收,也可通過肝細胞膜增加藥物的消除。CYP3A的底物或調(diào)控劑與P-糖蛋白底物或調(diào)控劑常常是共享的,如CYP3A的底物鈣通道阻斷劑、抗真菌藥、免疫抑制藥等亦可與P-糖蛋白發(fā)生作用,影響CYP3A4的因素也能影響P-糖蛋白的表達,但P-糖蛋白在藥物代謝與相互作用中的地位研究尚少。與人類不同,大鼠具有兩個編碼P-糖蛋白的基因,分別是mdr1a和mdr1b,它們共同發(fā)揮著人MDR1同樣的功能。本研究表明,Ber在較